Summary
在这里,我们描述了一个快速可靠和简单的程序来确定的最低温度时大鼠或小鼠显示nocifensive的的行为,
Abstract
痛性糖尿病神经病变(PDN)的特点是由伤害性刺激的敏感性增加, 即痛觉过敏 ,正常无害的刺激,过敏和异常性疼痛即 。痛觉过敏和异常性疼痛研究已经在许多不同的啮齿动物模型的糖尿病2。然而,由于Bölcskei 等 ,在动物模型中的“ 痛苦 ”的决心表示挑战,由于其主观性质3。此外,使用传统的方法来确定有害的热刺激的行为反应通常缺乏重复性和药物敏感性3。例如,采用热板法Ankier 4,退缩,撤回和/或任何后肢和/或前爪子舔量化为恒高(52-55℃)热刺激反射潜伏期。然而,热刺激痛觉过敏的动物不再现重新显示的差异柔性延迟使用这些超阈值温度3,5。由于最近Bölcskei 等6所述的方法,这里所描述的程序允许的决心,在小鼠和大鼠的热痛觉阈值的快速,灵敏,重现性好(TNTS)。该方法使用缓慢增加热刺激,主要应用于小鼠/大鼠足底表面的皮肤。方法是抗-痛觉特别敏感,学习期间如痛觉过敏状态的PDN。娄的程序的基础上详细公布的,由Almási 等 5和Bölcskei 等 3。这里所描述的程序,已批准的实验动物护理和使用委员会(LACUC),莱特州立大学。
Protocol
小鼠和大鼠的TNTs之决心通过增量热板镇痛米iHPAM,公司生命科学印地安人条约理事会(伍德兰希尔斯,CA)]。该设备由几个部分组成:加热系统下方和有机玻璃观察室以上的铝板(10×20厘米);热控制单元,数据采集软件(印地安人条约理事会第#软系列8),PC(个人计算机)和脚踏板,遥控启动,停止或重置控制的单位。供热系统还允许开始/停止/手动重新加热过程中,通过在设备前面的键盘。可以设置不同的加热速率,待机/截止温度的iHPAM。
1。设备设置
- 试验前的动物,在视觉上的单位进行检查,以证实所选择的加热速率( 例如 ,6°C /分钟),初始待机状态,并最终切断的温度( 例如 28°C和55°C时,分别)。
- 检查所有连接。保持结果的电子副本,单位必须连接到计算机上运行的软件系列8。另外,可以打印出硬拷贝结果通过串口单位。
- 测试设备。按下脚踏开关一次,以确保软件系列8条记录的数据:初始待命,最后截止温度和在需要达到的温度切断秒的时间。
- 为进一步控制测试,在实验中所涉及的调查可能需要体验到自己的设备。撤回的手,从金属板,在感知疼痛的时刻(46-48℃),既不能造成伤害皮肤,也不产生任何后不适。
- 一旦单位已经成立,并从步骤1.3和1.4的记录结果,他们可以进行比较。这是有助于发现潜在的问题,可以使用单位无效。例如,初始待机/晋级决赛小康坦佩之间的差异ratures和本单位的实际阅读,和/或由单位和实际的板手撤离所需的温度显示温度之间的差异。
2。正常动物测试
无论是年轻或成年Wistar大鼠[产后(P)年龄21-25天,或任何遗传背景或性别的老鼠(P21-25)可以使用。在我们的实验中使用的小鼠的应变C57BL/6J小鼠。
- 前一天晚上进行的实验,放在笼子上的iHPAM放在替补驯化的动物。两个小时之前进行测试,开启了iHPAM熟悉本单位的背景噪音的动物。在这一点上,可以设立iHPAM和测试,以验证正确的功能( 参见步骤1)。整个测试过程中提供的食物和水自由采食 ,除了当动物在观察室( 见步骤2.1)。
注意:这是小鬼ortant不认为在行为实验的实验室条件下,默认情况下,控制。特别应注意遗传和环境因素可能影响行为研究的结果( 审查7)。 - 轻轻地放在正常小鼠/大鼠在有机玻璃观察室,对本单位的加热板的顶部。让动物驯化到温暖的表面(在28°C),直到动物显示了一个舒适的行为。
注:在此条件下,正常成年大鼠显示了初步的探索行为,对偶尔站在观察室的盖子,而嗅探。几分钟后,老鼠可能显示休闲较量梳理和宽松的行为。有时,老鼠奠定了一个宽松的身体姿势(容易扩展),而随便嗅闻环境。正常小鼠通常比老鼠更活跃。然而,小鼠显示几分钟后,宽松的探索行为,我n的观察室。观察要么逃逸行为( 例如 ,跳跃,试图逃跑,从观察室)或防守的态度( 例如 ,尖叫),这是罕见的。同样重要的是要注意的小鼠可以沟通的痛苦从一个鼠标到另一个8。因此,它可能是重要的试验鼠放置在单独的笼子里。 - 地方反映,在观察室的后面,允许在各个角度的意见。拿着数码摄像机三脚架可能的帮助,以确定确切的时刻,在nocifensive(避免痛苦)的行为发生。
- 一旦该动物是在观察了板腔热舒适按脚踏开关。当加热板温度6°C /分钟的速度,正常的动物表现出nocifensive的行为,涉及任后,爪子*通常温度从46到48℃3,5,9,10肆虐。因此,动物是典型的去除形式observ约3分钟后ATION室。
注:观察大鼠或小鼠,即典型的nocifensive响应,后肢舔爪子,而晃动和/或解除,终止的热刺激是不够的。这是通过按下脚踏板。此时,该软件记录板的温度和板立即冷却下来,直到达到待机温度(28℃)(0.5分)。此温度即一个唤起任何nocifensive的反应被视为有害的热量阈值(TNT),正常(对照组)的动物。
*有时,特别是在小鼠,nocifensive行为有害的温度可能先被发现在一个或两个前爪( 例如 ,舔而坐),几秒钟前后腿的爪子。然而,前爪子舔是一个正常的修饰行为的组成部分。因此,只有后腿爪子的反应进行评估。小鼠中的场合可能新郎以及他们的后腿的爪子。然而,正常的疏导做N加时赛最后几秒钟,不涉及密集舔,清洗后它的爪子通常结束。 - 轻轻地从板的动物,并放置在其各自的笼子里。其他控制动物(正常),然后重复的热量阈值测量。
注:TNTs之可以在单一的动物,每隔1-2分钟确定没有从动物观察室。在大鼠或小鼠TNT决定,可反复几次,在数天。这是特别有用的动物个体的平均TNT炸药以及其随着年龄的变化来确定。 - 控制动物TNT表示为三个或更多的阈值±标准差的平均值。
- 获得的数据进行统计分析,比较不同的治疗组小鼠或大鼠。正态分布数据,可以适当地使用参数的程序,包括方差分析和治疗组HOMOskedastic;当这些条件都得到满足下列方法可应用于。纽曼两两比较测试,以检测即多次测量的差异,重复/个人未经处理或在不同时间点( 例如,在图3中的数据)TNTs之方差分析。配对的t检验可用于比较药物治疗前与后两个组数据, 即 TNTs之; 配对 t-测试可用于确定在TNT变化的差异,药物治疗与车辆处理的动物( 如在图4中的数据)。
3。糖尿病动物测试
菌素(STZ)诱导的糖尿病大鼠是最常用的动物模型研究的PDN的机制,并评估镇痛药物和疗法11,12。大鼠由单一的腹腔剂量(60毫克/公斤),可以对STZ b糖尿病é热痛觉测试在糖尿病发病11后的第三周。重要的是要注意,并非所有的糖尿病大鼠发展的PDN。然而,动物,发展痛觉过敏(50%),可以很容易地确定。事实上,他们的TNTs之都低于正常*。
*要确定TNTs之STZ糖尿病大鼠,起板温度15°C而不是28°C时使用。这些变化的原因是,大多数糖尿病动物与PDN的预期是痛觉过敏2,11。因此,他们将不得不比正常热痛阈值低( 例如,<45°)。
- 一名患糖尿病的老鼠被放置在测试仪器上的观察室。动物被驯化的板面,直到动物显示了一个舒适的行为。
注:通常情况下,糖尿病大鼠不显示大部分正常行为。糖尿病大鼠通常机能减退,无精打采,常常表现出限制运动和疏导缓慢。这是罕见的,以观察对观察室的盖子榜上。几分钟后,糖尿病大鼠可能冷静留在室的一个角落里,与周围的休闲嗅探。 - 一旦糖尿病的动物是在观察室的舒适,板被加热步骤2.3可能会出现糖尿病大鼠nocifensive的行为,涉及任后/前爪子。这通常发生在非有害板温度( 例如 ,<45℃),或室与6°C / min的温度升高不超过5分钟后。
注:一个年轻的成年糖尿病大鼠nocifensive反应不正常大鼠有所不同。然而,唤起这种行为的最低温度显着降低。 - 见步骤2.4
- 以上三个实验当天的阈值的平均值表示是°C±SEM被视为有害的diabeti的热量阈值Ç动物。
注:一个类似的范例解释为正常或糖尿病大鼠可以遵循确定的热反nocifensive热阈值的止痛效果。
4。测试镇痛
药物的抗伤害性的属性( 如止痛药),以及最低有效剂量的药物,如参数的测定,可以很容易地获得通过上述步骤解释。据预测,适当管理,以大鼠/小鼠的镇痛剂量会显着增加其TNTs之。这是在动物与3热痛觉特别敏感。然而,为了避免在解释结果的偏见,研究者在观察动物的行为所涉及的必须不知道或知道如果动物已处理或不。此外,被观察者的注射药物,可准备另一个研究者和标记A,B,等剂量提供打印输出,列出每个人剂量确定的动物。
根据被测试的药物,不同剂量的一个潜在的镇痛可管理的正常或糖尿病动物5-15分钟前行为测试。必须包含适当的控制( 即注射用车辆的年龄相匹配的动物和/或无PDN的糖尿病大鼠)和测试使用相同的条件下( 例如,同一起跑线板的温度)。慢性影响的药物,以及可测试。
5。代表结果
板温度最低的唤起任青年非正常治疗的大鼠或小鼠后肢爪子nocifensive反应,确定以下步骤2-1到2-6。正如图1所示,正常的年轻成年大鼠和小鼠TNT分别为47.2±0.2°C和47.5±0.5°C,分别。
我们有OBSErved既不显着的日变化,个人TNTs之( 图2A),也不在同年龄的人( 图2B)TNTs之显着变化。 TNT炸药,由于性别的差异并没有观察到( 未显示 )。
年轻的成年STZ糖尿病大鼠的TNTs之以类似的方式确定为正常大鼠(步骤3.1至3.3)。然而,起板的温度设定为15°C取代28°C。 STZ糖尿病大鼠nocifensive行为进行了评估,个人和11天注射STZ后开始每天时尚至少三次。正如图3所示,TNT STZ糖尿病大鼠(P <0.01)显着下降,成为明显的两个星期后注射STZ。 STZ糖尿病大鼠的平均TNT炸药为45.6±0.1°C组(n = 16 14-23天的集中值)。
糖尿病大鼠参展显着低于诺玛TNT炸药L者认为有PDN的。这些老鼠被用来测试急性镇痛抗伤害性物业(化合物A)。确定一个化合物或单独测试前5分钟车单剂量注射的正常和糖尿病大鼠TNTs之。 如图4所示,单个化合物的剂量腹腔内显着增加糖尿病大鼠TNTs之时相比,与车辆单独治疗组(45.6°C 与 47.6°C,分别)。的化合物A的反nocifensive效果中也观察到正常大鼠;虽然显着(P <0.01),这是不太明显(47.4°C 与 48.0°C,分别)。
图1。 TNTs之正常年轻的成年大鼠或小鼠的测定:年轻的成年大鼠(P21-24)或小鼠(P20-21)TNTs之在iHPAM测试步骤ABOVE。共有12只和25只小鼠进行了测试。在数天,并进行测量结果进行了汇总。结果以平均值±标准差表示。记录在这些老鼠的TNT炸药的最低和最高值分别为46.2°C和48.6°C分别。在对小鼠的情况下,最大和最小TNT值分别为48.8°C和44.9°C,分别。
图2。年龄依赖大鼠和小鼠的TNTs之:一)绘制四个正常大鼠(N = 4),21天的年龄确定在5天,每天至少三次TNTs之二)TNTs之同窝小鼠的决定表示一次。年龄。每个测定点上的数字代表使用的窝数。
图3。糖尿病大鼠成为痛觉过敏3糖尿病发病后的EKS:6组(n = 6)年龄匹配的年轻成人STZ糖尿病大鼠TNTs之测定糖尿病诱导后11天开始每一天。显示每天的TNT炸药的平均值(平均值±标准差)。在正常范围内(红线)之间的11-13天注射STZ后确定的糖尿病TNTs之。两周后,STZ注射TNTs之则显着下跌至45.1±0.4℃(P <0.05)。
图4。急性反nocifensive效果的化合物B STZ糖尿病大鼠。年轻的成年正常大鼠(蓝组 ,n = 12)和年龄匹配在iHPAM测试车辆后腹腔注射STZ糖尿病痛过敏大鼠(绿组 ,n = 6) (暗杠)或化合物(光棒)。平均每个治疗(车辆控制或化合物A处理)TNT±标准差显示。星号表示统计差异(P <0.05)。
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Discussion
同样经典热板测试,以量化的热痛觉过敏4,13,这里描述痛觉检测允许快速和可靠的方法来量化nocifensive在大鼠和小鼠的行为。然而,相反的经典试验,热板的增量方法非侵入性的,几乎无压力。虽然一些限制是有必要进行测试( 即动物的,必须是在观察室),大鼠或小鼠习惯于类似的地区( 例如 ,房屋笼)。
所描述的条件下,正常的年轻成年大鼠和小鼠出现在周围温度47°C。nocifensive行为虽然这些阈值略高于3,5,13其他研究者报道的高,我们的研究结果,在协议热痛觉阈值46-48°C间观察,在人类14 15猴子和其他动物模型10。在分化可在我们的研究和出版3,5,13 CES TNTs之用动物的年龄有关。事实上,年轻的成年大鼠热痛觉阈值高于大鼠那些4周龄或旧的16。
总之,上述步骤后,增量热板镇痛米,可重现的方式正常/糖尿病大鼠或小鼠的热痛觉阈值测定。此外,止痛药,尤其是过敏大鼠的管理后,可以增加在TNT的统计检测。这种方法可能是有用的筛选最小应力条件下潜在的止痛药在小鼠和大鼠。
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Disclosures
我们已决定不披露身份在这些实验中使用的镇痛。这里显示的结果的一部分已经在71 届科学会议的美国糖尿病协会(圣迭戈加利福尼亚州)和糖尿病研究(葡萄牙里斯本) 第 47 届欧洲协会的年度会议。
Acknowledgments
这项工作是由美国糖尿病协会(ADA),格兰特JF1-10-14(MDiF)。我们要感谢在华盛顿州立大学的实验室动物资源的人员。作者感谢援助尼尔·佩顿,博士从数据统计分析
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Incremental Hot-Plate Analgesia Meter | IITC Inc. Life Science | Part #PE34 | |
Soft Series 8 | IITC Inc. Life Science | Part # Series8 | |
Streptozotocin | Calbiochem | 572201 |
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