Summary
이 비디오의 전반적인 목표는 타겟 망막 주사를 수행하는 방법을 보여주기입니다
Abstract
닭 배아 망막 높은 척추 동물의 망막 개발을 공부하는 훌륭한 도구입니다. 때문에 대형 및 외부 발전으로 인해, 그것은 재조합 DNA / RNA 기술을 사용하여 병아리 배아 망막를 조작하는 비교적 매우 쉽습니다. 태아의 망막에 DNA / RNA 구조의 Electroporation은 망막 개발하는 동안 망막 줄기 / 전구 세포에서의 유전자 조절을 연구하는 큰 잇점을 가지고있다. 이러한 리포터 유전자 분석, 표현을 통해, 유전자 등 (shRNA) 허물고 유전자 등 assays의 다른 유형은 electroporation 기술을 사용하여 수행할 수 있습니다. 이 비디오는 타겟 망막 주사를 보여주고 배아 일 4 (E4)에 관한 햄버거와 해밀턴 무대 22-23,에서 배아 여자의 망막에 비켜 electroporation 인치 마커로 녹색 형광 단백질 (GFP)을 표현하는 플라스미드 DNA를 직접으로 전달됩니다 의하여 여기 비켜 electroporation 기술에 신속하고 편리하게 보여줄병아리 배아 subretinal 공간과 망막 줄기 / 전구 세포로 DNA의 이해를 촉진하기 위해 전기 펄스에 의해 따라갔다. E4에서 망막 주입과 electroporation의 새로운 방법은 E1.5 2 시에 주입과 electroporation의 전통적인 방법으로 어렵게되었습니다 후반 태생의 뉴런 1을 포함한 모든 망막 세포 유형의 시각화 수 있습니다.
Protocol
이전에 사소한 수정과 함께 다른 주피터 동영상 2, 서류 3 설명된대로 프로토콜의 일부 지역이 수행되므로 우리는 여기에 자세히들을 논의하지 않습니다.
1. 에그 처리 및 니들 준비
- 계란이 최대 1 일주일 동안 약 13도 ° C에서 쿨러 와인에 저장할 수 있습니다. 온도가 너무 높은 경우에는 낮은 온도가 높은 사망률을 초래하면서, 태아는 비정상적으로 개발하기 시작합니다. 일단 와인 쿨러에서 알을 꺼내 큰 엔드와 세로로 계란을 설정할 품어 준비가 된 것입니다. 37.5 ° C 배양기에서 그들을 투입하기 전에 최소한 2 시간 동안 실내 온도에 계란을 보관.
- 햄버거와 해밀턴 단계 22 4-5에 나와 있습니다 배아를 얻기 위해 배아 4 일 약 96-1백시간 대한 알을 품어.
- 뽑아 유리 모세관 튜브에서 micropipette의 바늘을 준비하고 해부 마이크로 미만의 팁을하다0.1 μm의 직경과 20mm 테이퍼에 관한 팁 오프닝을 얻을 수있는 핀셋과 범위. 더 큰 팁을 바늘은 어려움이 작은 조언 DNA의 솔루션을로드하고 제공하는 데 문제가있는 동안 vitelline 막 시작 한거지 있습니다.
- micromanipulator에 탑재된 0.1 ML 해밀턴 Gastight 주사기에 바늘을 연결합니다. 주사기에 바늘을 부착할 수 Masterplex 실리콘 튜브의 작은 조각을 사용합니다. 연결 때문에 꼭 어떤이 첨부 파일을 봉인하기 위해 미네랄 오일을 추가할 필요가 없습니다.
- 3-6 μg / μl와 parafilm의 조각에 빠른 그린 (0.025 %)의 0.2 μl를 이르는 농도와 리포터 플라스미드 DNA 용액 2 μl를 섞는다. 빠른 녹색 염료는 주사를 시각화하는 데 도움이 될 것입니다. 천천히, 혼합물과 바늘을로드합니다.
- 180 °에 대해 부드럽게 계란을 회전하고 몇 분 후 원래 위치로 다시 회전하고 electroporation을 위해 설정을 기다릴 내부의 멤브레인에서 vitelline 멤브레인을 풀고있다.
- 그렇게해야 닦아배아에 감염을 피하기 위해 70 %의 에탄올과 EPS 및 난각.
- 즉시 AA 크기의 포셉 한 쌍을 가진 에어 셀 위에 계란에 작은 구멍을 만듭니다. 알 껍질을 깰하지 않도록주의하십시오. 작은 조각에게 작은 창을 만드는 한 번에 하나씩 제거합니다. 조심스럽게 vitelline 막에 닿지 않고 집게를 사용하여 내부 멤브레인를 제거합니다.
2. 사출 및 Electroporation
- 시선을 입력하고 부리쪽으로 향하고 혈관의 기본 번들로 측면 뇌 또는 심장, 위치 바늘 콘트라 손상을 방지합니다.
- 바늘의 갑작스런 약한 추진하여 vitelline 막, 공막엔, 망막 및 유리체 유머를 통해 피어스. 바늘은 안구의 다른 쪽 끝을 통해 pierces 경우 어떤 주요 혈액 혈관을 손상하지 않는 한 그냥가요이어야합니다.
- 천천히 개방의 가장자리에 바늘을 뒤로 물러나게하고 안구의 외벽에 거의 미동 놓으십시오.
- Insert 공막엔와 망막 사이의 하위 망막 우주로 바늘.
- 당신은 안구의 측면을 복잡하게하고 볼록한 만들어 망막의 안쪽으로 밀어 녹색 솔루션을 시각화 때까지 DNA를 주입.
- 귀하의 바늘 배치가 올바르지 않은 경우 다음의 눈을 볼의 중간을 채우는 유리체 유머 내부 확산의 DNA 용액을 볼 수 있습니다. 당신이 망막에 손상을 경우에도 너무 많이 나서 유전자 솔루션은 안구 밖으로오고있다 볼 수 있습니다.
- 천천히 바늘을 제거하고 즉시 PBS에 몸을 담글 후 계란 내부에 병렬 전극 배치합니다. 주입 눈이 전극 사이에 위치되도록하는 방식으로 양수로 잠수함에 전극을 누르십시오. 그들을 배치하는 동안 전극과 함께 모든 주요 혈관이나 심장을 만지는 피하십시오. 그 DNA는 하위 망막 우주에서 긍정적인 전극에 대한 망막에 이송 될 수 있도록 마이너스 전극은 주입 측면에 있어야합니다. 전기950 MS 간격으로 50 MS위한 15V의 5 펄스와 망막을 porate.
- 조심스럽게 전극을 제거하고 투명 스카치 테이프의 조각과 계란의 창문을 봉쇄.
- 라벨 및 인큐베이터에 다시 투입하기 전에 주입 계란 날짜를 기입하십시오. 일반적으로, 그것은 전체 electroporation 프로세스를 완료하는 데 5-3 분 정도 소요됩니다.
- GFP 발현은 electroporation 후 8시간 초부터 볼 수 있습니다. 배아는 수확하기 전에 원하는 단계에 도달할 때까지 그러나 기다릴 수 있습니다.
3. 대표 결과
우리의 연구에서 우리는 망막 세포 개발에 관여하는 유전자 발현의 조절을 연구하기 위해 다양한 플라스미드 구조를 사용합니다. 이 비디오에서는 pCAG-GFP (transfection 제어)이 성공적인 분사와 electroporation을 수행하는 데 사용되었다. 그러나 리포터 유전자 (GFP, RFP 등)와의 플라스미드 구조를 사용할 수 있습니다. GFP 발현은 ele 후 8시간 초부터 볼 수있다하더라도ctroporation, 우리는 일반적으로 하루 6 달걀 (E6)와 일부터 수확 시작합니다. Electroporated 망막은 배아 밖으로 해부하고 내장과 sectioning 전에 형광 해부 현미경 하에서 분석했다. 일반적으로 리포터 유전자 발현은 성공적인 electroporation (그림 1) 후 최소 망막의 4 분의 1에서 볼 수 있습니다. transfected 망막 조직은 더 이상 세포 morphologies의 명확한 시각화를 위해 sectioning을 통해 분석되었다. 셀 유형 특정 마커 (Brn3a, Pax6 등) 셀 - 특정 GFP의 표현의 허용 특성화 (그림 2)를 사용하여 Immunohistochemistry.
1 그림. 기자 플라스미드 결과 긍정적인 GFP의 표현의 성공적인 electroporation. 닭 배아 망막은 주입과 electroporated 배아 일 4에서와 배아 일 6 시에 수확했다. 망막의 최소 25 %는 성공적으로 (= 탑 뷰, B transfected되었다= 아래보기). 스케일 바 = 1mm.
그림 2. GFP의 특성화는 immunohistochemistry를 사용하여 망막 세포를 표현. E7 단계에서 망막 조직을 표현 GFP는 고정하고 sectioned했다. 이러한 섹션은 다음 각 셀을 특정 마커 물들일되었다. Brn3a은 Pax6가 수평 amacrine 및 신경절 세포 (B)를 결정하는 데 사용하는 도중에 신경절 세포 (A)를 결정하는 데 사용되었다. 스케일 막대 = 50 μm의.
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Discussion
망막 주사를 타겟 및 E4 단계에서 배아 망막에서 비켜 electroporation에 특별히 단일 세포 수준에서 모두 6 개 주요 망막 세포 유형을 시각화하는 능력의 결과로 망막 전구 세포를 타겟팅할 수 있습니다. HH10에서 비켜 electroporation에서 (~ E1.5)을 대상으로 광 소포는 눈을 형성 발전 전지를 transfect 수 있습니다. 그러나 이러한 세포는 현재 매우 높은 매출액을 가지고 있으며이 방법은 망막 세포에 대한 특정되지 않습니다. 그것은 높은 세포 회전율 속도가 입은 안정적인 표현을 방지하는 것입니다. E4으로 배아는 안구의 주요 구조는 모든 형성하지만 망막에있는 세포의 대다수가 여전히 망막 줄기 세포임을 충분히 젊은되는만큼 개발되었습니다. 이 방법은 또한 흥미 유전자는 망막의 정상 개발 및 / 또는 질병 연구를 타겟팅할 수 있습니다 기능 연구 / 손실을 얻기 위해 적용할 수 있습니다.
우리는이 기술을 발표 후이전 용지 1,이 분야에서 몇몇 과학자들은이 기술에 대한 추가 지원을 위해 우리에게 연락을. 그래서 우리는 시각화를위한 동영상을 제작하기로 결정했습니다. 또한, 우리 기술의 진보는이 비디오에 설명되어 있습니다.
성공적으로이 방법을 수행하려면 다음과 같은 중요한 요인이 설명하는 가치가 있습니다.
가장 중요한 요인은 subretinal 공간에 정확하게 바늘을 배치하는 것입니다. 첫째, 하나는 시선을 입력하고 부리쪽으로 향하고 혈관의 기본 번들로 콘트라 측면 바늘을 정렬하는 신중해야합니다. 이 자세는 심장에 거의 평행이며 두뇌와 심장을 손상시킬 수있는 기회를 줄여줍니다. vitelline 막, 공막엔, 망막 및 유리체 유머를 통해 피어싱 때, 바늘은 어떤 피가 정맥을 통해 지금까지와 피어스 가선 안돼요. 바늘이 충분히 날카로운있다면 이것은 몇 가지 사례와 함께 매우 쉽게 수행할 수 있습니다. 다음 단계는 천천히 주년을 후퇴하는 것이다전자 바늘과 망막의 개통의 가장자리에 위치 그것을. 완전히 끄집어 기회는 항상있다. 그런 일을해야한다면, 하나는 오프닝에서 다시 바늘 끝을 넣어 다시 시도할 수 있습니다. subretinal 공간 (공막엔와 망막 사이)에 바늘을 삽입하는 것은 연습과 인내심이 필요합니다. 처음에는 매우 어려운 일이 생겼 있지만 연습으로 쉽게된다. subretinal 공간 내부의 DNA 용액을 주입하는 동안 그것은 볼록한 형성을 관찰하는 것은 매우 중요합니다. 그 후 녹색 솔루션은 성공적인 주사를 나타내는 눈의 윤곽을 복잡하게 시작합니다. 솔루션이 떨어져 diffuses 또는 안구의 중간에 충전 시작되면, 그것은 성공적인 electroporation를 얻을하지 않습니다 잘못된 주사를 나타냅니다.
두 번째 요인은 유리 모세관 튜브를 열 당기와 팁을 깨는 통해 만들어진 최적의 바늘의 제작이다. 대형 팁을 니들이 어려움 천공 thr가ough 망막의 손상의 가능성이 높아 vitelline 막. 보통 날카로운 바늘 팁이 목적으로 가장 적합합니다. 그러나 아주 작은 팁을 바늘은 어려움 DNA를로드하고 제공을 가지고 있으며 안구 안쪽에 무너뜨리는 증가 가능성이 높습니다. 이러한 이유로 우리는 직경 0.1 μm의 약과 20mm 테이퍼 하나의 팁 오프닝으로 바늘을합니다. parafilm 한 조각의 비말에서 DNA의 혼합물을로드하는 동안 또한, 그것이 바늘 안쪽에 공기를 얻는 기회가 증가할수록 액체의 마지막 비트를로드하지 않는 매우 중요합니다.
마지막으로, 전극의 배치하는 것은 성공적인 electroporation을 달성하는 것은 매우 중요합니다. 전극이 개발 안구가 전극 사이에 위치하고 있으므로 병렬로 배치해야합니다. 추가주의는 전극과 주요 혈관이나 심장을 감동으로 연결됩니다. 이들 중 먹칠을하는 것은 더욱 성공적인 injecti 후 배아로 사망을 초래할 수에. 또한, 두 눈은 다른 방향입니다. 그래서, 그것은 부정적인 전극이 전류 하에서 망막 세포로 DNA의 확산을 허용하도록 주입 측면에서 항상 있어야되도록 전극 방향을 (긍정 대 부정) 변경 염두에 보관해야합니다.
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Disclosures
동물 실험의 모든 Rutgers 대학 기관 동물 보호 시설위원회에 의해 승인되었다.
Acknowledgments
우리는 그의의 HD 카메라 이용 (캐논 VIXIA HFS100) 동안 집게 Maaz Enver 감사드립니다. 이 작품은 NIH (EY018738), 척수 연구에서 뉴저지위원회 (08-3074-SCR-e-0과 10-3091-SCR-E-0) 및 부시 바이오 메디컬 연구 대상에서 교부금에 의해 부분적으로 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fertilized pathogen-free (SPF) white leghorn chicken eggs | Sunrise Farms (Catskill, NY) | ||
| Chicken egg incubator | GQF Manufacturing | Model-1550 | Set to 60% humidity and 37.5°C. |
| Glass capillary tubes | World Precision Instruments, Inc. | TW150F-4 | |
| 0.1 ml syringe | Hamilton Co | Gastight 1710 | Alternatively 1ml syringe can be used as well |
| Masterflex Silicone (peroxide) Tubing | Cole-Parmer | HV-96400-13 | Cut a small piece (1 cm) for attaching the glass needle to the syringe |
| Tweezers | Dumont | AA | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments, Inc. | M3301-M3 | |
| Plasmid DNA | pCAG-GFP was borrowed from Dr. Connie Cepko | ||
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252 | Dilute it to 0.025 % with PBS |
| Pulse generator | Harvard Apparatus | BTX ECM 830 | Square wave generator |
| Electrodes | Harvard Apparatus | BTX model 514 | Our electrodes were spaced 3-5 mm apart |
| Monochrome Digital Camera | Carl Zeiss, Inc. | Axiocam MRM | |
| Fluorescent Dissection Microscope | Leica Microsystems | Leica MZ16FA | |
| Upright Fluorescence Microscope | Carl Zeiss, Inc. | Zeiss Axio Imager A1 |
References
- Doh, S. T. Analysis of retinal cell development in chick embryo by immunohistochemistry and in ovo electroporation techniques. BMC. Dev. Biol. 10, (2010).
- Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos. J. Vis. Exp. (9), e408-e408 (2007).
- Nakamura, H., Funahashi, J. Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation. Methods. 24, 43-48 (2001).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Dev. Dyn.. 195, 231-272 (1992).
- Hamburger, V. The stage series of the chick embryo. Dev. Dyn. 195, 273-275 (1992).
