Summary
El objetivo general de este video es mostrar cómo llevar a cabo la inyección específica de retina y
Abstract
La retina embrionaria de pollo es una excelente herramienta para estudiar el desarrollo de la retina en los vertebrados superiores. Debido al enorme tamaño y desarrollo externo, es comparativamente muy fácil de manipular la retina de embriones de pollo con ADN recombinante / tecnología de ARN. La electroporación de ADN / ARN construcciones dentro de la retina embrionaria tienen una gran ventaja para estudiar la regulación de genes en la retina células madre / progenitoras durante el desarrollo de la retina. Diferentes tipos de ensayos tales como la prueba del gen, la sobre-expresión del gen, el gen tumbar (shRNA), etc se puede realizar utilizando la técnica de electroporación. Este video muestra la inyección dirigida la retina y en la electroporación in ovo en la retina de embriones de pollo en el Hamburger y Hamilton etapa de 22-23, que es aproximadamente el día embrionario 4 (E4). Aquí nos muestran un rápido y conveniente en la técnica de electroporación in ovo por el cual un plásmido de ADN que expresa la proteína verde fluorescente (GFP) como marcador se entregarán directamente en elde embriones de pollo subretiniano espacio y seguido por pulsos eléctricos para facilitar la absorción de ADN por la retina células madre / progenitoras. El nuevo método de inyección de retina y la electroporación en E4 permite la visualización de todos los tipos de células retinales, incluyendo la neuronas tarde-nacido en 1, que ha sido difícil con el método convencional de inyección y la electroporación en E1.5 2.
Protocol
Dado que algunas partes del protocolo se realizó tal como se ha descrito previamente en otros vídeos JOVE 2 y 3 papeles con modificación menor no vamos a discutir aquellos en detalle aquí.
1. Manejo de los huevos y preparación de la aguja
- Los huevos pueden ser almacenados en un enfriador de vino menos aproximadamente 13 ° C hasta por 1 semana. Si la temperatura es demasiado alta, los embriones comienzan a desarrollarse anormalmente, mientras que una temperatura más baja provoca una alta mortalidad. Una vez que esté listo para incubar sacar los huevos del refrigerador para vinos y establecer los huevos en posición vertical con el extremo más arriba. Mantenga los huevos en la temperatura ambiente durante al menos 2 horas antes de ponerlos en la incubadora de 37,5 ° C.
- Se incuban los huevos para 96-100 horas, que es alrededor del día 4 de embriones para obtener embriones que se encuentran en el Hamburger y Hamilton 22 etapa de 4-5.
- Preparar agujas micropipeta de tubos de vidrio tirados capilar y romper la punta de disección bajo un microalcance con unas pinzas para obtener una apertura de la punta alrededor de 0,1 m de diámetro y un cono de 20 mm. Agujas con puntas más grandes tienen dificultades para atravesar la membrana vitelina mientras que los más consejos tienen dificultades para la carga y la entrega de la solución de ADN.
- Coloque la aguja en un 0,1 ml jeringa Hamilton estanca montado en un micromanipulador. Use un pequeño trozo de tubo de silicona Masterplex para fijar la aguja a la jeringa. Dado que las conexiones estén bien ajustadas sin necesidad de añadir aceite mineral para sellar esta unión.
- Mezclar 2 l de solución de ADN plásmido reportero con una concentración que oscila 3-6 ug / l y 0,2 l de verde rápido (0,025%) en un trozo de Parafilm. Fast tinte verde le ayudará a visualizar la inyección. Poco a poco, la carga de la aguja con la mezcla.
- Para liberar la membrana vitelina de la membrana interna del huevo gire suavemente alrededor de 180 ° y espere algunos minutos y lo gira a la posición original y lo puso para la electroporación.
- Limpie el forzamientoeps y la cáscara de huevo con el 70% de etanol para evitar la infección del embrión.
- Hacer un pequeño agujero en el huevo inmediatamente por encima de la celda de aire con un par de fórceps de tamaño AA. Tenga cuidado de no romper la cáscara del huevo. Retire los trozos pequeños de uno en uno para hacer una pequeña ventana. Retire con cuidado la membrana interna utilizando las pinzas sin tocar la membrana vitelina.
2. Inyección y electroporación
- Para evitar daños en el cerebro o el corazón, la posición de la contraindicado aguja lateral al paquete principal de los vasos sanguíneos que entran en el ojo y apuntando hacia el pico.
- Pierce a través de la membrana vitelina, la esclera, la retina y el humor vítreo por un súbito empujón suave de la aguja. Si la aguja perfora a través del otro extremo del ojo debe estar bien a menos que daña cualquier vena sanguíneo importante.
- Lentamente tire hacia atrás la aguja en el borde de la abertura y colocarlo casi tangente a la pared externa del globo ocular.
- Insert de la aguja en el espacio sub retiniana entre la esclerótica y la retina.
- Inyectar el ADN hasta que se pueda visualizar la solución de verde de llenado del lado del globo ocular y empujar hacia adentro la retina mediante la creación de un bulto.
- Si su colocación de la aguja no es correcta, entonces podrás ver la solución de ADN propagación en el interior del humor vítreo de llenado por el centro del globo ocular. Además, si se daña la retina demasiado, entonces podrás ver la solución de ADN sale del globo ocular.
- Lentamente retire la aguja y de inmediato colocar los electrodos en paralelo dentro del huevo después de la inmersión en PBS. Empuje hacia abajo los electrodos a sumergirse en el líquido amniótico de una manera para que el ojo inyectado se encuentra entre los electrodos. Evite tocar cualquier vaso sanguíneo principal o el corazón con los electrodos mientras que colocarlas. El electrodo negativo debe estar en el lado de la inyección para que el ADN puede ser transportado desde el espacio sub retinal en la retina hacia el electrodo positivo. Electroporado la retina con 5 pulsos de 15 V para 50 ms, con intervalos de 950 ms.
- Retire con cuidado los electrodos y sellar la ventana del huevo con trozos de cinta adhesiva transparente.
- Etiqueta y la fecha del huevo inyectada antes de volver a la incubadora. Normalmente, se tarda alrededor de 3 a 5 minutos para completar el proceso de electroporación conjunto.
- La expresión de GFP puede ser visto como temprano como 8 horas después de la electroporación. Sin embargo, usted puede esperar hasta que el embrión alcanza el punto deseado antes de la cosecha.
3. Los resultados representativos
En nuestro estudio, utilizamos diversas construcciones de plásmidos para estudiar la regulación de la expresión de genes que participan el desarrollo de células de la retina. En este vídeo pCAG-GFP (control de transfección) se utilizó para seguir una inyección exitosa y electroporación. Sin embargo, cualquier constructo plásmido con el gen reportero (GFP, RFP etc) se puede utilizar. A pesar de que la expresión de GFP puede ser visto como a las 8 horas después del elementoctroporation, que suelen comenzar la recolección del huevo en el día 6 (E6) y en adelante. Electroporated retinas fueron disecados del embrión y se analizaron bajo el microscopio de disección fluorescente antes de inclusión y corte. Típicamente, reportero de la expresión génica puede ser visto por lo menos en una cuarta parte de la retina después de una exitosa electroporación (Fig. 1). Los tejidos de la retina transfectadas fueron analizados a través de seccionamiento para una visualización clara de la morfología celular. La inmunohistoquímica con marcadores de células específicas del tipo (Brn3a, Pax6 etc) permite la caracterización de la expresión de GFP específico de las células (Fig. 2).
Figura 1. El éxito de la electroporación de expresión reportero GFP resultados positivos plásmido. Embriones de pollo retinas fueron inyectados y electroporated en el día embrionario 4 y cosechadas en el día embrionario 6. Al menos el 25% de la retina se transfectadas con éxito (Un punto de vista = Arriba, B= Vista desde abajo). Barra de escala = 1 mm.
Figura 2. Caracterización de las buenas prácticas agrarias expresando células de la retina mediante inmunohistoquímica. GFP expresando tejidos retina en la etapa de E7 se fija y se secciona. Estas secciones fueron teñidas con marcadores específicos de células diferentes. Brn3a se utilizó para determinar las células ganglionares (A) mientras Pax6 se utilizó para determinar amacrinas horizontal, y las células ganglionares (B). Barra de escala = 50 micras.
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Discussion
Dirigida por inyección en la retina y la electroporación in ovo en la retina de embrión en la etapa E4 pueden dirigirse específicamente a las células retinianas progenitoras derivadas de la capacidad de visualizar todos los seis tipos principales de células de retina en el nivel de células individuales. En la electroporación in ovo en HH10 (~ E1.5) centradas en la vesícula óptica es capaz de transfectar células que se desarrollan para formar el ojo. Sin embargo, estas células tienen una rotación muy elevada en este momento y este método no es específico para células de la retina. Puede ser que la tasa de celda alta rotación impide la expresión sostenida estable. Por E4, el embrión está lo suficientemente desarrollado que las principales estructuras del ojo están todos formados pero lo suficientemente joven como que la mayoría de las células en la retina son las células madre todavía retinianas. Este método también se puede aplicar a ganar / pérdida de los estudios de función donde puede ser un gen de interés dirigidos a estudiar el desarrollo normal y / o enfermedad de la retina.
Después de publicada esta técnica en nuestroun artículo anterior, varios científicos en este campo en contacto con nosotros para obtener más ayuda en esta técnica. Así que decidimos producir este video para la visualización. Además, los avances en nuestra técnica se describen en este vídeo.
Para realizar esta técnica con éxito, a raíz de factores críticos que vale la pena describir.
El factor más importante es colocar la aguja, precisamente, en el espacio subretiniano. En primer lugar, hay que tener cuidado de alinear la aguja contra-lateral al haz principal de los vasos sanguíneos que entran en el ojo y apuntando hacia el pico. Esta posición es casi paralela a la del corazón y reduce la posibilidad de dañar el cerebro y el corazón. Cuando penetra a través de la membrana vitelina, la esclera, la retina y el humor vítreo, la aguja no debe viajar lejos y penetrar a través de una vena de sangre. Si la aguja es lo suficientemente nítida a continuación, esto se puede hacer muy fácilmente con pocas prácticas. El siguiente paso es poco a poco tirando hacia atrás ªcorreo aguja y posición que en el borde de la abertura de la retina. Siempre hay una oportunidad para tirar de él por completo. Si eso ocurre, entonces se puede volver a intentar poner la punta de la aguja de nuevo en la apertura. Colocación de la aguja en el espacio subretiniano (entre la esclerótica y la retina) requiere práctica y paciencia. En un principio, parece muy difícil, sin embargo con un poco de práctica se hace fácil. Mientras que la inyección de la solución de ADN en el interior del espacio subretiniano, es muy importante para observar la formación protuberancia. Posteriormente, la solución verde empieza a llenar el contorno del ojo, lo que indica una inyección exitosa. Si la solución se difunde quitan o empieza a llenar en la media del ojo, que indica una inyección incorrecta que no va a ceder una electroporación exitosa.
El segundo factor es la fabricación de una aguja óptima que se hace a través de calor-tirando de un tubo de vidrio capilar y romper la punta. Agujas con puntas grandes tienen dificultades para la perforación through la membrana vitelina que aumenta el riesgo de dañar la retina. Por lo general, más agudas puntas de las agujas son los mejores para este propósito. Sin embargo, la aguja con puntas muy pequeñas tienen dificultades para la carga y la entrega del ADN y tienen mayor probabilidad de romper en el interior del globo ocular. Por esta razón nos hacen que las agujas con una abertura de la punta en alrededor de 0,1 micras de diámetro y una conicidad de 20 mm 1. También, durante la carga de la mezcla de ADN a partir de una gotita en un trozo de Parafilm, es muy importante no para cargar el último bit de líquido a medida que aumenta las posibilidades de conseguir aire en el interior de la aguja.
Por último, la colocación de los electrodos es muy crítico para lograr electroporación exitosa. Los electrodos deben ser colocados en paralelo de manera que el desarrollo del ojo está situado entre los electrodos. La precaución adicional debe tomarse de tocar cualquiera de los principales vasos sanguíneos o el corazón con los electrodos. Dañar cualquiera de estos puede dar lugar a la muerte del embrión, incluso después de una exitosa Injectisobre. Además, los dos ojos están orientados de manera diferente. Por lo tanto, tiene que ser mantenido en mente para cambiar la orientación del electrodo (positivo vs negativo) de modo que el electrodo negativo debería ser siempre en el lado de inyección, para permitir la difusa ADN en las células de la retina bajo la corriente eléctrica.
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Disclosures
Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el animal de Atención Institucional y el Comité de Servicios de la Universidad Rutgers.
Acknowledgments
Nos gustaría dar las gracias al Sr. Enver Maaz para el uso de su cámara de alta definición (Cannon VIXIA HFS100). Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones de NIH (EY018738), Nueva Jersey Comisión de Investigación de la Médula Espinal (08-3074-SCR-E-0 y 10-3091-SCR-0-E), y Busch Premio de Investigación Biomédica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fertilized pathogen-free (SPF) white leghorn chicken eggs | Sunrise Farms (Catskill, NY) | ||
| Chicken egg incubator | GQF Manufacturing | Model-1550 | Set to 60% humidity and 37.5°C. |
| Glass capillary tubes | World Precision Instruments, Inc. | TW150F-4 | |
| 0.1 ml syringe | Hamilton Co | Gastight 1710 | Alternatively 1ml syringe can be used as well |
| Masterflex Silicone (peroxide) Tubing | Cole-Parmer | HV-96400-13 | Cut a small piece (1 cm) for attaching the glass needle to the syringe |
| Tweezers | Dumont | AA | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments, Inc. | M3301-M3 | |
| Plasmid DNA | pCAG-GFP was borrowed from Dr. Connie Cepko | ||
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252 | Dilute it to 0.025 % with PBS |
| Pulse generator | Harvard Apparatus | BTX ECM 830 | Square wave generator |
| Electrodes | Harvard Apparatus | BTX model 514 | Our electrodes were spaced 3-5 mm apart |
| Monochrome Digital Camera | Carl Zeiss, Inc. | Axiocam MRM | |
| Fluorescent Dissection Microscope | Leica Microsystems | Leica MZ16FA | |
| Upright Fluorescence Microscope | Carl Zeiss, Inc. | Zeiss Axio Imager A1 |
References
- Doh, S. T. Analysis of retinal cell development in chick embryo by immunohistochemistry and in ovo electroporation techniques. BMC. Dev. Biol. 10, (2010).
- Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos. J. Vis. Exp. (9), e408-e408 (2007).
- Nakamura, H., Funahashi, J. Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation. Methods. 24, 43-48 (2001).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Dev. Dyn.. 195, 231-272 (1992).
- Hamburger, V. The stage series of the chick embryo. Dev. Dyn. 195, 273-275 (1992).
