Summary
الهدف العام من هذا الفيديو هو إظهار كيفية تنفيذ حقن الشبكية المستهدفة و
Abstract
شبكية العين الدجاج الجنينية هو أداة ممتازة لدراسة تطوير شبكية العين في الفقاريات العليا. بسبب الحجم الكبير والتنمية الخارجية، فمن السهل جدا نسبيا لمعالجة شبكية العين كتكوت الجنينية باستخدام المؤتلف DNA / RNA التكنولوجيا. Electroporation من الحمض النووي / الحمض النووي الريبي في البنى الشبكية الجنينية تتمتع بميزة كبيرة لدراسة تنظيم الجينات في الخلايا الجذعية / السلف في شبكية العين خلال تطوير شبكية العين. لا يمكن أن يؤديها نوع مختلف من فحوصات مثل فحص الجينات المراسل، جين الافراط في التعبير، والجينات بهدم (shRNA) وما إلى ذلك باستخدام تقنية electroporation. هذا الفيديو يشرح حقن في شبكية العين، واستهدفت في electroporation البيضة في شبكية العين كتكوت الجنينية في هامبورغ وهاملتون مرحلة 22-23، وهي عبارة عن يوم الجنينية 4 (E4). هنا نعرض سريعة ومريحة في تقنية electroporation البيضة حيث يتم تسليمها مباشرة البلازميد التي تعبر عن بروتين الفلورية الخضراء (GFP) كعلامة فيكتكوت الجنينية الفضاء تحت الشبكية وتليها نبضات كهربائية لتسهيل امتصاص الحمض النووي عن طريق الخلايا الجذعية / السلف في شبكية العين. طريقة جديدة للحقن في شبكية العين وelectroporation في E4 يسمح التصور من جميع أنواع الخلايا في شبكية العين، بما في ذلك الخلايا العصبية في وقت متأخر من مواليد 1، والتي كان من الصعب مع الأسلوب التقليدي للحقن وelectroporation في E1.5 2.
Protocol
منذ يتم تنفيذ بعض أجزاء من بروتوكول كما هو موضح سابقا في أشرطة الفيديو وغيرها [جوف] 2 و 3 ورقات مع تعديلات طفيفة لن نناقش هذه بالتفصيل هنا.
1. التعامل مع البيض وتحضير الإبرة
- ويمكن تخزين البيض في النبيذ برودة في درجة مئوية حوالي 13 لمدة تصل إلى 1 في الاسبوع. إذا كانت درجة الحرارة مرتفعة جدا، وسوف تبدأ الأجنة لوضع غير طبيعي، في حين أن انخفاض درجة الحرارة يؤدي ارتفاع معدل الوفيات. ذات مرة كنت على استعداد لاحتضان اخراج البيض من برودة النبيذ ووضع البيض عموديا مع أكبر في نهاية المطاف. الحفاظ على البيض في درجة حرارة الغرفة لمدة لا تقل عن 2 ساعة قبل وضعها في الحاضنة 37.5 درجة مئوية.
- احتضان البيض ل96-100 ساعة وهي عبارة عن يوم الجنينية 4 للحصول على الأجنة التي هي في هامبورغ وهاميلتون 22 مرحلة 4-5.
- تعد الإبر micropipette من أنابيب زجاجية وسحبت شعري وكسر طرف في إطار الجزئي تشريحالنطاق مع ملاقط للحصول على افتتاح قمة حوالي 0.1 ميكرون في القطر، وتفتق 20 ملم. الإبر مع أكبر نصائح يجدون صعوبة في اختراق الغشاء المحي في حين أن أصغر نصائح يجدون صعوبة في التحميل وتقديم حل الحمض النووي.
- إرفاق الإبرة إلى 0.1 مل حقنة Gastight هاملتون التي شنت على micromanipulator. استخدام قطعة صغيرة من أنبوب السيليكون Masterplex لربط الإبرة إلى حقنة. منذ اتصالات ضيقة لا حاجة لإضافة الزيوت المعدنية لاغلاق هذا المرفق.
- خلط 2 ميكرولتر من حل مراسل البلازميد مع تركيز تتراوح 3-6 ميكروغرام / ميكروليتر و 0.2 ميكرو لتر من أخضر سريع (0.025٪) على قطعة من parafilm. سوف سريع الخضراء صبغ تساعد على تصور الحقن. ببطء، تحميل إبرة مع الخليط.
- لتحرير الغشاء المحي من الغشاء الداخلي تدوير البيض بلطف نحو 180 درجة، وانتظر بضع دقائق ثم تناوب على العودة الى الموقف الأصلي وضعه لelectroporation.
- مسح forcالعائد على السهم والبيض قذيفة مع الايثانول 70٪ لتجنب العدوى إلى الجنين.
- جعل ثقب صغير في البويضة مباشرة فوق الخلية الهواء مع زوج من حجم AA ملقط. يجب الحرص على عدم كسر قشرة البيضة. إزالة قطع صغيرة في وقت واحد لجعل نافذة صغيرة. إزالة الغشاء الداخلي بعناية باستخدام ملقط دون لمس الغشاء المحي.
2. الحقن وElectroporation
- لمنع تلف في الدماغ أو القلب، وموقف مضاد إبرة الوحشي على حزمة رئيسية من الأوعية الدموية التي تدخل العين ومشيرا نحو منقار.
- بيرس من خلال الغشاء المحي، الصلبة، شبكية العين والفكاهة زجاجي بواسطة الضغط معتدل المفاجئ للإبرة. إذا كانت إبرة يثقب من خلال الطرف الآخر من العين يجب أن تكون على ما يرام ما لم يضر أي وريد الدم الرئيسية.
- سحب ببطء مرة أخرى الإبرة على حافة فتح ووضعه المماس تقريبا على الجدار الخارجي من مقلة العين.
- Inserتي الإبرة في الفضاء في شبكية العين الفرعية بين الصلبة والشبكية.
- حقن الحمض النووي حتى تتمكن من تصور حل أخضر سد جانب من مقلة العين، ودفع إلى الداخل شبكية العين عن طريق إنشاء انتفاخ.
- إذا الطرح الخاص إبرة لا يصح عندئذ سترى الحل الحمض النووي الانتشار داخل النكتة زجاجي يملأ وسط كرة العين. أيضا، إذا كنت تلف شبكية العين أكثر من اللازم بعد ذلك سوف ترى حل الحمض النووي هو الخروج من مقلة العين.
- إزالة الإبرة ببطء ووضعها فورا الأقطاب في مواز داخل البويضة بعد تمرغ في برنامج تلفزيوني. دفع بانخفاض الأقطاب إلى غمر في السائل الذي يحيط بالجنين في طريقة بحيث يقع في العين حقن بين الأقطاب الكهربائية. تجنب لمس أي الأوعية الدموية الكبرى أو القلب مع الأقطاب في حين وضعها. ينبغي أن يكون من القطب السالب إلى جانب حقن بحيث يمكن نقل هذا الحمض النووي من مساحة الشبكية الفرعية في شبكية العين باتجاه القطب الموجب. كهرباءporate الشبكية مع 5 نبضات من 15V لمدة 50 مللي مع فترات MS 950.
- إزالة بعناية الأقطاب وختم نافذة من البيض مع قطعة من لاصق شفاف واضح.
- التسمية وحتى الآن حقن البويضة قبل إعادته إلى الحاضنة. عادة، يستغرق حوالي 3 إلى 5 دقائق لإتمام عملية electroporation كله.
- ويمكن رؤية GFP التعبير في أقرب وقت بعد 8 ساعات electroporation. ومع ذلك، قد تنتظر حتى يصل إلى مرحلة الجنين المطلوب قبل الحصاد.
3. ممثل النتائج
في دراستنا، ونحن نستخدم بنيات بلازميد مختلفة لدراسة تنظيم التعبير الجيني التي تنطوي على تطوير خلية شبكية العين. في هذا الفيديو تم استخدام pCAG-GFP (مراقبة ترنسفكأيشن) لمتابعة حقن ناجحة وelectroporation. ومع ذلك، يمكن استخدام أي بناء البلازميد مع الجينات مراسل (GFP، طلب تقديم العروض وغيرها). ويمكن أن ينظر إليه على الرغم من GFP التعبير في أقرب وقت 8 ساعات بعد ايلىctroporation، ونحن عادة ما تبدأ حصاد البيض في يوم 6 (E6) وما بعده. تم تشريح Electroporated شبكية العين من الجنين وتحليلها تحت مجهر تشريح فلوري قبل دمج وباجتزاء. عادة، يمكن أن ينظر مراسل التعبير الجيني في ما لا يقل عن ربع شبكية العين بعد electroporation الناجحة (الشكل رقم 1). وقد تم تحليل مزيد من أنسجة الشبكية من خلال transfected باجتزاء لتصور واضح للmorphologies الخلية. المناعية باستخدام علامات نوع من الخلايا المحددة (Brn3a، Pax6 الخ) توصيف سمح التعبير GFP خلية محددة (الشكل رقم 2).
الشكل 1. تم حقن electroporation ناجحة للتعبير مراسل نتائج إيجابية GFP البلازميد. الدجاج الجنينية شبكية العين وelectroporated في يوم الجنينية (4) وتحصد في يوم الجنينية 6. وكان transfected بنجاح ما لا يقل عن 25٪ من شبكية العين (وجهة نظر = الأعلى، B= عرض القاع). جدول المحامين = 1MM.
الشكل 2. توصيف GFP معربا عن خلايا الشبكية باستخدام المناعية. GFP معربا عن الأنسجة الشبكية في E7 مرحلة كانت ثابتة ومقطوع. ثم تم صبغ هذه المقاطع مع علامات خلية مختلف محددة. وقد استخدم Brn3a لتحديد خلايا العقدة (أ) في حين كان يستخدم لتحديد Pax6 أفقي، عديم الاستطالات وخلايا العقدة (B). شريط النطاق = 50 ميكرون.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
استهدفت حقن في شبكية العين وelectroporation البيضة في شبكية العين في المرحلة الجنينية E4 يمكن أن تستهدف على وجه التحديد الخلايا الاصلية في شبكية العين مما يؤدي إلى القدرة على تصور كل خلية شبكية العين 6 أنواع رئيسية على مستوى خلية واحدة. في electroporation البيضة في HH10 (~ E1.5) التي تستهدف الحويصلة البصرية قادرة على transfect الخلايا التي تضع لتشكيل العين. ومع ذلك، وهذه الخلايا لها دوران عالية جدا في هذا الوقت وهذه الطريقة ليست محددة لخلايا الشبكية. قد يكون من أن ارتفاع معدل دوران خلية يمنع التعبير مستقرة مستمرة. بواسطة E4، يتم وضع الجنين يكفي أن يتم تشكيل جميع الهياكل الرئيسية للعين ولكن الشباب ما يكفي من أن غالبية الخلايا في شبكية العين والخلايا الجذعية لا يزال في شبكية العين. ويمكن أيضا أن هذه الطريقة يمكن تطبيقها على الربح / الخسارة من الدراسات وظيفة حيث يمكن استهداف الجين من اهتمام لدراسة التطور الطبيعي و / أو مرض في شبكية العين.
بعد نشرنا هذه التقنية في منطقتناورقة السابق 1، اتصل عدد من العلماء في هذا المجال لنا لمزيد من المساعدة في هذه التقنية. لذلك قررنا إنتاج هذا الفيديو عن التصور. وبالإضافة إلى ذلك، يتم وصف التطورات في تقنية لدينا في هذا الفيديو.
لتنفيذ هذه التقنية بنجاح، والعوامل الحاسمة في أعقاب تستحق وصف.
العامل الأكثر أهمية هو وضع الإبرة على وجه التحديد في الفضاء تحت الشبكية. أولا، يحتاج المرء أن يكون حذرا لتحقيق المواءمة بين إبرة مضاد الوحشي على حزمة رئيسية من الأوعية الدموية التي تدخل العين ومشيرا نحو منقار. هذا الموقف هو مواز تقريبا للقلب، ويقلل من فرصة لتلف في الدماغ والقلب. عندما اختراق من خلال غشاء المحي، الصلبة، شبكية العين والفكاهة زجاجي، ينبغي أن إبرة ليس السفر بعيدا، وبيرس من خلال أي وريد الدم. إذا كانت إبرة حادة بما فيه الكفاية ومن ثم يمكن القيام بذلك بسهولة جدا مع الممارسات قليلة. الخطوة التالية هي لسحب ببطء مرة الرابعةإبرة ه وضعه على حافة افتتاح شبكية العين. هناك دائما فرصة لتخلعها تماما. إذا كان ذلك يجب أن يحدث، ثم يمكن للمرء أن المحاولة مرة أخرى لوضع طرف الإبرة مرة أخرى في الجلسة الافتتاحية. وضع إبرة في الفضاء تحت الشبكية (ما بين الصلبة والشبكية) يتطلب الممارسة والصبر. في البداية، ويبدو من الصعب جدا، ولكن مع بعض الممارسة يصبح من السهل. في حين حقن محلول الحمض النووي داخل الفضاء تحت الشبكية، من المهم جدا لمراقبة تشكيل انتفاخ. بعد ذلك، والحل يبدأ أخضر ملء الخطوط العريضة للعين، مما يدل على نجاح الحقن. إذا كان هذا الحل بعيدا أو ينشر يبدأ تعبئة في وسط العين، وهذا يدل على وجود حقن غير صحيحة والتي لن تسفر عن electroporation ناجحة.
والعامل الثاني هو تلفيق من إبرة المثلى التي تتم عن طريق الحرارة سحب أنبوب زجاجي الشعرية وكسر طرف. الإبر مع نصائح كبير صعوبة في اختراق عبتيough الغشاء المحي الذي يزيد من فرصة للإتلاف شبكية العين. عادة نصائح أكبر إبرة هي الأفضل لهذا الغرض. ومع ذلك، إبرة مع نصائح صغيرة جدا صعوبة في تحميل وتسليم الحمض النووي ولها فرصة أكبر لكسر داخل مقلة العين. لهذا السبب نحن جعل الإبر مع افتتاح قمة في حوالي 0.1 ميكرون في القطر، وتفتق 20 مم 1. أيضا، أثناء تحميل مزيج من الحمض النووي من قطرة على قطعة من parafilm، من المهم جدا عدم تحميل الجزء الأخير من السائل كما أنه يزيد من فرص الحصول على الهواء داخل إبرة.
أخيرا، ووضع من الأقطاب الكهربائية حرج للغاية لتحقيق electroporation ناجحة. ينبغي أن توضع الأقطاب في مواز بحيث تقع العين النامية بين الأقطاب. وينبغي اتخاذ الحذر من لمس أي الأوعية الدموية الرئيسية أو القلب مع الأقطاب. قد تضر أي من هذه يؤدي إلى وفاة الجنين حتى بعد injecti ناجحفي. وعلاوة على ذلك، والعيون هما الموجهة بشكل مختلف. لذا، لا بد من أخذها في الحسبان لتغيير اتجاه القطب (إيجابية مقابل سلبي) بحيث القطب السالب يجب أن تكون دائما في الجانب حقن للسماح للمنتشر الحمض النووي في خلايا الشبكية تحت التيار الكهربائي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وقد وافق كل من التجارب على الحيوانات من قبل رعاية الحيوانات المؤسسية واللجنة المرافق في جامعة روتجرز.
Acknowledgments
نود أن نشكر السيد معاذ أنور لاستخدام كاميرا HD له (كانون VIXIA HFS100). وأيد هذا العمل في جزء من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (EY018738)، نيو جيرسي جنة البحوث الحبل الشوكي (08-3074-SCR-E-0 و 10-3091-SCR-0-E)، وبوش جائزة بحوث الطبية الحيوية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fertilized pathogen-free (SPF) white leghorn chicken eggs | Sunrise Farms (Catskill, NY) | ||
| Chicken egg incubator | GQF Manufacturing | Model-1550 | Set to 60% humidity and 37.5°C. |
| Glass capillary tubes | World Precision Instruments, Inc. | TW150F-4 | |
| 0.1 ml syringe | Hamilton Co | Gastight 1710 | Alternatively 1ml syringe can be used as well |
| Masterflex Silicone (peroxide) Tubing | Cole-Parmer | HV-96400-13 | Cut a small piece (1 cm) for attaching the glass needle to the syringe |
| Tweezers | Dumont | AA | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments, Inc. | M3301-M3 | |
| Plasmid DNA | pCAG-GFP was borrowed from Dr. Connie Cepko | ||
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252 | Dilute it to 0.025 % with PBS |
| Pulse generator | Harvard Apparatus | BTX ECM 830 | Square wave generator |
| Electrodes | Harvard Apparatus | BTX model 514 | Our electrodes were spaced 3-5 mm apart |
| Monochrome Digital Camera | Carl Zeiss, Inc. | Axiocam MRM | |
| Fluorescent Dissection Microscope | Leica Microsystems | Leica MZ16FA | |
| Upright Fluorescence Microscope | Carl Zeiss, Inc. | Zeiss Axio Imager A1 |
References
- Doh, S. T. Analysis of retinal cell development in chick embryo by immunohistochemistry and in ovo electroporation techniques. BMC. Dev. Biol. 10, (2010).
- Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos. J. Vis. Exp. (9), e408-e408 (2007).
- Nakamura, H., Funahashi, J. Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation. Methods. 24, 43-48 (2001).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Dev. Dyn.. 195, 231-272 (1992).
- Hamburger, V. The stage series of the chick embryo. Dev. Dyn. 195, 273-275 (1992).
