Summary
המטרה הכללית של סרט זה היא להראות כיצד לבצע הזרקת רשתית ממוקד
Abstract
הרשתית עוף העוברית היא כלי מצוין ללמוד פיתוח רשתית בבעלי חוליות גבוהות יותר. בגלל גודל גדול ופיתוח חיצוני, זה יחסית קל מאוד לתפעל את הרשתית חומוס עובריים באמצעות ה-DNA רקומביננטי / טכנולוגיית RNA. Electroporation של DNA / RNA בונה לתוך הרשתית עובריים יש יתרון גדול ללמוד ויסות הגנים בגזע / אבי תאים ברשתית במהלך התפתחות הרשתית. סוג אחר של מבחני כגון assay כתב הגן, הגן על הביטוי, הגן להפיל (shRNA) וכו 'ניתן לבצע באמצעות טכניקה electroporation. סרט הווידאו הזה מדגים הזרקת רשתית ממוקד ב electroporation לג'ימי לתוך הרשתית חומוס העוברית על המבורגר והמילטון בשלב 22-23, שזה בערך יום עובריים 4 (E4). כאן אנו מראים מהירה ונוחה בטכניקה electroporation לג'ימי לפיה DNA פלסמיד המבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) כסמן מועבר ישירותחומוס עובריים שטח subretinal ואחריו פולסים חשמליים כדי להקל על קליטת ה-DNA על ידי גזע / אבי תאים ברשתית. שיטה חדשה של הזרקת electroporation רשתית ב E4 מאפשר הדמיה של כל סוגי תאים ברשתית, כולל המנוח, יליד נוירונים 1, אשר היה קשה עם השיטה המקובלת של הזרקת electroporation על E1.5 2.
Protocol
מאז חלקים מסוימים של פרוטוקול מתבצעות כפי שתואר קודם לכן עם שינוי מזערי קטעי וידאו אחרים יופיטר 2 וניירות 3 לא נדון אותם בפירוט כאן.
1. ביצה טיפול והכנה מחט
- ביצים ניתן לאחסן יין קריר בסביבות 13 מעלות צלזיוס עד שבוע 1. אם הטמפרטורה גבוהה מדי, עוברים יתחיל להתפתח באופן חריג, כאשר הטמפרטורה נמוכה גורם תמותה גבוה. ברגע שאתה מוכן דגירה להוציא את הביצים מהמקרר את היין ולהגדיר את הביצים אנכית עם סוף יותר למעלה. לשמור את הביצים בטמפרטורה בחדר לפחות 2 שעות לפני לשים אותם 37.5 ° C חממה.
- לדגור על הביצים של 96-100 שעות שזה בערך יום עובריים 4 להשיג, כי הם עוברים על המבורגר ושלב המילטון 22 4-5.
- הכן מחטים micropipette מן צינורות זכוכית משך נימי ולשבור את קצה תחת מיקרו לנתחהיקף עם פינצטה כדי לקבל עצה על פתיחה 0.1 מיקרומטר בקוטר 20 מ"מ נר. מחטים עם טיפים גדולים יותר מתקשים חודרות את הממברנה בזמן vitelline טיפים קטנים מתקשים טעינה אספקת פתרון ה-DNA.
- חבר את המחט 0.1 מ"ל המילטון Gastight מזרק רכוב על micromanipulator. השתמש חתיכה קטנה של צינור סיליקון Masterplex לחיבור המחט במזרק. מאז החיבורים מצומצם אין צורך להוסיף שמן מינרלי לאטום את הקובץ המצורף.
- מערבבים 2 μl של פתרון ה-DNA פלסמיד כתב בריכוז הנע 3-6 מיקרוגרם / μl ו 0.2 μl של ירוק מהירה (0.025%) על פיסת parafilm. מהיר צבע ירוק יעזור לדמיין את הזריקה. לאט לאט, טען את מחט בתערובת.
- לשחרר את קרום vitelline מן הקרום הפנימי לסובב את הביצים בעדינות כ -180 ° ולחכות כמה דקות ואז לסובב אותו בחזרה למצב המקורי והעמיד אותו על electroporation.
- נגב את forcEPS וביצה פגז עם אתנול 70%, כדי למנוע זיהום לעובר.
- לעשות חור קטן על הביצה ממש מעל תא אוויר עם זוג מלקחיים בגודל AA. להיזהר לא לסדוק את קליפת הביצה. הסרה של חלקים קטנים, אחד בכל פעם כדי ליצור חלון קטן. מוציאים בזהירות את הקרום הפנימי באמצעות מלקחיים בלי לגעת קרום vitelline.
2. הזרקת electroporation
- כדי למנוע נזק מוחי או לב לתפקיד קונטרה מחט לרוחב החבילה העיקרית של כלי הדם הנכנסים לעין ומצביע לכיוון המקור.
- פירס דרך הממברנה vitelline, בלובן העין, הרשתית והומור הזגוגית על ידי דחיפה קלה פתאומית של המחט. אם המחט חודרת דרך בקצה השני של העין זה צריך להיות בסדר אלא אם כן נזק וריד דם גדול.
- לאט לאט למשוך בחזרה את המחט בקצה הפתיחה ולמקם אותו משיק כמעט אל הקיר החיצוני של גלגל העין.
- Inserלא מחט לחלל תת רשתית בין בלובן העין ועל הרשתית.
- להזריק את ה-DNA עד שאתה יכול לדמיין את הפתרון הירוק ממלא את הצד של גלגל העין ודוחפים פנימה רשתית על ידי יצירת הבליטה.
- אם הצבת המחט שלך לא נכון אז אתה תראה את פתרון ה-DNA מתפשטת בתוך הומור הזגוגי ממלא את התיכון של כדור העין. כמו כן, אם אתה פוגע ברשתית יותר מדי אז אתה רואה את פתרון ה-DNA יוצא של גלגל העין.
- לאט לאט להסיר את המחט ומיד למקם את האלקטרודות במקביל בתוך הביצה לאחר טבילה PBS. לדחוף את האלקטרודות לצלול לתוך מי השפיר באופן כל כך את העין מוזרק ממוקם בין האלקטרודות. אל תיגע בכל כלי דם גדול או את הלב עם האלקטרודות תוך שימת אותם. אלקטרודה שלילית צריך להיות בצד הזריקה, כך ה-DNA יכול להיות מועבר מן החלל רשתית תת לתוך הרשתית לכיוון האלקטרודה החיובית. אלקטרוporate הרשתית עם 5 פולסים של 15V עבור 50 MS 950 במרווחים עם טרשת נפוצה.
- מוציאים בזהירות את האלקטרודות וסוגרים את החלון של ביצה עם חתיכות של נייר דבק ברור.
- התווית היום ביצה המוזרק לפני שהחזיר אותו בחממה. בדרך כלל, זה לוקח בערך 3 עד 5 דקות כדי להשלים את התהליך electroporation כולו.
- ביטוי של GFP ניתן לראות כבר לאחר 8 שעות electroporation. עם זאת, ייתכן לחכות עד העובר מגיע לשלב הרצוי לפני הקטיף.
3. נציג תוצאות
במחקר שלנו, אנו משתמשים בונה פלסמיד שונים כדי ללמוד את הרגולציה של ביטוי גנים המעורבים בהתפתחות תאים ברשתית. בסרטון הזה pCAG-GFP (שליטה transfection) שימש לעקוב הזרקת electroporation מוצלח. עם זאת, בנייתן של פלסמיד עם גן הכתב (GFP, RFP וכו ') ניתן להשתמש בו. למרות הביטוי GFP ניתן לראות כבר לאחר 8 שעות electroporation, אנחנו בדרך כלל מתחילים לקצור את הביצה ביום 6 (E6) ואילך. Electroporated הרשתיות נותחו מתוך העובר וניתח תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי לנתיחה לפני הטבעה ו חתך. בדרך כלל, ביטוי גנים עיתונאי ניתן לראות לפחות רבע הרשתית לאחר electroporation מוצלחת (איור 1). רקמת הרשתית transfected נותחו עוד דרך חתך להדמיה ברורה של מורפולוגיות סלולריים. אימונוהיסטוכימיה באמצעות סוג תא סמנים ספציפיים (Brn3a, Pax6 וכו ') אפיון מותר הביטוי תא ספציפי GFP (איור 2).
באיור 1. Electroporation מוצלח של הביטוי העיתונאי תוצאות פלסמיד ה-GFP חיובית. עוף עובריים הרשתיות הוזרקו ו electroporated ביום עובריים 4 וקצרו ביום עובריים 6. לפחות 25% של הרשתית היה transfected בהצלחה (= צפה למעלה, ב '= מבט מלמטה). קנה מידה בר = 1mm.
איור 2. אפיון של ה-GFP לבטא בתאי הרשתית באמצעות אימונוהיסטוכימיה. GFP להביע רקמות רשתית בשלב E7 היו קבועים מחולק. סעיפים אלה היו מוכתמים אז עם סמנים תאים שונים מסוימים. Brn3a שימש כדי לקבוע בתאי הגנגליון (א ') תוך Pax6 שימש כדי לקבוע amacrine אופקי, ותאי הגנגליון (ב'). סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ממוקד הזרקת ברשתית וב electroporation לג'ימי ברשתית עוברית בשלב E4 יכול ממוקדת ובתאים הרשתית וכתוצאה מכך היכולת לחזות את כל ששת סוגי התאים העיקריים רשתית ברמת תא בודד. ב electroporation לג'ימי ב HH10 (~ E1.5) מיקוד שלפוחית הראיה הוא מסוגל transfect תאים המתפתחים כדי ליצור את העין. עם זאת, תאים אלו יש תחלופה גבוהה מאוד בשלב זה שיטה זו אינה ספציפית בתאי הרשתית. ייתכן כי שיעור גבוה מחזור התא ומונע ביטוי יציבות מתמשכת. על ידי E4, העובר מפותחת מספיק, כי את המבנים העיקריים של העין נוצרות כמעט צעיר מספיק, כי רוב התאים ברשתית הם בתאי גזע רשתית עדיין. שיטה זו יכולה לחול גם על רווח / הפסד של מחקרים פונקציה שבו הגן של עניין ניתן ממוקדות ללמוד התפתחות תקינה ו / או מחלה של הרשתית.
לאחר שפרסמנו את הטכניקה ב שלנובמאמר הקודם 1, כמה מדענים בתחום זה פנו אלינו כדי לקבל סיוע נוסף על הטכניקה הזו. אז החלטנו לייצר וידאו זה להדמיה. בנוסף, מקדמת את הטכניקה שלנו ב מתוארים בסרט הזה.
כדי לבצע את הטכניקה הזו בהצלחה, גורמים קריטיים הבאים שווים המתאר.
הגורם הקריטי ביותר הוא למקם את המחט במדויק במרחב subretinal. ראשית, צריך להיות זהיר כדי ליישר את המחט קונטרה-לרוחב החבילה העיקרית של כלי הדם הנכנסים לעין ומצביע לכיוון המקור. עמדה זו היא כמעט במקביל אל הלב ומפחית את הסיכוי לפגוע המוח ואת הלב. כאשר חודר דרך קרום vitelline, בלובן העין, הרשתית והומור זגוגי, המחט לא צריך לנסוע רחוק פירס דרך וריד דם. אם המחט היא חדה מספיק אז ניתן לעשות זאת בקלות עם שיטות אחדות. השלב הבא הוא לאט למשוך בחזרה הדואר מחט ומקם אותה בקצה הפתיחה של הרשתית. תמיד יש סיכוי למשוך את זה לחלוטין. אם זה יקרה, אז אפשר לנסות שוב להכניס את קצה המחט לאחור בפתח. מיקום המחט בחלל subretinal (בין בלובן העין ועל הרשתית) דורש אימון וסבלנות. בהתחלה זה נראה קשה מאוד, אך עם קצת תרגול זה הופך להיות קל. בזמן הזרקת פתרון ה-DNA בתוך המקום subretinal, חשוב מאוד לצפות את היווצרות הבליטה. לאחר מכן, הפתרון הירוק מתחיל למלא את קווי המתאר של העין, מה שמעיד על זריקה מוצלחת. אם הפתרון מפזרת משם או מתחיל למלא למרכז של העין, המציין זריקה נכונה שלא תניב electroporation מוצלח.
הגורם השני הוא ייצור של מחט אופטימלי שעשוי באמצעות חום משיכת צינור זכוכית נימי ולשבור את קצה. מחטים עם טיפים גדולים יש פירסינג הקושי through קרום vitelline אשר מעלה את הסיכוי של פגיעה ברשתית. בדרך כלל טיפים מחט החריפים ביותר הם הטובים ביותר למטרה זו. עם זאת, מחט עם טיפים קטנים מאוד מתקשים טעינה לספק את ה-DNA יש סיכוי גבוה לשבור בתוך גלגל העין. מסיבה זו אנו עושים מחטים עם פתיחת טיפ כ 0.1 מיקרומטר בקוטר 20 מ"מ נר 1. כמו כן, בעת טעינת תערובת דנ"א טיפה על פיסת parafilm, חשוב מאוד לא להעמיס את החלק האחרון של נוזל כמו שזה מגדיל את הסיכוי להגיע האוויר בתוך המחט.
לבסוף, הצבת של האלקטרודות הוא קריטי מאוד כדי להשיג electroporation מוצלח. האלקטרודות צריך להיות ממוקם במקביל, כדי לפתח את העין נמצא בין האלקטרודות. משנה זהירות יש לנקוט מלגעת באף כלי דם גדולים או לב עם האלקטרודות. פגיעה בכל אלה עלול לגרום למוות העובר גם לאחר injecti מוצלחתב. יתר על כן, שתי עיניים מכוונת אחרת. לכן, צריך לזכור כדי לשנות את כיוון האלקטרודה (חיובי לעומת שלילי), כך אלקטרודה שלילית צריך להיות תמיד בצד הזרקת לאפשר מפוזר דנ"א לתוך התאים ברשתית תחת זרם חשמלי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
כל הניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדי ועדת מתקנים באוניברסיטת ראטגרס.
Acknowledgments
ברצוננו להודות למר Maaz אנוור לשימוש של המצלמה שלו HD (קנון VIXIA HFS100). עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי תרומות של NIH (EY018738), ניו ג'רזי ועדת המחקר של חוט השדרה (08-3074-SCR-E-0 ו 10-3091-SCR-E-0), ובוש פרס Biomedical Research.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fertilized pathogen-free (SPF) white leghorn chicken eggs | Sunrise Farms (Catskill, NY) | ||
| Chicken egg incubator | GQF Manufacturing | Model-1550 | Set to 60% humidity and 37.5°C. |
| Glass capillary tubes | World Precision Instruments, Inc. | TW150F-4 | |
| 0.1 ml syringe | Hamilton Co | Gastight 1710 | Alternatively 1ml syringe can be used as well |
| Masterflex Silicone (peroxide) Tubing | Cole-Parmer | HV-96400-13 | Cut a small piece (1 cm) for attaching the glass needle to the syringe |
| Tweezers | Dumont | AA | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments, Inc. | M3301-M3 | |
| Plasmid DNA | pCAG-GFP was borrowed from Dr. Connie Cepko | ||
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252 | Dilute it to 0.025 % with PBS |
| Pulse generator | Harvard Apparatus | BTX ECM 830 | Square wave generator |
| Electrodes | Harvard Apparatus | BTX model 514 | Our electrodes were spaced 3-5 mm apart |
| Monochrome Digital Camera | Carl Zeiss, Inc. | Axiocam MRM | |
| Fluorescent Dissection Microscope | Leica Microsystems | Leica MZ16FA | |
| Upright Fluorescence Microscope | Carl Zeiss, Inc. | Zeiss Axio Imager A1 |
References
- Doh, S. T. Analysis of retinal cell development in chick embryo by immunohistochemistry and in ovo electroporation techniques. BMC. Dev. Biol. 10, (2010).
- Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos. J. Vis. Exp. (9), e408-e408 (2007).
- Nakamura, H., Funahashi, J. Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation. Methods. 24, 43-48 (2001).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Dev. Dyn.. 195, 231-272 (1992).
- Hamburger, V. The stage series of the chick embryo. Dev. Dyn. 195, 273-275 (1992).
