Summary
このビデオの全体的な目標は、対象と網膜の注入を実行する方法を示すことであると
Abstract
ニワトリ胚網膜は高等脊椎動物の網膜の開発を研究する優れたツールです。ので、大きいサイズと、外部の開発に、それは、組換えDNA / RNA技術を用いたニワトリ胚網膜を操作するために比較的非常に簡単です。胚の網膜へのDNA / RNAの構造のエレクトロポレーションは、網膜の開発時に網膜幹細胞/前駆細胞の遺伝子調節を研究するための大きな利点を持っています。このようなレポーター遺伝子アッセイ、過剰発現、遺伝子等（shRNA）をノックダウンする遺伝子としてアッセイの異なるタイプのエレクトロポレーション技術を用いて行うことができます。このビデオは、対象となる網膜の注入およびOVOエレクトロポレーションのハンバーガーで、ニワトリ胚の網膜に、胚4日目（E4）であるハミルトンのステージ22から23を示しています。マーカーとして緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現するプラスミドDNAを直接に配信されることにより、ここでは、OVOエレクトロポレーション技術で 、迅速かつ便利を表示ニワトリ胚網膜下腔、網膜幹細胞/前駆細胞によるDNAの取り込みを容易にするために、電気パルスが続く。 E4で網膜注入とエレクトロポレーションの新しいメソッドは、E1.5 2で注入し、エレクトロポレーションの従来の方法では困難であった後半生まれのニューロン1、を含む、すべての網膜細胞の種類、可視化することができます。
Protocol
以前にマイナーな変更で他のJoveのビデオ2、論文3に記載のプロトコルのいくつかの部分が実行されているので、ここでは詳細にそれらについては説明しません。
1。卵処理と針の準備
- 卵は、最大1週間に約13°Cの時にクーラーワインに格納することができます。温度が高すぎる場合、より低い温度は、高い死亡率を引き起こす一方で、胚は、異常に開発を開始します。一度ワインクーラーから卵を取り出して、大きい方の端に垂直に卵を設定してインキュベートする準備が整いました。 37.5℃のインキュベーターに入れ前に、少なくとも2時間室温で卵を保持します。
- ハンバーガーとハミルトンステージ22 4から5である胚を取得するために胚の4日目は約96から100時間の卵をインキュベートします。
- 引っ張らガラスキャピラリーチューブからマイクロピペットの針を準備し、解剖マイクロ下に先端を破る直径と20mmのテーパーは0.1μm程度の先端の開口部を得るためにピンセットを持つスコープ。大きなヒントと針が困難な小規模のヒントはDNA溶液をロードして提供する難しさを持っていながら、卵黄膜を貫通しています。
- マイクロマニピュレータに取り付けられた0.1ミリリットルハミルトンガス密閉シリンジに針を取り付けます。注射器に針を取り付けるためのMasterplexシリコンチューブの小片を使用しています。接続がタイトなこの添付ファイルを密封するためにミネラルオイルを追加する必要はありませんので。
- 3から6μg/μLのとパラフィルム片の高速グリーン（0.025％）0.2μlの範囲の濃度でレポータープラスミドDNA溶液2μlを混ぜます。ファストグリーン色素が注入を視覚化するのに役立ちます。徐々に、混合物で針をロードします。
- 内膜から卵黄膜を解放するために約180そっと卵を°回転し、元の位置に戻ってそれを回転させ、エレクトロポレーションのためにそれをセットして数分待つ。
- ゲストフォースドバイを拭く胚への感染を避けるために、70％エタノールでEPSと卵の殻。
- すぐにサイズのAAピンセットのペアを持つ空気電池上記の卵に小さな穴を作成します。卵の殻を破ることがないように注意してください。小さな小窓を作るために一つずつ削除します。慎重に卵黄膜に触れずに鉗子を用いて内膜を除去します。
2。注射とエレクトロ
- 脳や心臓の損傷を防ぐために、血管が目に入ると、くちばしに向かって指しているのメインバンドルの横針コントラ配置します。
- 針の突然の穏やかなプッシュによって卵黄膜、強膜、網膜と硝子体を貫く。針が目のもう一方の端を突き抜けている場合は、任意の主要な血液の静脈を傷つけない限りは大丈夫でなければなりません。
- 徐々に開口部の端に針を引き戻すと、眼球の外側の壁にはほぼ接線に配置します。
- 差し込み、トン強膜と網膜の間にサブ網膜スペースに針。
- あなたが眼球の側を充填し、膨らみを作成することによって、網膜の内側を押して緑色の溶液を可視化できるようになるまでのDNAを注入します。
- あなたの針の打込みが正しくない場合、あなたは眼球の中間を埋める硝子体内部に拡散したDNA溶液が表示されます。あなたがあまりにも多くの網膜が損傷した場合にも、その後、DNA溶液は、眼球から出てくるが表示されます。
- 徐々に針を除去し、直ちにPBSに浸漬した後に卵の内部で並列に電極を配置します。注入された目が電極間に配置されるようにように、羊水に沈めるに電極を押し下げます。それらを配置しながら、電極とすべての主要な血管や心臓には触れないでください。そのDNAはサブ網膜スペースから正極に向かって網膜に輸送できるように、負極は、注入側でなければなりません。エレクトロ950ミリ秒間隔で50ミリ秒間15Vの5パルスで網膜をporate。
- 慎重に電極を除去し、透明なセロハンテープの部分と卵の窓をシールします。
- ラベルとインキュベーターに戻し入れる前に注入された卵日付を記入してください。一般的に、それは全体のエレクトロポレーションプロセスを完了するために約3〜5分かかります。
- GFPの発現は、エレクトロポレーション後8時間には早くも見ることができます。胚は収穫前に、必要な段階に達するまで、ただし、待つことがあります。
3。代表的な結果
私たちの研究では、網膜細胞の開発に関与する遺伝子発現の調節を研究するために様々なプラスミドコンストラクトを使用しています。このビデオでpCAG-GFP（トランスフェクションコントロール）が成功した注入とエレクトロポレーションに従うように使用されていました。しかし、レポーター遺伝子（GFP、RFPなど）を持つ任意のプラスミドコンストラクトを使用することができます。 GFPの発現はELE 8時間後には早くも見ることができるにもかかわらずctroporation、我々は、通常、6日目（E6）と以降の卵を収穫を開始します。エレクトロポレーションの網膜は、胚の切り出しと埋め込みとセクショニングの前に蛍光解剖顕微鏡下で分析した。一般的に、レポーター遺伝子の発現が成功したエレクトロポレーション（図1）後、少なくとも網膜の四半期で見ることができます。トランスフェクトされた網膜組織はさらに、細胞の形態を明確に可視化するために切片を介して分析した。細胞型特異的なマーカーを用いた免疫組織化学（Brn3a、Pax6の等）を細胞特異的GFP発現の許容特性（図2）。
図1。レポータープラスミド結果正のGFP発現の成功したエレクトロポレーション。ニワトリ胚網膜を注入し、エレクトロポレーション胚の4日目に、胚6日目に収穫しました。網膜の少なくとも25％が正常にトランスフェクトした（=トップビュー、B=ボトムビュー）。スケールバー= 1ミリメートル。
図2。免疫組織化学を用いた網膜細胞を発現しているGFPの特性。GFP E7段階で網膜組織を表現するには、固定と切片。これらのセクションは、さまざまな細胞特異的マーカーで染色した。 Brn3aはPax6のは水平、アマクリンおよび神経節細胞（B）を決定するために使用している間に神経節細胞（）を決定するために使用されていました。スケールバー=50μmである。
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Discussion
網膜の注入を対象とE4段階での胚の網膜でのOVOエレクトロポレーションでは特に単一細胞レベルでのすべての6つの主要な網膜細胞型を視覚化する能力が得網膜前駆細胞をターゲットにすることができます。OVOエレクトロポレーションでターゲティングHH10（〜E1.5）で眼胞は眼を形成するために開発した細胞をトランスフェクトすることができます。しかし、これらの細胞はこの時点で非常に高い離職率を持っており、このメソッドは、網膜の細胞に特異的ではありません。これは、高細胞のターンオーバー率は持続的な安定した発現を防ぐことができている可能性があります。 E4で、胚は、目の主要な構造が形成されたすべてが網膜の細胞の大部分はまだ網膜幹細胞であることを十分に若いされていることを十分に開発されています。また、この方法は、目的の遺伝子が網膜の正常な発達および/または疾患を研究するために対象とすることができ、関数の研究/損失を得るために適用することができます。
私たちはこのテクニックを公開した後、以前の紙1は 、この分野でいくつかの科学者たちは、このテクニックでそれ以上の援助のために私達に連絡した。だから我々は可視化のためにこのビデオを制作することを決めた。加えて、我々の技術の進歩は、このビデオで説明されています。
正常にこのテクニックを実行するには、次の重要な要因が記述した価値があります。
最も重要な要因は、網膜下の空間に正確に針を置くことです。まず、一つ目に入ると、くちばしに向かって指している血管のメインバンドルの反対側の針を合わせるように注意する必要があります。この位置は、心とほぼ平行であり、脳や心臓に損傷を与える機会を減らすことができます。卵黄膜、強膜、網膜と硝子体液を介して貫通した場合、針は、どの血液静脈を介して遠くとピアスの旅行ではありません。針が十分にシャープである場合、これは、いくつかのプラクティスと非常に簡単に行うことができます。次のステップはゆっくりと目をゆっくりと引いてあるeは、針と網膜の開口部の端に配置します。それを完全に引き出すための機会は常にあります。それが起こる必要がある場合、1は、開口部に戻って針先を入れてもう一度試してみることができます。網膜下腔（強膜と網膜の間）に針を置くことは練習と忍耐を必要とします。初めに、それは非常に困難に見えますが、いくつかの練習でそれが容易になる。網膜下の空間内のDNA溶液を注入しながら、それはバルジの形成を観察することが非常に重要です。その後、緑のソリューションは、成功した注射を示す、目のアウトラインを充填開始します。解決策は離れて拡散または眼の中央に充填開始した場合、それが成功したエレクトロポレーションを得ません。誤った注入を示しています。
第二の要因は、ガラスキャピラリーチューブを熱引いて、チップを破壊を介して行われる最適な針の製造である。大きなヒントと針は困難ピアスTHRを持っているウワーッ網膜に損傷を与えたりする可能性を増大させる卵黄膜。通常、鋭い針の先端は、この目的のために最適です。しかし、非常に小さなヒントと針は、DNAをロードして提供する難しさを持っており、眼球の内側を打破するために増加するチャンスがあります。この理由のために我々は、直径約0.1μmと20 mmのテーパ1の先端開口部に針を作る。パラフィルムの一部に液滴からのDNA混合物をロードしている間にも、それが針の内部に空気を得るためのチャンスを増大させるような液体の最後のビットをロードしないように非常に重要です。
最後に、電極の配置すると、成功したエレクトロポレーションを達成するために非常に重要です。電極が開発目は、電極の間に位置されるように、並列に配置する必要があります。余分な注意は、電極を持つ任意の主要な血管や心臓に触れてから撮影する必要があります。これらのいずれかを傷つけることにも成功したinjecti後の胚に死を招くことがありますで。さらに、2つ目は異なって配向している。だから、それは負極電流の下で網膜細胞へのDNAの拡散を可能にするインジェクション側に常にあるべきように電極の向き（正対負）を変更することに留意する必要がある。
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Disclosures
動物実験のすべては、ラトガーズ大学の動物実験および施設委員会によって承認されました。
Acknowledgments
我々は彼のHDカメラの使用（キャノンVIXIA HFS100）のために氏ヤミンエンベルに感謝します。この作業は脊髄研究（08から3074-SCR-E-0と10から3091-SCR-E-0）、ブッシュ医学研究賞にNIH（EY018738）、ニュージャージー州委員会からの助成金によって部分的にサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fertilized pathogen-free (SPF) white leghorn chicken eggs | Sunrise Farms (Catskill, NY) | ||
| Chicken egg incubator | GQF Manufacturing | Model-1550 | Set to 60% humidity and 37.5°C. |
| Glass capillary tubes | World Precision Instruments, Inc. | TW150F-4 | |
| 0.1 ml syringe | Hamilton Co | Gastight 1710 | Alternatively 1ml syringe can be used as well |
| Masterflex Silicone (peroxide) Tubing | Cole-Parmer | HV-96400-13 | Cut a small piece (1 cm) for attaching the glass needle to the syringe |
| Tweezers | Dumont | AA | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments, Inc. | M3301-M3 | |
| Plasmid DNA | pCAG-GFP was borrowed from Dr. Connie Cepko | ||
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252 | Dilute it to 0.025 % with PBS |
| Pulse generator | Harvard Apparatus | BTX ECM 830 | Square wave generator |
| Electrodes | Harvard Apparatus | BTX model 514 | Our electrodes were spaced 3-5 mm apart |
| Monochrome Digital Camera | Carl Zeiss, Inc. | Axiocam MRM | |
| Fluorescent Dissection Microscope | Leica Microsystems | Leica MZ16FA | |
| Upright Fluorescence Microscope | Carl Zeiss, Inc. | Zeiss Axio Imager A1 |
References
- Doh, S. T. Analysis of retinal cell development in chick embryo by immunohistochemistry and in ovo electroporation techniques. BMC. Dev. Biol. 10, (2010).
- Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos. J. Vis. Exp. (9), e408-e408 (2007).
- Nakamura, H., Funahashi, J. Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation. Methods. 24, 43-48 (2001).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Dev. Dyn.. 195, 231-272 (1992).
- Hamburger, V. The stage series of the chick embryo. Dev. Dyn. 195, 273-275 (1992).
