背腹鼠​​类内侧嗅皮层组织的调查矢状窦片的制备

Summary

我们描述了大脑切片，保持背腹轴的内侧嗅皮层（MEC）的编制和电生理记录的程序。由于定位的神经编码如下内MEC的背腹侧组织，这些程序协助调查重要的导航和记忆的细胞机制。

Abstract

在大脑的计算依赖于适当的回应突触输入的神经元。神经元的不同，在他们的补充和细胞膜离子通道的分布，确定他们如何应对突触输入。然而，这些细胞的特性和动物行为的神经元功能之间的关系还不是很清楚。这个问题的办法之一，是研究地形组织的神经回路在单个神经元映射到它们编码的信息或计算的位置，他们携带^1。使用这种方法的实验表明调节突触反应，感觉和认知电路^2,3基本信息编码的原则。

沿背腹轴内侧嗅皮层（MEC）的空间表示地形的组织提供了一个机会，以建立细胞的机制和计算之间的关系，我空间认知mportant。啮齿类动物的MEC的第二层中的神经元编码的位置，使用网格状发射领域^4-6。为MEC的背仓发现的神经元，个别的射击领域，形成了一个网之间的距离是30厘米的顺序，而这个距离在逐步位置更腹侧神经元增加至大于1米。一些研究表明MEC的，像网格射击领域之间的间距，也根据自己的背腹位置不同的第二层的神经元细胞的特性，这表明这些细胞的特性是重要的空间计算^2,7-10。

在这里，我们描述程序编制和维持MEC的有利地形组织MEC的神经元的生物物理和解剖特性的调查背腹程度的脑切片的电生理记录。背腹的位置确定列印eurons相对解剖标志是难以建立与使用水平的MEC ^7,8,11,12片的协议，准确，因为它是难以确定确切的背腹片的位置参考点。我们所描述的程序，使沿背腹轴的迈克，以及可视化的^2,10分子梯度准确和一致的测量记录细胞的位置。成年小鼠（28天）使用的程序已经开发，并已成功受聘小鼠1.5岁。的调整，他们可以用年轻的老鼠或其他啮齿类动物。标准化体系的编制及测量系统的调查将有助于这方面的细胞和微电路的特性。

Protocol

1。矢状切片制备

1.1解剖大脑半球

所有的动物实验应遵循当地的伦理审查和国家法规。在这里描述实验的情况下，这项工作符合英国的动物（科学规程）行动1986年。我们经常使用颈椎脱位，没有麻醉安乐死之前消除大脑的老鼠。或者鼠标可以末期麻醉，但在这种情况下，它可能是必要的，以确定麻醉的选择，影响神经的属性。

从鼠标的大脑，并立即在寒冷的地方（4-8°）切割人工脑脊液（学联）（解决方案的组成见表1）冒泡_{carbogen（95％O2，5％CO 2）}饱和。

最多3分钟后，小心地取出大脑从Cutting学联用压舌板轻轻地放置在直立位置（背侧朝上）在滤纸上，已蘸切割学联（ 图1A）。

为了便于准确安装在半球，用剃刀或解剖刀删除，而不影响迈克（位于大脑的尾极端）为的小脑尽可能多和冠状面切片，消除大脑延髓第三（ 图1B）。

Hemisect的大脑，照顾节完全沿中线（ 图1C）的垂直平面。

返回半球冒泡的切割学联为一分半钟。

1.2安装在vibratome半球

在安装之前，确保在20度从横向的角度，的vibratome刀片的尖端（

照顾，以尽量减少对身体的影响，用锅铲和位置的切割学联从每个半球，其内侧，使依赖于铲，背程度面临着对切片机的刀片。轻轻地滑入强力胶带，每个半球，照顾，以确保每个半球的内侧表面是平行的切片基地。我们发现，每个半球的背表面，以取得最佳效果应该是平行，和面临的vibratome的刀片（ 图1D）。

1.3切片的准备过程中的维护

下列安装立即被淹没在冷切割学联（4 - 8℃）的半球。保持的。温度e和carbogen整个切片过程中的饱和度。如果直接冷却和冒泡的切割室的解决方案是不实际的，在香港总商会定期补充新鲜冷冻和冒泡的解决方案的切割学联解决方案。

1.4切段

使用一个vibratome，从矢状面两半球皮质，直到你确定（通常从侧面〜1mm的下）（ 图1F）最外侧的MEC的程度。

之间削减抬起〜的vibratome的刀片200微米，以避免拖动刀背和损坏裸露的组织。从两个半球同时减少MEC的内侧程度，直到达到400微米的矢状部分（如果他们排成如图1D他们都将在同一时间被削减）。这可确定由厚厚的白色带的情况下，周围的T腹，尾的曲线他海马（外部胶囊），其喙边界的非凸形状的角尾后背成“角”。 图1E说明海马在矢状面的圆形外观，MEC的外侧。 图1F-G的说明如何在MEC的部分出现在不同侧的内侧位置时，切片。注意逐步海马豆状出现在更内侧的位置。每个半球通常会产生两个或三个400微米厚的片MEC的。

1.5孵育片的

每个切割后立即放置在的carbogen饱和标准学联水浴保持在35°C片让片学联约15分钟后在35°C孵育切片是完整的。

从水浴中取出切片持有人，并继续在室温下的carbogen为在l起泡向东45分钟。

2。例如矢状窦切片实验

使用该制剂是一个典型的实验，使MEC的第二层星状细胞电生理记录。

2.1优化光学

在录制之前，确保冷凝器是在切片平面（克勒光照）的重点和中心下的高倍率（例如40倍）客观。

2.2细胞识别的利益

使用低倍率（如4X）在MEC的（ 图2A-B的目标识别）近似录音区域。切换到高放大倍率的目标，以确定这一区域内的活细胞（ 图2C-V）。

作为一个例子，假定II层星状细胞在视觉上类似的直径确定他们的多角形或卵圆形的形状和多个主树突之三，并没有一个单一的大直径顶树突^2,13,14。他们是可靠的I / II层的边界，边缘上确定，他们是丰富，往往出现在^2,9小组（ 图2C-V）。也应该是可识别的interneurons和锥体细胞，其他类型的细胞，如。

可以在这一点上进行实验，例如采用全细胞膜片钳记录膜电位或确定神经元膜电流，电气或optogenetic方法激活记录神经元的突触输入。可以验证记录神经元的电生理特性及在细胞内的解决方案，包括荧光标记的神经元的身份。

3。测量沿背腹轴的位置

3.1感兴趣的图片的位置和周边片

到确定一个recor的位置DED沿背腹轴的神经元，先用低倍物镜形象片及周边地区的MEC的地区。标记所感兴趣的位置，例如，包括图像（ 图3A）或下台领域虹膜隔离开利息重复图像的位置，周围明亮的圆的记录电极。然后可以重复记录的位置和它的周围（ 图3B）的初始图像叠加在图像精确定位记录的位置。多达3个独立的低倍率（4X）的图像可能会被要求支付MEC的背边境从腹侧记录的位置，面积。这些图像，然后可以使用图像处理软件，提供了一个可以从距离测量（ 图3）的图像拼接在一起。神经元的身份和位置的进一步核实后可以进行录音，包括生物胞素或Alexa染料在细胞内的解决方案，然后使用适当的组织处理，录音^2，如无效的标记。

3.2建立背边境的MEC

MEC的背边界提​​供了一个方便的地标来衡量背腹位置。 MEC的腹侧边境是没有得到很好的界定。

图4说明了如何在尼氏染色片的定义在不同的内侧，外侧位置MEC的细胞标志出现DIC的光照下。

图4显示了圆形的海马（ 图4（I））和缺乏一个成层（ 图4（四））与矢状切片含横向嗅皮层（LEC）parasubicular突。

图4公元前显示包含典型的ME片C.突出暗背嗅/ Parasubicular在DIC的照片边界地区的背部分包含地区的parasubiculum。 Nissl染色在列（三）相应的图像清楚地表明parasubiculum面积。 MEC的（4B和4C列（四）黑色箭头）背边境腹侧，远成层（4B和4C列（四）红色箭头）突出parasubicular细胞组。

比较图4B和4C列（ii）及（三）表明，在尼氏节迈克背边界对应的位置是在DIC片背边缘的黑暗嗅/ Parasubicular边界的地区腹侧（黑色箭头）。可以预计从DIC的图像和比较参考图像边界的位置（见文献14）。未来验证的背与分子标记MEC的边界，将改善这一估计的准确性。我们注意到THAţ染色参考部分，形态识别标记的神经元，处理的部分，可能会受到相当大的收缩。在DIC和参考部分的地标，相对的绝对距离的比较，因此首先需要收缩的测量和校正（如文献2）。

3.3校准和测量距离

为了方便容易测量图像的距离，使用相同的低倍率目标图像参考网格建立一个像素的距离转化率。测量像素的距离，从背MEC的边境利益沿轮廓使用图形程序迈克的位置和转换像素微米的距离（ 图5A）的距离。如果充满如生物胞素标记神经元，然后就可以记录神经元的位置也可以通过适当的处理回收（见如文献2）。

4。再版esentative结果

图5A显示了一个例子低倍率（4X）录制后矢状切片，记录神经元和测量指南叠加的位置，复合图像。从显着的背，腹星状细胞的录音显示在图5B。这些记录有助于建立细胞的身份，并说明如何MEC II层星状细胞的电性能，在背部和腹部的位置不同。

图1。矢状窦片的制备。一个全脑背面临向上侧滤纸上休息蘸切割学联，B ，C用于安装半横断脑小脑和延髓第三取出后，D安装胶条半球平行切割边缘vibratome刀片淹没前切割学联和切片，E含LEC的部分外观“横向”的一部分，MEC的去除外侧组织切片后的程序，尚未得到充分的标准矢状迈克片的内侧，F取出后进一步组织400微米（表面上是400微米，内侧所示的外观（F））G的外观“内侧”400微米的矢状切片后MEC的一部分已被切断您好示意图EF的解剖标志，C：分别表示。小脑，L：横向嗅皮层（LEC），M：内侧嗅皮层（MEC）H：海马，橙色：外部胶囊，蓝色：胼胝体，青色：齿状回GR的EEN：CA3区和CA1区。片包含LEC的海马延髓边界的外观是凹（H 中黑色箭头），而在片只包含迈克的边界可以是线性的（红色箭头）或凹（红色箭头） 在 J。彩色解剖标志近似的形状，在艾伦脑图谱（注释http://mouse.brain-map.org/atlas/ARA/Sagittal/browser.html ）。

图2。 DIC的光照下识别MEC II层细胞。例如复合图像一个准矢状脑切片在低倍率（4倍）。单独的图像已对齐和混合删除分心的边缘和暗角。重要的具有里程碑意义的地区H：海马，M：。迈克B从一个单独的低倍率（4X）图像包含MEC的，右手边缘附近的暗竖条纹可见ÇMEC II层第二层在高倍作物（与DIC照明的40倍）。形象是几个图像对齐和混合的复合材料。密集的中央“一栏中的”细胞层II D单高倍率DIC的形象，呈现出健康假定星状细胞和第二层的interneurons。如下所示，星状细胞经常在组I / II层的边界上发生。锥体细胞往往可以找到更接近第二层/第三边境。交流虚线轮廓显示BD的程度分别。比例尺：在A和B 500微米，C和D 100微米。

图3“SRC =”/ files/ftp_upload/3802/3802fig3.jpg“/>
图3。测量感兴趣的地点背腹的位置。一个不结盟的低倍率（4X）的图像，包括整个背腹之间的利益的位置（标记记录电极尖端）和黑暗的嗅/ Parasubicular边界的地区，具有里程碑意义的（用于建立背边境的MEC的程度迈克-见图4）乙在A，但与场可变光圈（降低不透明覆盖），而不是记录电极标记感兴趣的位置停了下来，包括叠加图像。

图4。估算DIC的矢状切片图像MEC的背边境。交流矢状窦旁路段外侧向内侧嗅皮层（）。 DIC和尼氏的部分是从不同的麦克风E 交流栏（i）：全矢状片（400微米厚）（低倍率（4X）图像对齐和混合材料）AC列（二）：特写与特征黑暗嗅/ Parasubicular边界的地区内嗅皮质每个图像的顶部区域。（三）从不同的鼠标AC列尼氏染色切片（40微米厚）与交流（二）图像对齐。较深，细胞致密层是第二层。比较列（ii）及（三）尼氏染色细胞出现在DIC图像显示了如何交流专栏（四）：尼氏染色切片的细节。 B和C列（四）包括从parasubiculum（黑暗的嗅/ Parasubicular边界的地区背在DIC图像的一部分）和从背迈克细胞的细胞。 （四）在B和C（四）parasubicular细胞扩展到层深大背补丁，我是很容易可见光（红色箭头）。这些补丁的腹侧边缘对应于背博MEC的rder（黑色箭头）。 （四）parasubicular补丁缺席，表明是太为标准矢状迈克的片制备的横向切片。在所有面板，黑色箭头表示的MEC背边境。灰色箭头表示MEC的近似腹边境。

图5。具有代表性的结果。一个图像混合和裁剪图3中的一部分， 一个一个背细胞和腹侧细胞的立场是分别由蓝色和绿色实心圆圈表示。黑色箭头标志着估计MEC的背边境和白色虚线延长到深层。白色实线显示MEC的背边境距离，位于腹侧的细胞像素测量的轮廓路径，沿着它是一个指导。比例尺： 乙电500微米。从细胞的生理痕迹表明在A，从左至右 - 阈下的反应，目前用来计算输入电阻的步骤，扣球一个大的积极的一步，穗细节。

Discussion

为了方便调查MEC的电路特性，遵循背腹的组织，我们已经描述了在这里详细为生产矢状切片准备保留MEC的背腹的程度的过程。

关键步骤

卸下从动物大脑 。特别小心，以避免对大脑施加压力。这是比迅速清除大脑更重要。

切片。切片应牢固地粘在地板控股室。在vibratome应该有Z轴振动<2微米，并应与高振幅和低速设置使用。最佳设置不同车型之间，必须通过试验和错误的建立。

溶液温度监测 。我们发现，切片质量对温度很敏感，期间和之后，切割。 outsid电子推荐的温度范围，健康的神经元数量减少，神经细胞会变得更加难以修补和响应可以减少突触输入。

成像。Koehler照明领域虹膜隔围绕细胞录制前的可视化是重要的。

故障排除

片含有一些健康细胞。替换的解决方案。检查Z轴位移上vibratome。检查温度的解决方案。检查片切割时的方向。

切片中的神经元是很难看到的。检查Koehler照明配置是否正确。检查显微镜镜头是干净的。

困难的形成gigaseals。检查记录电极的形状。检查切片的细胞​​死亡，如圆形细胞的形状，或高对比度细胞的迹象。

ve_content“ 切片图像是很难对齐。确保片的重点是捕捉最大的细节。对于图像自动对齐> 40％的图像重叠通常是足够的。

限制

矢状切片准备的一个潜在的局限性是很长的范围内MEC的突触连接可能不运行直接平行矢状面^9，15，因此可能不会被保留。维护这些连接可能需要修改的准备过程，改变延髓尾端平面的角度安装在，要么hemisecting或大脑半球上vibratome切成片的角度。类似的考虑，可申请其他连接保存，例如从内侧隔传入输入。

横的迈克片准备的比较

1. 背腹位置的精确测量是重要的建立沿背腹轴和生理特性上的位置之间的定量关系。在横向切片准备^7,8,11,12，它是难以确定确切的背腹的位置切割和复杂建立一个一致的参考位置。相反，在矢状切片准备背MEC的边境很容易建立一个参考点和切片神经元的深度知识来衡量其背腹的位置是不必要的。矢状切片，因此极大地促进背腹位置的精确测量，允许更快速，更精确的背腹的位置和蜂窝和电路性能之间的定量关系的调查。
2. 分子梯度是非常重要的MEC的地形电路组织，用荧光或其他标记技术，可以可视化。在比较水平切片，在这届E信号将不得不在不同的背腹位置的切片之间相比，矢状窦旁准备允许更容易，更精细和更可靠的可视化和量化背腹分子梯度。
3. 。背腹梯度突触连接可能在MEC的功能发挥的重要作用。矢状切片准备，可以保存在MEC的，重要的是研究如何连接不同内部和之间的不同位置沿背腹轴的迈克和保持电路的完整性同样在不同的背腹，背，腹地区之间的突触连接位置。如果差异很大，沿背腹轴连接，横片是不太可能以同样包括在每个极端的全功能微型。

未来的发展和应用

知识分子的决定蜂窝在MEC的身份将使神经身份的明确表征，并允许更精确的测定背腹的位置。

使用矢状切片的制备，组织的细胞类型和特定位置的多个神经元的活动地形反应可以同时观察到一个片内（例如，使用电压敏感染料或钙成像）。

矢状窦旁准备在结合optogenetic工具，允许选择性激活沿背腹轴的不同位置。问如何在不同的背腹位置的微型电路响应空间有针对性的激活可以到MEC的微电路功能提供了重要的见解。

我们希望这个准备，将提供一个简单，可靠和规范的基础上，调查中生理特性的背腹梯度和促进了解如何将这些梯度有助于MEC的信息加工性能。