Summary
该视频的总体目标是显示如何执行有针对性的视网膜注射
Abstract
鸡胚胎的视网膜是一个很好的工具来研究在高等脊椎动物的视网膜发育。由于庞大的规模和外部的发展，它是相对非常容易操纵的鸡胚视网膜，利用重组DNA / RNA技术。胚胎视网膜电DNA / RNA的结构将有一个很大的优势，研究视网膜发育过程中视网膜干/祖细胞的基因调控。如检测报告基因检测，基因过度表达，基因敲除（shRNA的）等不同类型，可以使用电穿孔技术。该视频演示了有针对性的视网膜注射到鸡胚视网膜OVO在汉堡和汉密尔顿阶段22-23，这是关于胚胎第4天（E4），电。在这里，我们表明在OVO电技术的快速和便捷，使质粒DNA的表达绿色荧光蛋白（GFP）作为标记直接传递到鸡胚视网膜下的空间和通过电脉冲，以促进视网膜干/祖细胞的DNA吸收。视网膜注射和电E4类的新方法，让所有的视网膜细胞类型的可视化，包括后期新生神经元，这一直是注射和电的传统方法难以在E1.5 2。
Protocol
由于该协议的某些部分进行轻微修改先前在其他的朱庇特的视频和论文3所述，我们不会在这里详细讨论。
1。鸡蛋处理和针的制备
- 鸡蛋可以储存在13℃左右的葡萄酒在凉爽长达1周。如果温度过高，胚胎开始正常发展，而较低的温度下会导致高死亡率。一旦你准备好孵化从酒柜中取出的鸡蛋和鸡蛋与较大的一端设置垂直向上。保持至少2个小时之前，他们在37.5℃孵化的鸡蛋，在室温。
- 胚胎第4天，以获取胚胎在汉堡和汉密尔顿阶段22 4-5 96-100小时的孵化蛋。
- 准备从拉玻璃毛细管微量针头和打破根据解剖微尖一个镊子得到一个直径约0.1微米和20毫米锥尖端张开的范围。较大技巧的针头刺入卵黄膜而小技巧有困难装载和交付的DNA溶液的困难。
- 将0.1毫升汉密尔顿气密性注射器安装在显微操作针。使用注射器针Masterplex硅胶管的小块。由于连接是紧无需添加矿物油的密封附件。
- 不等3-6微克/μl和0.2μl快绿了一块封口膜（0.025％）的混合浓度记者质粒DNA溶液2μL。绿色染料将有助于快速可视化的注射。慢慢地，加载的混合物针。
- 摆脱卵黄膜的内层膜，蛋轻轻旋转约180°，并等待数分钟，然后将其旋转回原来的位置，并设置它的电。
- 擦拭的FORCEPS和蛋壳的胚胎，以避免感染，用70％乙醇。
- 做一个小孔，在上面一对AA尺寸钳空气电池的鸡蛋。小心打击蛋壳。取出小块的时间，使一个小窗口之一。而不触及卵黄膜的使用镊子小心取出内膜。
2。注射和电
- 为了防止损害大脑或心脏，定位针禁忌主要的血液进入眼内，指向喙血管束外侧。
- 皮尔斯通过卵黄膜，巩膜，视网膜和玻璃体突然轻推针。如果通过眼睛的另一端穿过针应该没事，除非它破坏任何主要的血液静脉。
- 慢慢在开幕式的边缘拉回来针，并把它放在眼球的外壁几乎相切。
- 插入背板T针巩膜和视网膜之间的视网膜进入子空间。
- 注入的DNA，直到你能想象灌装一侧眼球，推动创建一个隆起的视网膜向内的绿色解决方案。
- 如果你的针配售是不正确的，那么你将看到的DNA溶液，填补了中间的眼球内的玻璃体幽默的蔓延。另外，如果你损害视网膜太多，你会看到DNA溶液来眼球。
- 慢慢去除针电极在PBS浸泡后立即放置在蛋内的平行。向下推入羊水淹没在使注入的眼睛是位于电极之间的电极。避免接触电极放置任何大血管或心脏。负电极应该在注射侧，使DNA可以从子视网膜空间运朝正电极的视网膜。电5 15V脉冲为50毫秒，950毫秒的间隔porate视网膜。
- 小心地取出电极和密封件透明胶带鸡蛋的窗口。
- 标签和日期之前把它孵化注入卵子。通常情况下，它需要约3至5分钟即可完成整个电过程。
- GFP的表达，可以看作是早8小时后，电。然而，你可能会等待，直到胚胎收获前达到预期的阶段。
3。代表结果
在我们的研究中，我们使用各种质粒结构的研究，涉及视网膜细胞发育的基因表达调控。在这个视频pCAG-GFP（染控制）被用来追踪一个成功的注射和电。然而，任何与记者质粒结构基因（绿色荧光蛋白，RFP等）都可以使用。尽管GFP的表达可以看出，早8小时后元素ctroporation，我们通常开始收获鸡蛋（E6），第6天起。电穿孔视网膜解剖胚胎前嵌入和切片分析和荧光解剖显微镜下。通常情况下，报告基因的表达，可以看到至少在一季度的视网膜，成功后的电（图1）。进一步分析转染视网膜组织切片通过细胞形态清晰的可视化。免疫组化使用的细胞类型的特定标记（Brn3a，PAX6等）允许特定的细胞GFP的表达特性（图2）。
图1。注射和电穿孔成功电记者质粒阳性结果GFP表达。鸡胚胎视网膜在胚胎第4天，并在胚胎第6天收获。至少有25％的视网膜成功转（=顶视图，乙=底视图）。比例尺= 1毫米。
图2。表达GFP的特性，采用免疫组织化学视网膜细胞，绿色荧光蛋白表达E7的阶段视网膜组织固定和切片。这些部分，然后沾上各种细胞特异性标记。 brn3a被用来确定神经节细胞（一），而PAX6是用来确定水平，无长突细胞和神经节细胞（B）。比例尺= 50微米。
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Discussion
有针对性的视网膜注射，并在 E4类阶段OVO在胚胎视网膜电针对视网膜祖细胞，导致在单细胞水平上的所有六个主要的视网膜细胞类型的能力，可视化。 在OVO电在HH10（E1.5）针对视泡是能够转染细胞的发展，形成了眼。然而，这些细胞具有非常高的营业额，在这个时候，这种方法是不特定的视网膜细胞。这可能是高的细胞周转率，防止持续稳定表达。由E4时，胚胎不够发达，眼睛的主要结构都形成了，但足够年轻，大部分在视网膜细胞仍然是视网膜干细胞。这种方法也可以申请获得/损失的功能，其中一个感兴趣的基因可以有针对性地研究正常发展和/或视网膜疾病的研究。
此技术后，我们在我们的出版前文1，在这一领域的几位科学家对这一技术的进一步援助联系我们。所以我们决定生产这种可视化的视频。此外，我们的技术进步，在这部影片描述。
若要执行此技术成功后，关键因素是值得描述。
最关键的因素是针准确放置在视网膜下的空间。首先，必须要小心对准针对侧主丛的血液进入眼内，指向喙船只。这一立场是几乎平行的心脏和减少损害大脑和心脏的机会。当针头刺入通过卵黄膜，巩膜，视网膜和玻璃体，不应出远门和皮尔斯通过任何血静脉。如果针是不够锋利，那么这可以很容易与一些做法。下一步是要慢慢拉回到日ê针的位置，在的视网膜开幕边缘。总是有机会完全将其拉出。如果发生，那么我们可以再次尝试将在开幕式上的针尖。在视网膜下腔（巩膜和视网膜之间）配售针，需要练习和耐心。在开始的时候，它看起来非常困难的;然而，一些做法变得更容易。而内视网膜下腔注射的DNA溶液，观察隆起的形成是非常重要的。此后，绿色的解决方案开始填充眼的轮廓，表明成功注射。如果解决方案扩散或进入眼睛的中间开始灌装，表明一个不正确的注射不会产生一个成功的电。
第二个因素是通过热拉玻璃毛细管，并打破了尖端制造的最佳针。大秘诀针有困难穿孔THRough卵黄膜增加损害视网膜的机会。一般锐利的针尖是为此。不过，针非常小窍门有困难的装载和交付的DNA，并有增加的机会，打破眼球内。为此，我们在尖端张开约0.1微米，直径20毫米锥度1针。此外，而装上了一块封口膜液滴的DNA混合物，它是非常重要的不加载的液体最后一点，因为它增加的机会越来越针内的空气。
最后，电极的放置是非常重要的，以实现成功电。电极应放置在位于电极之间的平行，使发展中国家的眼睛。应采取任何重大的血管或心脏与电极接触时要格外小心。任何破坏这些可能导致死亡的胚胎，即使在成功injecti上。此外，两只眼睛是不同的面向。因此，必须牢记，改变电极方向（正与负），使负极应该总是在注射侧允许电流下的视网膜细胞的DNA弥漫。
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Disclosures
所有的动物实验通过动物保健制度和设施委员会在罗格斯大学。
Acknowledgments
我们要感谢他的高清摄像头（炮VIXIA HFS100）使用玛斯恩维尔先生。这项工作是支持的，一部分由来自NIH的“（EY018738），新泽西州的脊髓研究委员会（08-3074-可控硅 - E-0和10-3091-SCR-E 0），布希生物医学研究奖补助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fertilized pathogen-free (SPF) white leghorn chicken eggs | Sunrise Farms (Catskill, NY) | ||
| Chicken egg incubator | GQF Manufacturing | Model-1550 | Set to 60% humidity and 37.5°C. |
| Glass capillary tubes | World Precision Instruments, Inc. | TW150F-4 | |
| 0.1 ml syringe | Hamilton Co | Gastight 1710 | Alternatively 1ml syringe can be used as well |
| Masterflex Silicone (peroxide) Tubing | Cole-Parmer | HV-96400-13 | Cut a small piece (1 cm) for attaching the glass needle to the syringe |
| Tweezers | Dumont | AA | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments, Inc. | M3301-M3 | |
| Plasmid DNA | pCAG-GFP was borrowed from Dr. Connie Cepko | ||
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252 | Dilute it to 0.025 % with PBS |
| Pulse generator | Harvard Apparatus | BTX ECM 830 | Square wave generator |
| Electrodes | Harvard Apparatus | BTX model 514 | Our electrodes were spaced 3-5 mm apart |
| Monochrome Digital Camera | Carl Zeiss, Inc. | Axiocam MRM | |
| Fluorescent Dissection Microscope | Leica Microsystems | Leica MZ16FA | |
| Upright Fluorescence Microscope | Carl Zeiss, Inc. | Zeiss Axio Imager A1 |
References
- Doh, S. T. Analysis of retinal cell development in chick embryo by immunohistochemistry and in ovo electroporation techniques. BMC. Dev. Biol. 10, (2010).
- Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos. J. Vis. Exp. (9), e408-e408 (2007).
- Nakamura, H., Funahashi, J. Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation. Methods. 24, 43-48 (2001).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Dev. Dyn.. 195, 231-272 (1992).
- Hamburger, V. The stage series of the chick embryo. Dev. Dyn. 195, 273-275 (1992).
