Summary
L'objectif global de cette vidéo est de montrer comment effectuer l'injection ciblée de la rétine et
Abstract
Rétine de poulet embryonnaire est un excellent outil pour étudier le développement de la rétine chez les vertébrés supérieurs. Parce que de grande taille et de développement externe, il est relativement très facile de manipuler la rétine de poulet embryonnaire en utilisant l'ADN recombinant / technologie de l'ARN. L'électroporation de l'ADN / ARN des constructions dans la rétine embryonnaire ont un grand avantage pour étudier la régulation des gènes dans la rétine cellules souches / progénitrices au cours du développement de la rétine. Différents types de tests tels que dosage du gène rapporteur, gène sur-expression, le gène abattre (shRNA), etc peut être réalisée en utilisant la technique d'électroporation. Cette vidéo montre ciblé d'injection de la rétine et dans électroporation in ovo dans la rétine de poulet embryonnaire au stade de Hamburger et Hamilton 22-23, ce qui représente environ jour embryonnaire 4 (E4). Ici, nous montrons une réponse rapide et pratique dans lequel technique d'électroporation in ovo un ADN plasmidique qui exprime la protéine fluorescente verte (GFP) comme un marqueur est livré directement dans lapoussin embryonnaire espace sous-rétinien et suivie par des impulsions électriques pour faciliter l'absorption de l'ADN par la rétine cellules souches / progénitrices. La nouvelle méthode d'injection de la rétine et l'électroporation à E4 permet la visualisation de tous les types de cellules rétiniennes, y compris la fin de neurones d'origine 1, qui a été difficile avec la méthode conventionnelle de l'injection et l'électroporation à E1.5 2.
Protocol
Depuis quelques parties du protocole sont réalisées comme décrit précédemment dans d'autres vidéos et des documents de Jove 2 3 avec des modifications mineures, nous ne discuterons pas ceux en détail ici.
1. La manipulation des œufs et de Préparation à aiguilles
- Les œufs peuvent être stockés dans un refroidisseur de vin à environ 13 ° C pendant 1 semaine. Si la température est trop élevée, les embryons commence à se développer anormalement, tandis que la baisse de température provoque une mortalité élevée. Une fois que vous êtes prêt à prendre incuber les oeufs à partir du refroidisseur de vin et de mettre les œufs à la verticale avec la plus grande extrémité vers le haut. Gardez les oeufs dans la température ambiante pendant au moins 2 heures avant de les mettre dans l'incubateur à 37,5 ° C.
- Incuber les œufs destinés à 96-100 heures, ce qui est d'environ 4 à jour embryonnaire d'obtenir des embryons qui sont à la Hamburger et le stade de Hamilton 22 4-5.
- Préparer aiguilles micropipette à partir de tubes de verre tirés capillaires et de briser la pointe sous une dissection microportée avec une pince à épiler pour obtenir une ouverture d'extrémité d'environ 0,1 m de diamètre et d'un cône de 20 mm. Aiguilles avec de grandes pointes ont de la difficulté à percer la membrane vitelline tandis que les petits conseils ont de la difficulté de chargement et de fournir la solution d'ADN.
- Fixer l'aiguille à une seringue 0,1 ml Hamilton étanche au gaz monté sur un micromanipulateur. Utilisez un petit morceau de tube en silicone Masterplex pour fixer l'aiguille à la seringue. Étant donné que les connexions sont bien serrées pas besoin d'ajouter de l'huile minérale pour sceller cet attachement.
- Mélanger 2 pi de solution d'ADN plasmide rapporteur avec une concentration allant de 3 à 6 pg / pl et 0,2 pi de vert rapide (0,025%) sur un morceau de parafilm. Rapide colorant vert aidera à visualiser l'injection. Lentement, charger l'aiguille avec le mélange.
- Pour libérer la membrane vitelline de la membrane interne tourner l'œuf délicatement environ 180 ° et d'attendre pendant quelques minutes, puis le faire pivoter à sa position initiale et le mettre pour l'électroporation.
- Essuyez le forçageeps et coquille d'œuf avec de l'éthanol à 70% pour éviter l'infection de l'embryon.
- Faites un petit trou sur l'œuf immédiatement au-dessus de la cellule d'air avec une paire de pince AA. Veillez à ne pas casser la coquille de l'oeuf. Retirer les morceaux de petits un à la fois de faire une petite fenêtre. Retirer délicatement la membrane interne en utilisant les forceps, sans toucher la membrane vitelline.
2. Injection et l'électroporation
- Pour éviter d'endommager le cerveau ou le cœur, la position de l'aiguille contre latéral du faisceau principal des vaisseaux sanguins pénètrent dans l'œil et pointant vers le bec.
- Pierce à travers la membrane vitelline, la sclérotique, la rétine et l'humeur vitrée par un doux poussée soudaine de l'aiguille. Si l'aiguille perce l'autre extrémité de l'œil, il devrait bien se passer si elle endommage une veine de sang importante.
- Tirez doucement l'aiguille sur le bord de l'ouverture et placez-le près de la tangente à la paroi extérieure du globe oculaire.
- Insert l'aiguille dans l'espace sous la rétine entre la sclérotique et la rétine.
- Injecter de l'ADN jusqu'à ce que vous pouvez visualiser la solution verte de remplissage du côté du globe oculaire et en poussant vers l'intérieur la rétine par la création d'un renflement.
- Si votre mise aiguille n'est pas correcte, alors vous verrez la solution d'ADN propager à l'intérieur du corps vitré en remplissant le milieu de la balle des yeux. Aussi, si vous endommager la rétine trop, vous verrez la solution d'ADN est venue hors du globe oculaire.
- Lentement retirer l'aiguille et placer immédiatement les électrodes en parallèle à l'intérieur de l'œuf après trempage dans du PBS. Poussez vers le bas les électrodes à plonger dans le liquide amniotique d'une manière telle sorte que l'œil injecté est situé entre les électrodes. Évitez de toucher un vaisseau sanguin important ou le cœur avec les électrodes en les plaçant. L'électrode négative devrait levera à le côté d'injection de telle sorte que l'ADN peut être transporté depuis l'espace rétinienne sous-programme dans la rétine en direction d'électrode positive. Electroporate la rétine avec 5 impulsions de 15V pour 50 ms avec des intervalles de 950 ms.
- Retirez délicatement les électrodes et sceller la fenêtre de l'œuf avec des morceaux de scotch clair.
- Étiquetez et datez l'œuf injecté avant de le remettre à l'incubateur. En règle générale, il faut environ 3 à 5 minutes pour compléter le processus d'électroporation ensemble.
- Expression de la GFP peut être vu dès 8 heures après l'électroporation. Cependant, vous pouvez attendre jusqu'à ce que l'embryon atteint le stade de croissance désiré avant la récolte.
3. Les résultats représentatifs
Dans notre étude, nous utilisons diverses constructions plasmidiques pour étudier la régulation de l'expression génique qui a impliqué le développement des cellules de la rétine. Dans cette vidéo pCAG-GFP (contrôle de transfection) a été utilisée pour suivre une injection réussie et l'électroporation. Toutefois, toute construction plasmidique avec gène rapporteur (la GFP, DP etc) peut être utilisé. Même si expression de la GFP peut être vu dès 8 heures après élémentsctroporation, nous avons généralement commencer à récolter les oeufs le jour 6 (E6) et au-delà. Électroporé rétines ont été disséqués de l'embryon et analysées sous microscope à dissection fluorescente avant inclusion et la coupe. En règle générale, l'expression du gène rapporteur peut être vu au moins un quart de la rétine après une électroporation efficace (figure 1). Les tissus rétiniens transfectées ont été analysés par le biais de sectionnement pour la visualisation claire des morphologies cellulaires. L'immunohistochimie utilisant des marqueurs de type cellule spécifique (Brn3a, Pax6 etc) a permis de caractériser l'expression spécifique des cellules GFP (figure 2).
Figure 1. Électroporation réussie de journaliste résultats expression de la GFP plasmide positif. Poulet embryonnaire rétines ont été injectés et une électroporation à jour embryonnaire 4 et récoltés à jour embryonnaire 6. Au moins 25% de la rétine a été avec succès transfectées (A view = Haut, BVue de dessous =). Échelle Bar = 1mm.
Figure 2. Caractérisation de la GFP exprimer cellules de la rétine à l'aide immunohistochimie. GFP exprimant les tissus rétiniens au stade E7 étaient fixes et sectionné. Ces sections ont ensuite été colorées avec des marqueurs cellulaires spécifiques. Brn3a a été utilisée pour déterminer cellules ganglionnaires (Un) tout en Pax6 a été utilisée pour déterminer horizontale, amacrines et les cellules ganglionnaires (chambres d'). Échelle = 50 microns.
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Discussion
Ciblée de la rétine et d'injection in ovo dans électroporation dans la rétine embryonnaire au stade E4 peut cibler spécifiquement les cellules progénitrices la rétine dues à la capacité de visualiser tous les six principaux types de cellules rétiniennes au niveau de la cellule unique. En électroporation in ovo à HH10 (~ E1.5) ciblant le vésicule optique est capable de transfecter des cellules qui se développent pour former l'œil. Cependant, ces cellules ont un chiffre d'affaires très élevé en ce moment et cette méthode n'est pas spécifique des cellules rétiniennes. Il se peut que le taux élevé de cellules chiffre d'affaires soutenue empêche l'expression stable. En E4, l'embryon est suffisamment développé que les grandes structures de l'œil sont tous formés, mais assez jeune que la majorité des cellules de la rétine sont des cellules souches rétiniennes encore. Cette méthode peut également être appliquée à gagner / perte d'études de fonction où un gène d'intérêt peut être ciblées pour étudier le développement normal et / ou d'une maladie de la rétine.
Après, nous avons publié cette technique dans notrearticle précédent 1, plusieurs scientifiques dans ce domaine nous a contacté pour plus d'assistance sur cette technique. Nous avons donc décidé de produire cette vidéo pour la visualisation. En outre, les progrès dans notre technique sont décrits dans cette vidéo.
Pour effectuer cette technique avec succès, à la suite des facteurs essentiels méritent d'être décrit.
Le facteur le plus critique est de placer l'aiguille précisément dans l'espace sous-rétinien. Tout d'abord, il faut faire attention à aligner l'aiguille contre-latéral du faisceau principal des vaisseaux sanguins pénètrent dans l'œil et pointant vers le bec. Cette position est presque parallèle au cœur et réduit le risque d'endommager le cerveau et le cœur. Lorsque vous percez à travers la membrane vitelline, la sclérotique, la rétine et l'humeur vitrée, l'aiguille ne doit pas voyager loin et percer une veine de sang. Si l'aiguille est assez nette, cela peut être fait très facilement avec les pratiques peu. L'étape suivante consiste à en tirant lentement en arrière e'aiguille e et il position à la bord de l'ouverture de la rétine. Il ya toujours une chance de le retirer complètement. Si cela devait arriver, alors on peut essayer à nouveau de mettre la pointe de l'aiguille de retour à l'ouverture. Placer l'aiguille dans l'espace sous-rétinien (entre la sclérotique et la rétine) exige de la pratique et de patience. Au début, il semble très difficile, mais avec une certaine pratique, il devient facile. Alors que l'injection de la solution d'ADN à l'intérieur de l'espace sous-rétinien, il est très important d'observer la formation renflement. Ensuite, la solution verte commence à se remplir le contour de l'œil, indiquant une injection réussie. Si la solution diffuse loin ou commence à se remplir dans le milieu de l'œil, qui indique une injection incorrecte, qui ne donnera pas une électroporation efficace.
Le deuxième facteur est la fabrication d'une aiguille optimale qui se fait via la chaleur tirant un tube capillaire en verre et casser la pointe. Aiguilles avec des bouts de grandes difficultés ont perçage through la membrane vitelline qui augmente le risque d'endommager la rétine. Habituellement conseils plus fortes aiguilles sont les meilleurs pour cette fin. Toutefois, l'aiguille avec des conseils très petites ont de la difficulté de chargement et la livraison de l'ADN et avoir la chance accrue de briser à l'intérieur du globe oculaire. Pour cette raison, nous faisons des aiguilles avec une ouverture à environ 0,1 m de diamètre et d'un cône de 20 mm 1. En outre, lors du chargement du mélange d'ADN à partir d'une goutte sur un morceau de parafilm, il est très important de ne pas charger le dernier bit de liquide, car cela augmente les chances d'obtenir de l'air intérieur de l'aiguille.
Enfin, en plaçant des électrodes est très critique pour atteindre l'électroporation réussie. Les électrodes devraient être placés en parallèle de telle sorte que l'œil en développement est situé entre les électrodes. Redoublez de prudence doivent être prises à partir de toucher les principaux vaisseaux sanguins ou le cœur avec les électrodes. Pas endommager ceux-ci peuvent entraîner la mort de l'embryon, même après un succès injectisur les. En outre, les deux yeux sont orientés différemment. Donc, il doit être gardé à l'esprit de changer l'orientation d'électrode (positif vs négatif) de telle sorte que l'électrode négative doit être toujours sur le côté d'injection pour permettre à la diffuse ADN dans les cellules rétiniennes dans le cadre du courant électrique.
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Disclosures
Toutes les expériences sur les animaux ont été approuvés par le soin des animaux et du Comité institutionnel des installations à l'Université Rutgers.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier M. Enver Maaz pour l'utilisation de son appareil photo HD (Cannon VIXIA HFS100). Ce travail a été soutenu en partie par des subventions des NIH (EY018738), New Jersey Commission sur la recherche sur la moelle épinière (08-3074-RCS-E-0 et 10-3091-RCS-E-0), et le Prix Busch recherche biomédicale.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fertilized pathogen-free (SPF) white leghorn chicken eggs | Sunrise Farms (Catskill, NY) | ||
| Chicken egg incubator | GQF Manufacturing | Model-1550 | Set to 60% humidity and 37.5°C. |
| Glass capillary tubes | World Precision Instruments, Inc. | TW150F-4 | |
| 0.1 ml syringe | Hamilton Co | Gastight 1710 | Alternatively 1ml syringe can be used as well |
| Masterflex Silicone (peroxide) Tubing | Cole-Parmer | HV-96400-13 | Cut a small piece (1 cm) for attaching the glass needle to the syringe |
| Tweezers | Dumont | AA | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments, Inc. | M3301-M3 | |
| Plasmid DNA | pCAG-GFP was borrowed from Dr. Connie Cepko | ||
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252 | Dilute it to 0.025 % with PBS |
| Pulse generator | Harvard Apparatus | BTX ECM 830 | Square wave generator |
| Electrodes | Harvard Apparatus | BTX model 514 | Our electrodes were spaced 3-5 mm apart |
| Monochrome Digital Camera | Carl Zeiss, Inc. | Axiocam MRM | |
| Fluorescent Dissection Microscope | Leica Microsystems | Leica MZ16FA | |
| Upright Fluorescence Microscope | Carl Zeiss, Inc. | Zeiss Axio Imager A1 |
References
- Doh, S. T. Analysis of retinal cell development in chick embryo by immunohistochemistry and in ovo electroporation techniques. BMC. Dev. Biol. 10, (2010).
- Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos. J. Vis. Exp. (9), e408-e408 (2007).
- Nakamura, H., Funahashi, J. Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation. Methods. 24, 43-48 (2001).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Dev. Dyn.. 195, 231-272 (1992).
- Hamburger, V. The stage series of the chick embryo. Dev. Dyn. 195, 273-275 (1992).
