Summary
세포 prion 단백질의 새로운 종 (PRP
Abstract
prion 질환의 pathogenesis에 중심 이벤트가 병원성 이소 형 PRP SC 하나에 호스트 인코딩 세포 prion 단백질 PRP C의 전환을 포함한다. PRP SC는 세제 - 불용성 응집체를 형성하고 PK 2-6로 부분적으로 강한 반면 PRP C는 세제 - 용해와 proteinase K (PK) - 소화에 민감합니다. PRP SC에 PRP C의 변환은 단백질의 β-시트 구조로 α-나선형의 conformational 변화를 포함하는 것으로 알려져 있습니다. 그러나, 생체 경로에있는이 아직 제대로 이해된다. 임시 내생 PRP SC, 중급 PRP * 또는 "자동 prion"는 감염되지 않은 뇌 7에서 확인되지 않았습니다.
biophysical 및 생화학 방법의 조합을 사용하여, 우리는 감염되지 않은 포유류의 두뇌와 neuronal 양식에서 불용성 PRP C 집계를 (지정 iPrP C) 확인세포 8, 9. 여기, 우리는 세제 버퍼, 자당 단계 기울기 침강, 크기 제외 크로마토 그래피, 특히 구조적으로 변경 PRP 양식 10, PK-치료에 바인딩 유전자 5 단백질 (g5p)로 iPrP 농축에 ultracentrifugation을 포함한 이러한 방법에 대한 자세한 절차를 설명합니다. 이러한 접근 방식의 조합은 불용성 PRP SC와 PRP C 합산뿐만 아니라 정상적인 인간의 뇌에서 용해 PRP C의 oligomers뿐만 아니라를 분리합니다. 프로토콜은 감염된 두뇌와 감염되지 않은 뇌의 iPrP C에서 PRP SC를 모두 분리하는 데 사용되었습니다 여기에 설명 된 이후, 사람들은 물리 기능, neurotoxicity, 두 isoforms 사이의 감염의 차이를 비교 할 수있는 기회를 제공. 이러한 연구는 크게 전염성 proteinaceous 병원균의 우리의 이해를 향상됩니다. iPrP C의 생리학과 pathophysiology는 현재 불분명합니다. 특히, 새로 이드entified 인간 prion 질환은 단백 분해 효소에 민감한 prionopathy variably이라고한다, 우리는 iPrP C 11, 12과 immunoreactive 행동과 분열을 공유하는 PRP SC를 발견했다. 또한, 우리는 최근 iPrP C는 알츠하이머 병 13 아밀로이드-β 단백질과 상호 작용의 주요 수종입니다 보여 주었다. 같은 연구에서,이 방법은 다른 neurodegenerative 장애에 관여하지 않는 prion 단백질 응집체에 자신의 응용 프로그램을 제안, 알츠하이머 병 13 Abeta 집계 및 oligomers를 분리하는 데 사용되었습니다.
Protocol
1. 뇌 Homogenate 및 세제 용해 (S2)과 불용성 (P2) 분수의 작성
- 100 MG 냉동 인간의 뇌 조직을 타고 (10 MM 트리스, 150 MM NaCl, 0.5 % Nonidet P-40 (NP-40), 0.5 % EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 산도 7.4) 100 μl 용해 버퍼를 추가합니다.
- 무선 모터에 의해 구동 유봉을 사용하여 얼음에 균질화,이 중 20 5 분에 드라이 아이스에 고정하고 모터에 의해 먼저하고 손에 의해 구동 유봉을 사용하여 다시 균질화, 300 μl 또는 800 μl 용해 버퍼를 (추가 % 또는 10 % 총 뇌 homogenate, 각각).
- 4에 10 분 ° C가 benchtop 원심 분리기를 사용하여 표면에 뜨는 (S1)를 수집하는 1,000 XG에서 20 % 또는 10 % 총 뇌 homogenate를 원심 분리기.
- 4 ° C.에 1 시간에 SW55 로터의 35,000 RPM (100,000 XG) (Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀 베는 날, 풀러 턴, CA)에서 10 % S1을 Ultracentrifuge 깨끗한 튜브에 세제 - 수용성 일부를 포함 supernatants을 (S2) 전송합니다. 세제 - 불용성 포함 된 알약을 Resuspend5 배 농축 준비 - 100 μl 또는 10을 200 μl 용해 버퍼 분율 (P2).
- PK - 소화를 들어, S2 및 P2 분수 모두 1 시간에 37 ° C에서 50 μg / ML에서 PK의 동일한 양으로 샘플을 품다. 5 mm와 PK의 소화를 종료 할 SDS 샘플 버퍼 (3 % SDS, 2 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 4 %의 β-메르 캅토 에탄올, 10 % 글리세롤, 50 MM 트리스, 산도 6.8)의 동일한 볼륨의 최종 농도에 phenylmethylsulfonyl 불소를 추가합니다. 10 분의 샘플을 삶아하고 5 분 동안 실온에서 그들을 냉각. 그들은 서양이 blotting에 대한 준비가되어 있습니다.
2. 자당의 단계 기울기의 속도 침강
- 얼음에 30 분을위한 H 2 O 2 %의 sarkosyl의 동일한 볼륨으로 450 μl 20 % S1을 품다.
- 0.5 ML 60 % 각각, 30 %, 25 %, 20 %, 15 %, 및 최대 5 ML 용량 Beckman 튜브에 10 %의 자당을 추가합니다.
- 10-60%의 자당의 단계 그라디언트의 상단에 S1의 0.4 ML를로드합니다.
- 4에 원심 분리기4 번 1 시간에 8,000 RPM (200,000 XG, SW55 로터), ° C.
- 각 관의 상단에서 283 μl 일부를 수집하여 총 12 분수를 구하십시오.
- 새로운 Eppendorf 튜브에 각 분획의 20 μl을 타고 10 분에 20 μl 샘플 버퍼, 그리고 종기를 추가 할 수 있습니다.
- 동네에서 4 분을위한 멋진 샘플, 1 분, 소용돌이를 1,000 XG에 원심 분리기. 미리 캐스트 젤에 샘플을로드합니다.
3. 크기 제외 크로마토 그래피
- PRP 분자의 oligomeric 상태를 결정하기 위해 1 개 30cm 항목의 Superdex 200 HR의 구슬을 (Pharmacia, 웁살라, 스웨덴)을 사용합니다.
- 알부민 Dextran 블루 (2,000 kDa), thyroglobulin (669 kDa), apoferritin (443 kDa), β-아밀라아제 (200 kDa), 알코올 탈수소 효소 (150 kDa)를 포함 세븐 분자 질량 마커 (시그마, 세인트 루이스, MI) ( 66 kDa) 및 탄소 anhydrase (29 kDa)는 200 μl 샘플 볼륨에 시그마에서 권장하는 농도에 독립적으로로드됩니다.
- 푸른 dext의 용출 볼륨실행은 제품 지침에 의해 제공되는 공극 부피 (V 0 = 8.45 ML)과 총 부피 (V t = 24 ML)를 결정하는 데 사용됩니다. 피크 용출 볼륨 (V 전자)은 크로마토 그램 및 부분 retentions에서 계산됩니다. - / (V t - V 0) K AV = (V 0 V E) : K AV, 파티션 계수는 (샘플 동작을 정의) 방정식을 사용하여 계산됩니다. 보정 곡선은 표준 8 로그 MW에 대한 단백질 표준의 K AV를 모의에 의해 결정됩니다.
- 다른 FPLC 분수에서 가져온 다양한 PRP 종의 분자량 (MW)은 다양한 표준의 겔 여과로 생성 교정 곡선에 따라 평가됩니다.
- 각 실행에 대한 칼럼으로 1 % sarkosyl을 포함 용해 버퍼에 200 μl S1를 삽입.
- 크로마토 그래피는 0.25 ML / 분, 분수의 유량에 FPLC 시스템 (GE 헬스 케어)에 수행됩니다S 0.25 ML의 각 분획 수집기를 (Amersham Biosciences, RediFrac)를 사용하여 수집하고 있습니다.
- 2 시간에 -20 ° C에서 0.5 ML 사전 차가운 메탄올과 0.125 ML 각 일부를 품다.
- 4에 30 분 ° C benchtop microcentrifuge에 대한 13,000 XG에서 샘플을 원심 분리기. 표면에 뜨는을 취소하고 실내 온도에 시원한 10 분에 대한 끓고 위에서 언급 한 것처럼 20 μl SDS 샘플 버퍼에 펠렛을 resuspend, 사전 캐스트 젤에 그들을로드합니다.
4. g5p에서 PRP의 캡처
- g5p 분자 (100 μg (주) 주시기 포츠머스, 영국의 대학에서 Drs. 제프 Kneale와 요한이 McGeehan 제공) 7 복합입니다 X 10 8 tosyl 1 ML에 100 μg의 g5p 350 μl g5p 비즈를 잠복기가 자기 구슬을 활성화 20 시간에 37 ° C에서의 인산염 버퍼 생리 (PBS). 외부 자기 힘으로 Eppendorf 튜브의 측벽에 g5p - 구슬을 유치하고 모든 솔루션을 제거합니다. PBS 1 ML 포함하는으로 구슬을 씻으십시오0.1 % 소 세 번이나 (BSA) 혈청 알부민.
- 비 특정 바인딩을 차단하는 5 시간에 0.2 M 트리스 - HCL, 37에서 0.1 % BSA를 포함하는 산도 7.4 ° C의 1 ML에 g5p - 복합 구슬을 배양 한 후 PBS 1 ML은에 0.1 % BSA를 포함하는으로 구슬을 씻어 세 번 위에서 언급 한. 솔루션을 제거하고 구슬로 PBS 1 ML를 추가합니다. 준비된 g5p 비즈는 4 ° C.에서 최소한 3 개월 동안 안정적
- g5p의 PRP의 캡처 바인딩 버퍼 1 ML 60 μl g5p 복합 구슬 (10 μg 단백질 / 6 X 10 7 구슬) (3 % 십대 초반 - 20, 3 % NP-100 μl S1 분수 또는 P2를 잠복기에 의해 수행된다 PBS, 산도 7.5 40).
- 상온에서 3 시간에 대한 지속적인 회전 부화 후, PRP - 포함 g5p 비즈는 솔루션의 모든 언 바운드 분자 쉽게 제거 수, 외부 자기 힘으로 Eppendorf 튜브의 측벽에 매료됩니다.
- 세탁 버퍼에 세 세차 (2 % 십대 초반 - 20 PBS의 2% NP-40, pH를 7에 따라0.5), g5p 비즈는 95에서 수집하고 가열 된 SDS 샘플 버퍼에 5 분 (3 % SDS, 2 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 10 % 글리세롤, 50 MM 트리스 - HCL, pH를 6.8)에 대한 ° C.
- 상온에서 5 분 동안 샘플을 냉각 한 후, 샘플은 실온에서 5 분 1,000 XG에서 centrifuged 있습니다. supernatants 서양이 blotting에 대한 준비가되어 있습니다.
5. Blotting 서양
- 로드 샘플 ~ 80 분 150 V 15 % 트리스 - HCL 기준 사전 주조 젤 (바이오 RAD)에 SDS 샘플 버퍼에 끓여.
- 젤의 단백질은 70V에서 2 시간에 PVDF으로 전송됩니다.
- 5 %의 우유에서 세포막을 차단 한 후 트리스 버퍼 생리 0.01 %를 포함하는 십대 초반 - 20 (TBS-T)는 멤브레인은 1E4 (1, 기본 단클론 또는 polyclonal 항체 3F4 (1:40,000)로 실온에서 2 시간에 incubated 아르 : 1,000), 안티-N 8 (1:6,000), 또는 안티-C PRP 분자를 프로빙을위한 8 (1:6,000).
- 에 HRP-복합 양 안티 - 마우스 IgG와 부화에 따라1:3000, 또는 당나귀 반 토끼 IgG는 1:3,000에서 PRP 밴드는 제조업체의 프로토콜에 따라, ECL 플러스를 사용하는 코닥 필름에 시각화 수 있습니다.
6. 대표 결과
PRP C의 대부분 S2 분율 (그림 1)에서 발견되었습니다 있지만 산발적 CJD 샘플에 비해 iPrP C의 작은 금액은 정상적인 뇌에 P2 분수에 감지되었습니다. 전체 길이와 N-말기립니다 종을 포함한 총 PRP의 약 5~25% 이전에 8 iPrP 계정 지적 있습니다.
자당 단계 기울기 침강을 사용하여 분석이 아닌 CJD 뇌에서 PRP C의 대부분은 1-3 상단 분수에서 발견되었습니다 동안, PRP 소량도 일반적으로 대형 집계 할 8 (그림 포함 된 바닥 분수 9-11에서 발견 된 것으로 밝혀 2).
PRP SC 종의 다양한 울렸다단량체의 ING는 큰 집계에 작은 oligomers는 Creutzfeldt-야콥 병 (그림 3A)와 뇌 겔 여과에 의해 분리되었다. 그러나, 2000 kDa보다 분자량 더있는 큰 응집체의 작은 금액도 일반 뇌의 불용성 분수 (그림 3C)에 감지되었습니다. 또한, dimers 및 PRP C의 tetramers은 불용성 분수에서뿐만 아니라 가용성 분수 (그림 3B 및 3C)에 감지되지 않았습니다.
PK와 PNGase 치료 후 g5p에서 수집 한 PRP는 PrP97-105 8에 대한 1E4 항체를 감지되었습니다. 세 PK 방지 핵심 조각이라고한다 PRP * 20, PRP * 19 및 PRP는 * 7 각각 ~ 20 kDa, ~ 19 kDa과 ~ 7 kDa, (그림 4, 왼쪽 패널)에 이주, 감지되었습니다.주세요 1E4 항체가 순서 지문을 가진 합성 펩타이드와 사전 incubated되었을 때 그러나, 더 PRP가 감지되지 않았습니다1E4에 의해 감지 대역 PRP 조각임을 나타내는 1E4 에피토프 (그림 4, 중, 패널)에 ICAL. 또한, 항-C 항체가 ~ 18 kDa에서 이전 두 개의 서로 다른 PRP 조각을 공개 (PRP * 18) 및 PRP뿐만 아니라 ~ 12-13 kDa (PrP-CTF12/13), * 20 (그림 4, 오른쪽 패널).
그림 1. iPrP C와 iPrP SC의 감지. 1 시간에 37 ° C에서 총 반응 량의 1 / 10시 PNGase의 F 치료 후 단백질, 전체 길이 또는 N-말기 (S2 및 P2) 수용성과 불용성 분수에 PRP 종립니다 절연에서 glycans를 제거하는 일반 제어 (CTL)와 산발적 CJD (sCJD)에서 뇌 샘플에 ultracentrifugation에 의해 PrP23-40 (중간 패널)에 대해 PrP106-112 (왼쪽 패널), 안티-N에 대한 3F4로 발견되었고 PRP에 대한 안티 - C220-231 (오른쪽 패널). 큰 금액은 S2에있는 반면 CTL 샘플에서 PRP의 작은 금액은, P2에서 검출된다. 대조적으로, 더 PRP는 sCJD 샘플에 S2보다 P2에서 검출된다.
그림 2. 자당의 그라디언트 단계에서 PRP의 침강. 1에서 비 CJD 뇌 샘플 S1 11 개별 분수에 PRP는 서양이 3F4로 blotting에 의해 발견되었다. PRP C의 대부분은 1-3 위로 분수에서 감지되었지만, PRP 소량도 바닥 분수 9-11에서 관찰되었다. 또한, 상단과 하단에서 PRP의 구간 패턴이 다릅니다 아래 분수에서 발견 PRP가 지배적 낮은 밴드가 있으며 상단 분수에서 발견 PRP는 지배적 인 위 밴드가 있습니다. PK-처리 PRP SC는 얼룩의 오른쪽에있는 컨트롤로로드했습니다.
그림 3. 수용성과 불용성 PRP C의 oligomers의 감지. 보통 인간의 두뇌에서 수용성과 불용성 PRP의 C는 ultracentrifugation으로 구분하고 각각, 젤 여과를 받게되었다. 개인 분수의 분자 크기는 분자 질량 마커의 그룹을 실행하여 측정 하였다. sCJD 뇌 샘플에서 (A) PRP SC 종. PRP 종의 두 인구가 감지되었습니다 겔 여과 분수 49 - 분수 27-33 큰 집계를 포함하는 반면 65, 단량체 작은 oligomers가 포함되어 있습니다. 일반 컨트롤 용해 분율 (S2) (B)와 불용성 분율 (P2) (C)에서 PRP C 종가 감지되었습니다. PRP는 3F4 항체를 탐지되었습니다. Dimers (분수 55)과 PRP의 tetramers (일부 51) P2에서뿐만 아니라 정상적인 뇌 sampl의 S2에서뿐만 아니라 발견되었습니다에스 (B와 C). 대형 집계는 일반 샘플 (C)의 P2에서 발견되었습니다.
그림 4. 보통 인간의 두뇌에서 g5p 강화 준비의 다양한 PK 방지 iPrP 조각의 탐지. g5p이 풍부한 샘플은 서양 (왼쪽 패널), 1E4는 1E4 에피토프 (가운데 패널)에 동일한 순서를 가진 합성 펩타이드와 1E4 사전 incubated과 프로빙 blotting 이전에 PK 및 PNGase의 F로 치료하고, 반 C (한 오른쪽 패널). 1E4 세 PK 방지 PRP 조각이 칭했다 감지 PRP * 20, PRP * 19 및 PRP * 7 (왼쪽 패널). 펩타이드와 1E4 차단 후, 더 PRP 해상도는 1E4로 감지 대역 PRP 조각임을 나타냅니다 (가운데 패널) 발견되지 않았습니다. 안티-C는 두 또한 PK 방지 PRP 조각이 칭했다 공개 PRP * 18 PRP-CTF12 /13, PRP의 * 20을 기입해야합니다.
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Discussion
여기에보고 된 접근 방식의 조합은 정상적인 인간의 뇌에서 지속적으로 불용성 PRP C 집계 및 가용성 PRP C의 oligomers를 분리합니다. 1 시간 100,000 XG의 Ultracentrifugation는 널리 가용성 PRP C 14 일부터 불용성 PRP SC의 분리에 사용 된 고전적인 방법입니다. 가,주의 중 하나를 효율적이지만 원심 분리 한 후 (S2) 표면에 뜨는 당기는 동안 오염을 방지하는 것입니다. iPrP C의 젤 프로필 PRP C의 구별이기 때문에 P2 분수에서 검색된 PRP는 S2의 오염으로 인한 않을 수도 있습니다. 자당 기울기 침강 분석들은 밀도, 크기 및 모양 15 일 기준으로 다양한 PRP SC 종을 분리하는 데 사용되었습니다. 우리는 분수 (12)는 이러한 비율은 설명 할 수없는 할 수 있습니다 몇 가지 입자가 포함 된 것으로 나타났습니다. 비율 10 자주 greates을 포함하는 하나입니다분수 사이에 PRP 집계의 t 금액은 8 모았습니다. 다양한 PRP C의 conformers의 분자량 (MW)가 추가로 젤 여과를 (또한 크기 제외 크로마토 그래피라고도 함)를 사용 특성화되었다. 우리는 처음 7 개 분자 질량 마커 (데이터 미도시)와 보정 곡선을 생성 한 다음 일반 컨트롤과 sCJD 환자의 두뇌에서 PRP의 MW를 조사했다. 우리는 PRP을 합산의 작은 금액 S1 분수의 준비 기간 동안 세포 파편과 함께 유발 될 수 있다고 지적했다. 복구 속도를 향상시키기 위해, 뇌 조직이 잘 균질해야하며 sarkosyl 솔루션 뇌 homogenate의 부화는 4 ° C.에 반 시간 또는 시간까지 연장되어야한다 iPrP C의 g5p 캡처에 대한 볼륨 제한은 없습니다 만, 우리는 각각의 실험을 위해 구슬과 100-200 μl 시료의 60-80 μl를 사용하는 것이 좋습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
저자는 정상적인 뇌 샘플을 제공하는 인간의 뇌와 척수 리소스 센터 (로스 앤젤레스, CA)에 감사하고 있습니다. 이 연구는 McGregor 재단의 지원과 대통령의 잉여 자금 기금 (케이스 웨스턴 리저브 대학)과 국립 보건원 (NIH) R01NS062787, CJD 재단, 연합 BioSecure뿐만 아니라 대학 노화에 센터와 건강에 의해 지원되었다 .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride | Sigma-Aldrich | P7626 | 72 mM in 2-propanol |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P2308 | 2 mg/ml in H2O |
| PNGase F | New England Biolabs | MWGF200 | |
| Ultracentrifuge LE-80K, SW55 rotor | Beckman Coulter | Part No. 365668, 356860 | |
| Superdex 200 HR beads | GE Healthcare | 17-1088-01 | |
| AKTA FPLC system | GE Healthcare | 18-1900-26 | |
| Molecular weight markers | Sigma-Aldrich | MWGF200 | Varied |
| Dynabeads M-280 magnetic beads | Invitrogen | 143-01 | |
| 3F4 antibody | Covance | SIG-39600 | |
| 1E4 antibody | Cell Sciences | M1840 | |
| Ready gel 15% Tris-HCl pre-cast gels | Bio-Rad | 345-0020 |
References
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