Summary
O objetivo geral deste vídeo é mostrar como executar alvo injeção de retina e
Abstract
Retina embrionária de galinha é uma excelente ferramenta para estudar o desenvolvimento da retina em vertebrados mais elevados. Por causa de grande tamanho e desenvolvimento externo, ele é comparativamente muito fácil de manipular a retina de pinto embrionário usando recombinante DNA / tecnologia de RNA. Electroporação de ADN / ARN construtos para a retina embrionária têm uma grande vantagem para estudar regulação do gene em retinianas-tronco / progenitoras células durante o desenvolvimento da retina. Tipo diferente de ensaios, tais como ensaio de repórter gene, gene over-expressão, gene knock down (shRNA), etc pode ser realizada utilizando a técnica de electroporação. Este vídeo demonstra alvejado injecção da retina e em eletroporação in ovo dentro da retina de pinto embrionário no Hamburger e do estágio Hamilton 22-23, o que é de cerca de dia embrionário 4 (E4). Aqui nós mostramos uma rápida e conveniente em técnica de eletroporação in ovo através do qual um DNA de plasmídeo que expressa a proteína fluorescente verde (GFP) como um marcador está diretamente entregue napinto espaço sub-retiniano embrionário e seguido por pulsos elétricos para facilitar a absorção de DNA por retina estaminais / progenitoras das células. O novo método de injecção de retina e electroporação em E4 permite a visualização de todos os tipos celulares da retina, incluindo a neurônios tardia-nascido 1, que tem sido difícil com o método convencional da injecção e electroporação em E1.5 2.
Protocol
Uma vez que algumas partes do protocolo são realizados conforme descrito anteriormente em outros vídeos Jové 2 e papéis 3 com modificações menores não vamos discutir aqueles em detalhe aqui.
1. Manuseio de ovo e Preparação Agulha
- Os ovos podem ser armazenados em um refrigerador de vinho menos cerca de 13 ° C por até 1 semana. Se a temperatura é demasiado elevada, os embriões vai começar a desenvolver de forma anormal, enquanto que, baixa temperatura provoca uma mortalidade de alta. Quando estiver pronto para incubar tirar os ovos do refrigerador de vinho e definir os ovos na vertical com a extremidade maior até. Mantenha os ovos em a temperatura da sala durante pelo menos 2 horas antes de colocá-los no 37,5 ° C incubadora.
- Incubam os ovos para 96-100 horas, que é sobre o dia embrionário 4 para obter embriões que estão na fase Hamburger e Hamilton 22 4-5.
- Prepare agulhas micropipeta de tubos de vidro puxado capilares e quebrar a ponta em uma micro dissecaçãoescopo com uma pinça para conseguir uma abertura cerca de 0,1 m de diâmetro e um cone de 20 mm. Agulhas com pontas maiores têm dificuldade perfurar a membrana vitelina enquanto pontas menores têm dificuldade de carregar e entregar a solução de DNA.
- Anexar a agulha para um 0,1 ml Hamilton estanque ao gás seringa montada sobre um micromanipulador. Use um pequeno pedaço de Masterplex tubo de silicone para anexar a agulha para a seringa. Uma vez que as conexões estão apertadas não há necessidade de adicionar óleo mineral para selar este anexo.
- Misture 2 uL de repórter solução de ADN plasmídeo com uma concentração que varia 3-6 ug / uL e 0,2 uL de verde rápido (0,025%) em um pedaço de parafilme. Corante verde rápido vai ajudar a visualizar a injeção. Lentamente, carregar a agulha com a mistura.
- Para liberar a membrana vitelina da membrana interna girar o ovo suavemente cerca de 180 ° e esperar por alguns minutos, em seguida, gire-o de volta à posição original e configurá-lo para eletroporação.
- Limpe a forceps e casca de ovo com etanol a 70% para evitar a infecção para o embrião.
- Faça um pequeno buraco sobre o ovo imediatamente acima da célula de ar com um par de fórceps tamanho AA. Tenha cuidado para não quebrar a casca do ovo. Remover pedaços pequenos um de cada vez para fazer uma pequena janela. Cuidadosamente remova a membrana interna usando os fórceps sem tocar a membrana vitelina.
2. Injeção e Eletroporação
- Para evitar danos para o cérebro ou o coração posição, o contra-agulha lateral para o bundle principal de vasos sanguíneos que entram no olho e apontando em direção ao bico.
- Pierce através da membrana vitelina, esclera, retina e humor vítreo por um impulso súbito suave da agulha. Se a agulha perfura através de a outra extremidade do olho que deve ser alright, a menos que ele danifica qualquer veia sangue major.
- Lentamente, puxe de volta a agulha na borda da abertura e colocá-lo quase tangente à parede exterior do globo ocular.
- Insert a agulha para dentro do espaço sub da retina entre a esclera e da retina.
- Injectar o DNA até que você possa visualizar a solução verde de enchimento o lado do globo ocular e empurrando a fressura da retina através da criação de um bojo.
- Se a sua colocação da agulha não é correto, então você vai ver a solução de DNA se espalhando dentro do humor vítreo enchendo até o meio do globo ocular. Além disso, se você danificar a retina muito, então você vai ver a solução de DNA está saindo do globo ocular.
- Lentamente, retirar a agulha e coloque imediatamente os eletrodos em paralelo dentro do ovo após imersão em PBS. Empurre os eletrodos para submergir no líquido amniótico de uma forma para que o olho injetado está localizado entre os eletrodos. Evite tocar em qualquer grande vaso sanguíneo ou o coração com os eletrodos, enquanto colocá-los. O eletrodo negativo deve ser na parte lateral da injecção para que o DNA pode ser transportados a partir do espaço da retina sub para a retina em direção eletrodo positivo. Electrocorporar a retina com 5 pulsos de 15V para 50 ms com intervalos de 950 ms.
- Com cuidado, retire os eletrodos e selar a janela do ovo com pedaços de fita adesiva transparente.
- Etiqueta e datar o ovo injetado antes de colocá-lo de volta para a incubadora. Tipicamente, ele leva cerca de 3 a 5 minutos para completar o processo de electroporação todo.
- Expressão da GFP pode ser visto tão cedo quanto 8 horas após a electroporação. No entanto, você pode esperar até que o embrião atinge a fase desejada antes da colheita.
3. Os resultados representativos
Em nosso estudo, nós usamos vários construtos plasmídicos para estudar a regulação da expressão de gene que envolveu o desenvolvimento de células de retina. Neste vídeo pCAG-GFP (controle de transfecção) foi usado para siga uma injecção de bem-sucedida e electroporação. No entanto, qualquer constructo plasmídeo com gene repórter (GFP, RFP etc) pode ser usado. Mesmo embora expressão da GFP pode ser visto tão cedo quanto 8 horas após a elemenctroporation, que normalmente começar a colher o óvulo no dia 6 (E6) e em diante. Eletroporados retinas foram dissecadas para fora do embrião e analisados em microscópio fluorescente dissecção antes de incorporação e de corte. Tipicamente, expressão do gene repórter pode ser visto, pelo menos, em um quarto da retina após uma electroporação bem-sucedida (Fig. 1). Os tecidos da retina transfectadas foram analisados por meio de seccionamento de uma clara visualização de morfologias celulares. A imuno-histoquímica utilizando marcadores de células tipo específico (Brn3a, Pax6 etc) de caracterização permitido de célula-específica expressão da GFP (Fig 2).
Figura 1. Eletroporação sucesso de expressão plasmídeo repórter GFP resultados positivos. Chicken embrionário retinas foram injetados e electroporados no dia embrionário 4 e colhidas no dia embrionário 6. , Pelo menos, 25% da retina com êxito foi transfectado (Um modo de exibição = Top, B= View Inferior). Escala Bar = 1mm.
Figura 2. Caracterização de células da retina expressando GFP utilizando imuno-histoquímica. GFP expressar tecidos da retina em E7 foram palco fixo e seccionados. Estas secções foram, então, corados com marcadores de células vários específicas. Brn3a foi utilizado para determinar células ganglionares (A) enquanto Pax6 foi utilizado para determinar amacrina, horizontal e células ganglionares (B). Barra de escala = 50 mM.
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Discussion
Targeted injecção da retina e em eletroporação in ovo em retina embrionária no estádio de E4 podem objetivar especificamente as células progenitoras da retina, resultando em a habilidade de visualizar todos os seis principais tipos de células da retina no nível da célula única. Em electroporação in ovo em HH10 (~ E1.5) alvejando o vesícula óptica é capaz de transfectar células que se desenvolvem para formar o olho. No entanto, estas células têm um volume de negócios muito elevado neste momento, e este método não é específico para células da retina. Pode ser que a taxa de volume de negócios de alta célula impede que sustentada expressão estável. Por E4, o embrião é desenvolvido o suficiente para que as principais estruturas do olho são todos formados mas jovem o suficiente para que a maioria das células na retina são células-tronco ainda da retina. Este método também pode ser aplicado para ganhar / perda de estudos de função onde um gene de interesse podem ser direcionados para estudar o desenvolvimento normal e / ou de doença de da retina.
Depois de publicada esta técnica em nossotrabalho anterior 1, vários cientistas neste campo entrou em contato conosco para obter mais assistência sobre esta técnica. Então decidimos produzir este vídeo para visualização. Além disso, os avanços em nossa técnica são descritos em este vídeo.
Para realizar esta técnica com sucesso, na sequência de fatores críticos vale a pena descrever.
O fator mais crítico é o de colocar a agulha precisamente no espaço sub-retiniano. Em primeiro lugar, é preciso ter cuidado para alinhar a agulha contra-lateral ao feixe principal dos vasos sanguíneos que entram no olho e apontando em direção ao bico. Esta posição é quase paralelo para o coração e reduz a chance de danificar o cérebro e do coração. Quando penetra através da membrana vitelina, esclera, retina e humor vítreo, a agulha não deve viajar para longe e perfurar qualquer veia sangue. Se a agulha é nítida o suficiente, então isso pode ser feito muito facilmente com poucas práticas. O próximo passo é lentamente puxando para trás ªagulha e, bem como posição-lo na borda da a abertura da retina. Há sempre uma chance de retirá-la completamente. Se isso acontecer, então pode-se tentar novamente para colocar a ponta da agulha para trás na abertura. Colocar a agulha no espaço sub-retiniano (entre esclera e retina) requer prática e paciência. No início, parece muito difícil, mas com alguma prática torna-se fácil. Enquanto está a injectar a solução de ADN no interior do espaço sub-retiniano, ele é muito importante para observar a formação bojo. Posteriormente, a solução verde começa a preencher o contorno do olho, indicando uma injecção de bem-sucedida. Se a solução difunde afastado ou começa a preencher para o meio do olho, que indica uma injecção incorrecta que não irá ceder um electroporação bem-sucedida.
O segundo fator é a fabricação de uma agulha óptima que é feito através de calor-puxando um tubo de capilar de vidro, e quebrando o gorjeta. Agulhas com pontas grandes têm dificuldade de perfuração through a membrana vitelina o que aumenta a chance de danificar a retina. Normalmente pontas afiadas agulhas são os melhores para esta finalidade. No entanto, agulha com dicas muito pequenas têm dificuldade em carregar e entregar o DNA e têm maior chance de quebrar no interior do globo ocular. Por esta razão nós fazer agulhas com uma abertura da ponta em cerca de 0,1 m de diâmetro e um de afilamento 20 milímetros 1. Além disso, enquanto o carregamento do mistura de ADN a partir de uma gotícula em um pedaço de parafilme, que é muito importante para não carregar o último bit de líquidos, tal como ela aumenta as chances de conseguir ar no interior da agulha.
Finalmente, a colocação dos eletrodos é muito crítico para alcançar electroporação bem-sucedida. Os eletrodos devem ser colocados em paralelo de modo a que o olho em desenvolvimento está situado entre os eletrodos. O cuidado extra deve ser tomado de tocar em qualquer principais vasos sanguíneos ou do coração com os eletrodos. Danificar qualquer um destes pode resultar a morte para o embrião, mesmo depois de uma injecti bem-sucedidapor diante. Além disso, os dois olhos são de forma diferente orientado. Então, ele tem que ser mantido em mente para alterar a orientação do eletrodo (positivo vs negativo) de modo a que o eletrodo negativo deve ser sempre na parte lateral de injecção para permitir que o difusa do DNA para as células da retina ao abrigo da corrente elétrica.
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Disclosures
Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Institutional Animal Care e do Comitê Instalações da Universidade Rutgers.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer ao Sr. Maaz Enver para o uso de sua câmera HD (Cannon VIXIA HFS100). Este trabalho foi apoiado em parte por concessões do NIH (EY018738), Nova Jersey, Comissão de Pesquisa da Medula Espinhal (08-3074-SCR-E-0 e 10-3091-SCR-E-0), e Prêmio de Pesquisa Biomédica Busch.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fertilized pathogen-free (SPF) white leghorn chicken eggs | Sunrise Farms (Catskill, NY) | ||
| Chicken egg incubator | GQF Manufacturing | Model-1550 | Set to 60% humidity and 37.5°C. |
| Glass capillary tubes | World Precision Instruments, Inc. | TW150F-4 | |
| 0.1 ml syringe | Hamilton Co | Gastight 1710 | Alternatively 1ml syringe can be used as well |
| Masterflex Silicone (peroxide) Tubing | Cole-Parmer | HV-96400-13 | Cut a small piece (1 cm) for attaching the glass needle to the syringe |
| Tweezers | Dumont | AA | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments, Inc. | M3301-M3 | |
| Plasmid DNA | pCAG-GFP was borrowed from Dr. Connie Cepko | ||
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252 | Dilute it to 0.025 % with PBS |
| Pulse generator | Harvard Apparatus | BTX ECM 830 | Square wave generator |
| Electrodes | Harvard Apparatus | BTX model 514 | Our electrodes were spaced 3-5 mm apart |
| Monochrome Digital Camera | Carl Zeiss, Inc. | Axiocam MRM | |
| Fluorescent Dissection Microscope | Leica Microsystems | Leica MZ16FA | |
| Upright Fluorescence Microscope | Carl Zeiss, Inc. | Zeiss Axio Imager A1 |
References
- Doh, S. T. Analysis of retinal cell development in chick embryo by immunohistochemistry and in ovo electroporation techniques. BMC. Dev. Biol. 10, (2010).
- Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos. J. Vis. Exp. (9), e408-e408 (2007).
- Nakamura, H., Funahashi, J. Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation. Methods. 24, 43-48 (2001).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Dev. Dyn.. 195, 231-272 (1992).
- Hamburger, V. The stage series of the chick embryo. Dev. Dyn. 195, 273-275 (1992).
