Summary
L'obiettivo generale di questo video è quello di mostrare come eseguire l'iniezione mirata della retina e
Abstract
Retina embrionale di pollo è un ottimo strumento per studiare lo sviluppo della retina nei vertebrati superiori. Causa delle grandi dimensioni e sviluppo esterna, è comparativamente molto facile manipolare la retina embrionale pulcino usando ricombinante DNA / tecnologia RNA. Elettroporazione del DNA / RNA costrutti nella retina embrionale hanno un grande vantaggio per lo studio della retina regolazione genica in cellule staminali / progenitrici durante lo sviluppo della retina. Diverso tipo di saggi quali saggio gene reporter, genica sovra-espressione, gene abbattere (shRNA) ecc può essere eseguita utilizzando la tecnica elettroporazione. Questo video dimostra l'iniezione mirata della retina e in elettroporazione ovo nella retina pulcino embrionale alla Hamburger e Hamilton fase di 22-23, che è di circa 4 giorni embrionale (E4). Qui mostriamo una rapida e conveniente in tecnica elettroporazione ovo quale un DNA plasmide che esprime proteina verde fluorescente (GFP) come marcatore viene consegnato direttamente nelpulcino embrionale spazio sottoretinico e seguiti da impulsi elettrici per facilitare l'assorbimento del DNA da parte della retina cellule staminali / progenitrici. Il nuovo metodo di iniezione retinica ed elettroporazione presso E4 permette la visualizzazione di tutti i tipi di cellule retiniche, compreso il tardo-nato neuroni 1, che è stato difficile con il metodo convenzionale di iniezione ed elettroporazione a E1.5 2.
Protocol
Poiché alcune parti del protocollo vengono eseguiti come precedentemente descritto in altri video Jové 2 e testi 3 con modifica minore non parleremo quelli in dettaglio qui.
1. Egg manipolazione e preparazione Needle
- Le uova possono essere memorizzati in un wine cooler a circa 13 ° C per fino a 1 settimana. Se la temperatura è troppo alta, embrioni inizierà a sviluppare anormalmente, mentre più bassa temperatura provoca mortalità elevata. Una volta che siete pronti ad incubare togliere le uova dal raffreddamento di vino e impostare le uova in posizione verticale con l'estremità più grande up. Conservare le uova della temperatura ambiente per almeno 2 ore prima di metterli nel 37.5 ° C incubatore.
- Incubare le uova per 96-100 ore che è di circa 4 giorni embrionali per ottenere gli embrioni che sono alla Hamburger e lo stadio Hamilton 22 4-5.
- Preparare aghi micropipette da tubi di vetro tirato capillari e rompere la punta sotto un micro dissezionecampo di applicazione con una pinzetta per ottenere una apertura punta circa 0,1 micron di diametro e un cono 20 mm. Aghi con le grandi punte hanno difficoltà a perforare la membrana vitellina mentre i più piccoli hanno difficoltà a punte di carico e fornire la soluzione di DNA.
- Applicare l'ago da ml 0,1 siringhe Hamilton a tenuta di gas montato su un micromanipolatore. Usare un piccolo pezzo di tubo in silicone Masterplex per attaccare l'ago alla siringa. Dal momento che i collegamenti siano saldi non c'è bisogno di aggiungere olio minerale per suggellare questo allegato.
- Mix 2 pl di soluzione di DNA plasmide reporter con una concentrazione compresa 3-6 ug / pl e 0,2 pl di verde veloce (0,025%) su un pezzo di parafilm. Veloce colorante verde aiuterà a visualizzare l'iniezione. Lentamente, caricare l'ago con la miscela.
- Per liberare la membrana vitellina dalla membrana interna ruotare delicatamente l'uovo circa 180 ° e attendere per qualche minuto quindi ruotarlo in posizione originale e impostarlo per l'elettroporazione.
- Pulire la forceps e guscio d'uovo con il 70% di etanolo per evitare l'infezione per l'embrione.
- Fare un piccolo foro sul l'uovo immediatamente sopra la cella aria con un paio di dimensioni pinze AA. Fare attenzione a non rompere il guscio dell'uovo. Rimuovere piccoli pezzi uno alla volta per fare una piccola finestra. Rimuovere con cura la membrana interna utilizzando le pinze, senza toccare la membrana vitellina.
2. Iniezione ed elettroporazione
- Per evitare danni al cervello o, il cuore della posizione di contra 'ago lateralmente al fascio principale dei vasi sanguigni che entrano l'occhio e rivolta verso il becco.
- Pierce attraverso la membrana vitellina, sclera, retina e vitreo da una spinta improvvisa lieve dell'ago. Se l'ago perfora attraverso l'altra estremità dell'occhio essa dovrebbe essere alright meno che non danneggia qualsiasi vena principale sangue.
- Tiri indietro lentamente lo dell'ago al bordo dell'apertura e posizionarlo quasi tangente alla parete esterna del bulbo oculare.
- Insert l'ago nello spazio sub retinica tra la sclera e retina.
- Iniettare il DNA finché non sarà possibile visualizzare la soluzione verde riempire il lato del bulbo oculare e spingendo verso l'interno della retina creando un rigonfiamento.
- Se la vostra collocazione dell'ago non è corretta allora vedrete la soluzione di DNA diffusione all'interno del vitreo riempire il centro del bulbo oculare. Inoltre, se si danneggiare la retina troppo allora vedrete la soluzione di DNA è venuta fuori del bulbo oculare.
- Rimuovere lentamente l'ago e porre immediatamente gli elettrodi in parallelo dentro l'uovo dopo l'immersione in PBS. Spingere verso il basso gli elettrodi di immergerci il liquido amniotico in un modo in modo che l'occhio iniettato si trova tra gli elettrodi. Evitare di toccare qualsiasi nave importante il sangue o il cuore con gli elettrodi, mentre per questi ultimi. L'elettrodo negativo dovrebbe essere al lato iniezione in modo che il DNA può essere trasportato da sub spazio retinica nella retina verso elettrodo positivo. Electroincorporare l'retina con 5 impulsi di 15V per 50 ms, con intervalli di 950 ms.
- Rimuovere con cura gli elettrodi e sigillare la finestra delle uova con pezzi di nastro adesivo trasparente.
- Etichetta e data l'uovo iniettato prima di riporlo per l'incubatrice. Tipicamente, ci vogliono circa 3 a 5 minuti per completare l'intero processo elettroporazione.
- Espressione GFP può essere visto come precoce da 8 ore dalla elettroporazione. Tuttavia, è possibile attendere che l'embrione raggiunge lo stadio desiderato prima della raccolta.
3. Risultati rappresentativi
Nel nostro studio, usiamo vari costrutti plasmidici per studiare la regolazione dell'espressione genica che ha coinvolto lo sviluppo delle cellule della retina. In questo video pCAG-GFP (controllo trasfezione) è stato usato per seguire una iniezione di successo e elettroporazione. Tuttavia, qualsiasi costrutto plasmidico con gene reporter (GFP, RFP ecc) può essere utilizzato. Anche se l'espressione GFP può essere visto a partire da 8 ore dopo l'electroporation, di solito la raccolta inizia l'uovo il giorno 6 (E6) e poi. Elettroporate retine sono stati sezionati fuori dell'embrione e analizzato al microscopio a fluorescenza dissezione prima di incasso e di sezionamento. Tipicamente, espressione genica reporter può essere visto almeno in un quarto della retina dopo una elettroporazione di successo (Fig. 1). I tessuti della retina transfettate sono stati ulteriormente analizzati attraverso il sezionamento per la visualizzazione chiara delle morfologie cellulari. Immunoistochimica utilizzando marcatori di tipo specifico di cellule (Brn3a, Pax6 ecc) ha permesso la caratterizzazione delle cellule GFP-specifica espressione (Fig. 2).
Figura 1. Elettroporazione successo di plasmide reporter GFP risultati positivi. Pollo embrionale retine sono state iniettate ed elettroporati al giorno embrionale 4 e raccolte al giorno embrionale 6. Almeno il 25% della retina con successo trasfettata (A = Vista dall'alto, B= Vista dal basso). Scale Bar = 1mm.
Figura 2. Caratterizzazione di GFP esprimere cellule della retina mediante immunoistochimica. GFP esprimere tessuti retinici in fase E7 sono stati fissati e sezionati. Queste sezioni sono state poi colorate con vari marcatori cellulari specifici. Brn3a è stato utilizzato per determinare cellule gangliari (A), mentre Pax6 è stato utilizzato per determinare orizzontali, amacrine e le cellule gangliari (B). Scala bar = 50 micron.
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Discussion
L'iniezione mirata della retina e in elettroporazione ovo in retina embrionale allo stadio E4 possono specificatamente colpire le cellule progenitrici della retina conseguente la capacità di visualizzare tutti e sei i principali tipi di cellule della retina a livello di singola cellula. In elettroporazione ovo a HH10 (~ E1.5) rivolte alla vescicola ottica è in grado di trasfettare cellule che si sviluppano a formare l'occhio. Tuttavia, queste cellule hanno un fatturato molto elevato in questo momento e questo metodo non è specifico per cellule retiniche. Può darsi che l'elevato tasso di turn-over cellulare impedisce sostenuta espressione stabile. Entro E4, l'embrione è sviluppato abbastanza che le strutture principali del dell'occhio sono tutte formate ma abbastanza giovane che la maggioranza delle cellule nella retina sono cellule staminali ancora retiniche. Questo metodo può essere applicato anche per guadagnare / perdita di studi di funzione dove un gene di interesse può essere mirati per studiare sviluppo normale e / o malattia della retina.
Dopo aver pubblicato questa tecnica nel nostroprecedente articolo 1, diversi scienziati in questo campo ci ha contattato per ulteriori informazioni su questa tecnica. Così abbiamo deciso di produrre questo video per la visualizzazione. Inoltre, i progressi della nostra tecnica sono descritte in questo video.
Per eseguire questa tecnica con successo, a seguito di fattori critici vale la pena descrivere.
Il fattore più critico è per posizionare l'ago precisamente nello spazio sottoretinico. In primo luogo, bisogna stare attenti ad allineare l'ago contra-laterale al fascio principale dei vasi sanguigni che entrano l'occhio e rivolta verso il becco. Questa posizione è quasi parallela al cuore e riduce la possibilità di danneggiare il cervello e il cuore. Quando penetra attraverso la membrana vitellina, sclera, retina e vitreo, l'ago non deve viaggiare in lungo e Pierce attraverso qualsiasi vena di sangue. Se l'ago non sia troppo allora questo può essere fatto molto facilmente con poche pratiche. Il passo successivo è quello di lentamente tirando indietro °e spillo e posizione esso al bordo dell'apertura della retina. C'è sempre la possibilità di tirare fuori completamente. Se ciò dovesse accadere, allora si può provare di nuovo a mettere la punta dell'ago indietro l'apertura. Posizionamento dell'ago nello spazio sottoretinico (tra sclera e la retina) richiede pratica e pazienza. All'inizio, sembra molto difficile, ma con un pò di pratica diventa facile. Mentre iniettando la soluzione DNA all'interno dello spazio sottoretinico, è molto importante per osservare la formazione rigonfiamento. Successivamente, la soluzione verde comincia a riempirsi il contorno dell'occhio, indicando una iniezione di successo. Se la soluzione diffonde lontano o comincia a riempirsi in mezzo dell'occhio, che indica una iniezione errato che non produrrà un elettroporazione di successo.
Il secondo fattore è la fabbricazione di un ago ottimale che è fatta tramite calore-tirando un tubo capillare di vetro e rompendo la punta. Aghi con punte di grandi dimensioni hanno difficoltà Piercing through la membrana vitellina, che aumenta la possibilità di danneggiare la retina. Di solito punte più acuti aghi sono i migliori per questo scopo. Tuttavia, l'ago con punte molto piccoli hanno difficoltà a caricare e consegnare il DNA ed hanno maggiore possibilità di abbattere all'interno del bulbo oculare. Per questo motivo facciamo aghi con un'apertura a circa 0,1 micron di diametro e un cono 20 mm 1. Inoltre, durante il caricamento la miscela DNA da un droplet su un pezzo di parafilm, è molto importante non caricare l'ultimo bit di liquido in quanto aumenta le probabilità di ottenere aria all'interno dell'ago.
Infine, ponendo degli elettrodi è molto critica per conseguire elettroporazione successo. Gli elettrodi devono essere collocati in parallelo in modo che l'occhio di sviluppo è situato tra gli elettrodi. Prestare la massima attenzione dovrebbe essere presa dal toccare le principali vasi sanguigni o il cuore con gli elettrodi. Danneggiare uno di questi può provocare la morte per l'embrione, anche dopo un successo injectisu. Inoltre, i due occhi sono diversamente orientati. Così, deve essere tenuto nella mente modificare l'orientamento elettrodo (positivo vs negativo) in modo che l'elettrodo negativo dovrebbe essere sempre al lato iniezione per consentire l'diffusa DNA nelle cellule retiniche sotto la corrente elettrica.
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Disclosures
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal Animal Care Comitato Istituzionale e Servizi alla Rutgers University.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare il Sig. Maaz Enver per l'utilizzo della sua macchina fotografica HD (Cannon VIXIA HFS100). Questo lavoro è stato sostenuto in parte da sovvenzioni dal NIH (EY018738), New Jersey Commissione per la ricerca del Midollo Spinale (08-3074-SCR-E-0 e 10-3091-SCR-E-0), e Busch Award Ricerca Biomedica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fertilized pathogen-free (SPF) white leghorn chicken eggs | Sunrise Farms (Catskill, NY) | ||
| Chicken egg incubator | GQF Manufacturing | Model-1550 | Set to 60% humidity and 37.5°C. |
| Glass capillary tubes | World Precision Instruments, Inc. | TW150F-4 | |
| 0.1 ml syringe | Hamilton Co | Gastight 1710 | Alternatively 1ml syringe can be used as well |
| Masterflex Silicone (peroxide) Tubing | Cole-Parmer | HV-96400-13 | Cut a small piece (1 cm) for attaching the glass needle to the syringe |
| Tweezers | Dumont | AA | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments, Inc. | M3301-M3 | |
| Plasmid DNA | pCAG-GFP was borrowed from Dr. Connie Cepko | ||
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252 | Dilute it to 0.025 % with PBS |
| Pulse generator | Harvard Apparatus | BTX ECM 830 | Square wave generator |
| Electrodes | Harvard Apparatus | BTX model 514 | Our electrodes were spaced 3-5 mm apart |
| Monochrome Digital Camera | Carl Zeiss, Inc. | Axiocam MRM | |
| Fluorescent Dissection Microscope | Leica Microsystems | Leica MZ16FA | |
| Upright Fluorescence Microscope | Carl Zeiss, Inc. | Zeiss Axio Imager A1 |
References
- Doh, S. T. Analysis of retinal cell development in chick embryo by immunohistochemistry and in ovo electroporation techniques. BMC. Dev. Biol. 10, (2010).
- Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos. J. Vis. Exp. (9), e408-e408 (2007).
- Nakamura, H., Funahashi, J. Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation. Methods. 24, 43-48 (2001).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Dev. Dyn.. 195, 231-272 (1992).
- Hamburger, V. The stage series of the chick embryo. Dev. Dyn. 195, 273-275 (1992).
