Vorbereitung der Parasagittale Slices für die Untersuchung von dorsal-ventrale Organisation des medialen entorhinalen Cortex Nager

Summary

Wir beschreiben die Verfahren zur Herstellung und elektrophysiologische Ableitung von Hirnschnitten, die dorso-ventralen Achse des medialen entorhinalen Cortex (MEC) zu halten. Da neuronale Codierung der Lage folgt eine dorsal-ventrale Organisation innerhalb des MEC, erleichtern diese Verfahren Untersuchung der zellulären Mechanismen, die wichtig für die Navigation und das Gedächtnis.

Abstract

Rechnen im Gehirn beruht auf Neuronen reagiert angemessen auf ihre synaptische Eingänge. Neuronen unterscheiden sich in ihrer Ergänzung und Verteilung von Ionenkanälen, die Membran, wie sie synaptische Eingänge reagieren zu bestimmen. Allerdings ist die Beziehung zwischen diesen zellulären Eigenschaften und neuronale Funktion im lebenden Tier nicht gut verstanden. Ein Ansatz, dieses Problem ist, topographisch organisierten neuronalen Schaltkreise, in denen die Position der einzelnen Neuronen Karten auf Informationen, die sie kodieren, oder Berechnungen von ihnen durchgeführten ¹ zu untersuchen. Experimente mit Hilfe dieses Ansatzes lassen Grundsätze für die Abstimmung der synaptischen Antworten zugrunde liegenden Informationen Codierung in sensorischen und kognitiven Schaltungen ^2,3.

Die topographische Organisation der räumlichen Darstellung entlang der dorso-ventralen Achse des medialen entorhinalen Cortex (MEC) bietet die Möglichkeit, zwischen zellulären Mechanismen und Berechnungen zu schaffen iW ichtig für die räumliche Wahrnehmung. Neurone in Schicht II des MEC Nagetier kodieren Lage mit gitterartigen Brennen Felder ^4-6. Für Neuronen in dorsalen Position in der MEC vor der Abstand zwischen den einzelnen Brennen Bereichen, die ein Raster bilden in der Größenordnung von 30 cm, während für Neuronen in zunehmend ventralen Positionen dieser Abstand erhöht, um größer als 1 m. Mehrere Studien haben zellulären Eigenschaften von Neuronen in Schicht II des MEC, dass, wie der Abstand zwischen Gitter Brennen Felder, unterscheiden sich auch je nach dorsal-ventrale Position enthüllt, was darauf hindeutet, dass diese zellulären Eigenschaften wichtig sind für die räumliche Berechnung ^2,7-10.

Hier beschreiben wir Verfahren für die Vorbereitung und elektrophysiologische Ableitung von Hirnschnitten, die dorsal-ventralen Umfang der MEC ermöglicht Untersuchung der topographischen Organisation der biophysikalischen und anatomischen Eigenschaften von MEC Neuronen aufrecht zu erhalten. Die dorsal-ventrale Position des identifizierten neurons relativ zu anatomischen Landmarken ist schwierig, genau festzustellen mit Protokollen, die horizontale Scheiben von MEC ^7,8,11,12 zu verwenden, da es schwierig, Anhaltspunkte für die genaue dorsal-ventrale Lage der Scheibe zu etablieren. Die Verfahren beschreiben wir ermöglichen präzise und einheitliche Messung der Lage der aufgenommenen Zellen entlang der dorso-ventralen Achse des MEC sowie die Visualisierung molekularer Gradienten ^2,10. Die Verfahren wurden für die Verwendung mit erwachsenen Mäusen (> 28 Tage) entwickelt worden und haben sich bislang mit Mäusen bis zu 1,5 Jahre alt beschäftigt. Mit Anpassungen konnten sie mit jüngeren Mäusen oder anderen Nagetieren eingesetzt werden. Ein standardisiertes System der Vorbereitung und Messung helfen werden systematische Untersuchung der zellulären und Mikroschaltung Eigenschaften dieser Gegend.

Protocol

1. Parasagittale Slice-Vorbereitung

1,1 herauspräparieren Gehirnhälften

Alle Tierversuche folgen sollten lokale Ethikprüfung und nationalen Vorschriften. Im Fall von den hier beschriebenen Experimenten, entspricht das Werk an die britischen Animals (Scientific Procedures) Act 1986. Wir verwenden routinemäßig Genickbruch ohne Betäubung, um die Maus vor dem Entfernen des Gehirns einschläfern. Alternativ kann die Maus sein terminal anästhesiert, aber in diesem Fall kann es erforderlich sein, um zu bestimmen, wenn die Wahl der Anästhesie neuronalen Eigenschaften beeinflusst.

Entfernen Sie das Gehirn von der Maus und sofort in kaltem (4-8 ° C) Schneiden künstliche Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF) (siehe Tabelle 1 für Lösung Kompositionen) sprudelte bis zur Sättigung mit Carbogen (95% O _2, 5% CO _2).

Nach maximal drei Minuten, entfernen Sie vorsichtig das Gehirn aus dem cUtting ACSF mit einem Spatel und legen Sie sie vorsichtig in eine aufrechte Position (dorsal Seite nach oben) auf ein Filterpapier, das mit dem Schneiden ACSF (Abbildung 1A) angefeuchtet wurde.

Zur Erleichterung der Montage genau der Hemisphären, verwenden Sie eine Rasierklinge oder Skalpell, um so viel des Kleinhirns wie möglich, ohne dass der MEC (befindet sich am kaudalen extreme des Großhirns) entfernen und entfernen Sie den rostralen Drittel des Großhirns durch Schnitt in der Frontalebene (Abbildung 1B).

Hemisect das Gehirn, wobei darauf geachtet, dass der Abschnitt genau entlang der vertikalen Ebene der Mittellinie (1C) ist.

Senden Sie die Halbkugeln zum Schneiden sprudelte ACSF für eineinhalb Minuten.

1,2 Montieren Sie die Halbkugeln auf einem Vibratom

Vor der Montage sicherstellen, dass die Schneidkante der Klinge Vibratom bei 20 Grad von der Horizontalen abgewinkelt ist (

Die Pflege der körperlichen Auswirkungen zu minimieren, nehmen Sie jede Hemisphäre aus dem Schnittbereich ACSF mit einem Spatel und Position, so dass seine mediale Fläche ruht auf dem Spatel und seiner dorsalen Umfang zugewandt dem Mikrotomklinge. Schieben Sie jeder Hemisphäre auf den Streifen von Sekundenkleber, wobei darauf zu achten, dass die mediale Oberfläche jeder Hemisphäre parallel zur Mikrotomgrundplatte ist. Wir haben festgestellt, dass für die besten Ergebnisse der dorsale Oberfläche jeder Hemisphäre sollten parallel zu und stehen vor der Vibratom Klinge (1D).

1.3 Wartung der Zubereitung während des Schneidens

Nach Montage sofort eintauchen in die Hemisphären Kaltschnitt ACSF (4 - 8 ° C). Pflegen Sie die Temperature und Carbogen Sättigung während des Slicing Verfahren. Wenn direkte Kühlung und Sprudeln der Lösung in der Mahlkammer nicht praktikabel ist, in regelmäßigen Abständen wieder aufzufüllen das Schneiden ACSF-Lösung in der Kammer mit Frischwasser gekühlt und sprudelte Lösung.

1,4 Zuschnitte

Mit einem Vibratom, zu entfernen Cortex von beiden Hemisphären in der Sagittalebene bis zur seitlichen Ausdehnung der meisten MEC zu identifizieren (typischerweise ~ 1mm unten von der Seitenfläche) (1F).

Zwischen den Schnitten heben Sie den Vibratom Klinge bis ~ 200 um zu vermeiden, ziehen Sie die Klinge wieder über und Schäden an der exponierten Gewebes. Gleichzeitig geschnitten 400 um parasagittalen Abschnitten von beiden Halbkugeln (wenn sie wie in 1D gezeigt ausgekleidet sind sie beide zur gleichen Zeit geschnitten werden), bis der medialen Umfang der MEC erreicht ist. Dies kann durch das Fehlen der dicken weißen Band um den ventro-kaudalen Kurve t identifiziert werdener Hippocampus (die äußere Kapsel), die nicht-konvexen Form des rostralen Rand und die Winkelgeschwindigkeit dorso-kaudalen "Ecke". 1E veranschaulicht die kreisförmiges Erscheinungsbild des Hippocampus in parasagittaler Ebene quer zur MEC. 1F-G zeigen Wie Abschnitte innerhalb des MEC an verschiedenen Positionen lateral-medial erscheinen beim Schneiden. Notieren Sie sich den zunehmend bohnenförmige Aussehen des Hippocampus bei mehr mediale Positionen. Jede Hemisphäre liefert typischerweise zwei oder drei 400 mu m dicke Scheiben schneiden, die das MEC.

1,5 inkubieren Scheiben

Nach jedem Schnitt sofort platzieren die Scheiben in Carbogen-gesättigte Standard ACSF in einem Wasserbad bei 35 ° C gehalten Willkommen Scheiben bei 35 ° C für ungefähr 15 Minuten in der ACSF inkubieren nach dem Schneiden abgeschlossen ist.

Entfernen Sie das Slice-Halter aus dem Wasserbad und weiterhin sprudeln mit Carbogen bei Raumtemperatur bei lOsten 45 Minuten.

2. Beispiel Parasagittale Slice-Experiment

Ein typisches Experiment mit dieser Vorbereitung ist es, elektrophysiologische Ableitungen von Sternzellen in Schicht II des MEC zu machen.

2,1 Optimize Optik

Vor der Aufnahme sicher, dass der Kondensator in Fokus auf die Schnittebene (Köhler-Beleuchtung) ist und wird unter der hohen Vergrößerung (zB 40x) Ziel zentriert.

2,2 Identifizieren Zellen von Interesse

Verwenden Sie eine geringe Vergrößerung (zB 4x) Ziel, um eine ungefähre Aufzeichnung Region innerhalb des MEC (Abbildung 2A-B) zu identifizieren. Wechseln Sie zu einem hohen Vergrößerung Ziel zu lebensfähigen Zellen innerhalb dieser Region (Abbildung 2C-D) zu identifizieren.

Als Beispiel werden putativen Schicht II Sternzellen visuell durch ihre polygonalen oder ovalen Form und mehrere primäre Dendriten mit ähnlichen Durchmesser identifiziertter, und das Fehlen eines einzigen großen Durchmesser apikalen Dendriten ^2,13,14. Sie sind zuverlässig auf dem Rand der Schicht I / II Grenze gekennzeichnet, wenn sie reichlich vorhanden und oft in kleinen Gruppen ^2,9 (2C-D). Andere Zelltypen, wie Interneuronen und Pyramidenzellen sollte auch erkennbar sein.

An diesem Punkt Experimente durchgeführt werden, beispielsweise mit Whole-Cell-Patch-Clamp zu Membranpotential oder Membran Strom von identifizierten Neuronen, und elektrische oder optogenetische Verfahren aufnehmen, um synaptische Eingänge des Neurons aufgezeichnet zu aktivieren. Neuron Identität kann von den elektrophysiologischen Eigenschaften des Neurons aufgezeichnet und durch die Einbeziehung fluoreszierenden Markierungen innerhalb der intrazellulären Lösung überprüft werden.

3. Messen Sie Lage an der dorso-ventrale Achse

3,1 Bild Lage von Interesse und den umliegenden Scheibe

Um die Position eines Recor zu bestimmenDED Neuron entlang der dorso-ventralen Achse, verwenden Sie zuerst eine geringe Vergrößerung Ziel, das Bild MEC Region der Scheibe und die umliegenden Gebiete. Markieren Sie die Stelle von Interesse durch, zum Beispiel, einschließlich der Aufnahme-Elektrode in einem Bild (Abbildung 3A) oder durch Rücktritt das Feld Irisblende, um eine helle Kreis um den Ort von Interesse in eine Kopie des Bildes zu verlassen. Um die Aufzeichnung Position innerhalb des Bildes das Duplikat dann auf dem ersten Bild der Aufnahmeort und dessen Umgebung (Abbildung 3B) überlagert werden genau zu bestimmen. Bis zu 3 separate geringer Vergrößerung (4x) Bilder benötigt, um die Fläche aus einer ventralen Aufnahmeort zum dorsalen Rand des MEC gedeckt werden können. Diese Bilder können dann zusammengefügt werden, mit Bildbearbeitungssoftware, um ein Bild, dass Abstandsmessungen aus unternommen werden können (Abbildung 3) bieten. Weitere Überprüfung der Identität und den Aufenthaltsort Neuron kann nach der Aufnahme durchgeführt werden, indeminaktiven Marker wie Biocytin oder Alexa-Farbstoffe in der intrazellulären Lösung und dann mit Hilfe geeigneter Verarbeitung des Gewebes nach der Aufnahme ^2.

3,2 Stellen Sie die dorsale Grenze des MEC

Der dorsale Rand des MEC bietet eine bequeme Wahrzeichen, von dem dorsal-ventrale Position zu messen. Der ventrale Rand des MEC ist nicht so gut definiert.

Abbildung 4 zeigt, wie die MEC zellulären Orte im Nissl gefärbten Schnitten in verschiedenen medial-lateralen Positionen definiert unter DIC Beleuchtung erscheinen.

Abbildung 4 A zeigt die kreisförmige Hippocampus (Abbildung 4 (i)) und das Fehlen einer parasubicular Vorsprung in Schicht I (Abbildung 4 (iv)), die mit parasagittale Scheiben mit lateralen entorhinalen Cortex (LEC).

Abbildung 4 v. Chr. zeigen typische Scheiben, die die ME enthaltenC. Der dorsale Teil der prominenten dunklen dorsalen Entorhinale / Parasubicular Grenzbereich in den DIC beleuchteten Scheiben enthält einen Bereich des parasubiculum. Die parasubiculum Bereich ist deutlich von Nissl Färbung in den entsprechenden Bildern in der Spalte (iii) ergab. Die dorsalen der MEC (schwarze Pfeile in 4B und 4C-Säule (iv)) ventral der Gruppe von parasubicular Zellen, die weit herausragt in die Schicht I (roten Pfeile in 4B und 4C-Säule (iv)).

Ein Vergleich der Abbildungen 4B und 4C Spalten (ii) und (iii) zeigt, dass die dorsale Grenze des MEC in den Nissl Abschnitten zu einem Ort, der ventralen zum dorsalen Rand der dunklen Entorhinale / Parasubicular Grenzbereich in der DIC Scheibe ist entspricht ( schwarze Pfeile). Die Lage der Grenze kann von DIC Bilder und Vergleich mit Referenz-Bildern geschätzt werden (siehe auch Lit.. 14). Zukünftige Validierung des dorsalen MEC Grenze mit molekularen Markern verbessert die Genauigkeit dieser Schätzung. Wir stellen fest, that gefärbt Referenzabschnitte, und Abschnitte, die für morphologische Identifizierung der markierten Neuronen, verarbeitet werden können, unterliegen beträchtliche Schrumpfung. Der Vergleich von absoluten Entfernungen relativ zum Wahrzeichen an der DIC und Kapiteln zum Nachschlagen daher zunächst erforderlich Messung und Korrektur der Schrumpfung (siehe zB Lit. 2).

3,3 kalibrieren und messen Entfernungen

Um eine einfache Messung der Distanz in den Bildern zu erleichtern, verwenden das gleiche Ziel zu geringer Vergrößerung Bild eine Referenz Raster, um ein Pixel zu etablieren: Abstand Umtauschverhältnis. Messen Sie die Pixel-Abstand von der dorsalen Grenze des MEC an die Stelle von Interesse entlang der Kontur des MEC mit einem Grafikprogramm und konvertieren Pixel Abstand zum Abstand in um (5A). Wenn Neuronen mit einem Marker wie Biocytin gefüllt sind, dann Position des aufgezeichneten Neuronen kann dann auch durch entsprechende Verarbeitung gewonnen werden (siehe zB Lit. 2).

4. Repr.esentative Ergebnisse

5A zeigt ein Beispiel mit geringer Vergrößerung (4x) zusammengesetztes Bild eines parasagittale Scheibe nach der Aufnahme, mit den Standorten der aufgezeichneten Neuronen und Messung Führer überlagert. Aufnahmen aus den markierten dorsalen und ventralen Sternzellen sind in 5B gezeigt. Diese Aufnahmen helfen, die Identität der Zellen zu schaffen und zeigen, wie elektrischen Eigenschaften des MEC Schicht II Sternzellen am dorsalen und ventralen Orten unterscheiden.

Abbildung 1. Vorbereitung der parasagittale Scheiben schneiden. Eine ganze Gehirn ruht mit dorsalen Seite nach oben auf Filterpapier befeuchtet mit Schneiden ACSF. B C hemiseziert Gehirn zur Montage bereit. D montiert Hemisphären auf Klebestreifen parallel zur Schneide des Vibratom Klinge vor dem Eintauchen in ACSF Schneiden und Schneiden. E Aussehen der Abschnitt mit LEC während das Aufschneiden Verfahren nach dem Entfernen der seitlichen Gewebe und noch nicht ausreichend medial für eine Standard-parasagittale MEC-Slice. F Aussehen der "lateralen" Teil des MEC nach dem Entfernen eines weiteren 400 um von Gewebe (die Oberfläche ist 400 um medial gezeigt, dass in . (F)) g Aussehen des 'medialen' Teil des MEC nach einer 400 um parasagittale Scheibe geschnitten worden HALLO Schematics von EF Werte deuten darauf hin anatomischen Landmarken, c:. Kleinhirn, L: lateralen entorhinalen Cortex (LEC), m: Medial entorhinalen Cortex (MEC), h: Hippocampus, orange: äußere Kapsel, blau: Corpus callosum, Cyan: Gyrus dentatus, gr.EEN: CA3 & CA1. Das Aussehen der rostralen Grenze des Hippocampus in Scheiben schneiden, die LEC enthalten ist konkav (schwarzer Pfeil in H), während in Scheiben, die nur MEC enthalten, die Grenze kann linear (roter Pfeil in I) oder konkav (roter Pfeil in J). Die ungefähren Formen von farbigen anatomischen Landmarken wurden aus den Anmerkungen in der Allen Brain Atlas (erhalten http://mouse.brain-map.org/atlas/ARA/Sagittal/browser.html ).

Abbildung 2. Identifizieren MEC Schicht II-Zellen unter DIC Beleuchtung. Ein Beispiel zusammengesetztes Bild eines para sagittalen Hirnschnitt bei geringer Vergrößerung (4x). Separate Bilder wurden ausgerichtet und vermischt, um störende Kanten und Vignettierung zu entfernen. Wichtiger Meilenstein Bereichen h: Hippocampus, m:. MEC B Crop von einem individuellen geringer Vergrößerung (4x) Bild, das Schicht II des MEC, sichtbar als dunkle vertikale Streifen in der Nähe des rechten Randes C MEC Schicht II bei hoher Vergrößerung enthält (. 40x) mit DIC-Beleuchtung. Das Bild ist ein ausgerichtetes und gemischt Verbund mehrerer Bilder. Die dichte zentrale "Säule" der Zellen ist Layer II. D Single hoher Vergrößerung DIC Bild zeigt eine Gruppe von gesunden vermeintlichen Sternzellen und Interneuronen in Schicht II. Wie hier gezeigt, Sternzellen treten oft in Gruppen an der Grenze der Schicht I / II. Pyramidenzellen neigen dazu, näher an den Layer II / III-Grenze gefunden werden. Die gestrichelten Linien in AC zeigen das Ausmaß der BD sind. Maßstab: in A-und B 500 um, in C und D 100 um.

Abbildung 3 "src =" / files/ftp_upload/3802/3802fig3.jpg "/>
Abbildung 3. Die Messung der dorso-ventralen Position von Orten von Interesse. Ein ausgerichtet geringer Vergrößerung (4x) geben, die die gesamte dorso-ventralen Umfang des MEC zwischen dem Ort von Interesse (gekennzeichnet durch die Spitze eines Aufzeichnungselektrode) und dem dunklen Entorhinale / Parasubicular Grenzbereich Landmarke (verwendet, um die dorsalen Ziele einschließen der MEC - siehe Abbildung 4) B, wie in A, aber auch ein überlagertes Bild mit einem abgeblendet Leuchtfeldblende (überlagert mit reduzierter Deckkraft) statt einer Aufnahme Elektrode, um den Ort von Interesse zu markieren..

Abbildung 4. Die Schätzung der Dorsalrand des MEC von DIC Bilder von parasagittale Scheiben schneiden. AC Parasagittale Abschnitte (lateral nach medial) aus dem entorhinalen Kortex. DIC und Nissl Abschnitte sind aus verschiedenen mice AC Spalte (i):.. Ganze parasagittale Scheiben (400 um dick) (ausgerichtet und Blended-Komposite aus geringer Vergrößerung (4x) Bilder) AC Spalte (ii): Nahaufnahme der entorhinalen Kortex mit charakteristisch dunklen Entorhinale / Parasubicular im Grenzbereich Der obere Bereich eines jeden Bildes. AC Spalte (iii) Nissl gefärbten Schnitten (40 &mgr; m dick) aus einer anderen Maus mit Bildern in AC (ii) ausgerichtet ist. Je dunkler, dichte Schicht von Zellen ist Schicht II. Vergleich von Spalten (ii) und (iii) zeigt, wie die Nissl gefärbten Zellen an der DIC Bilder erscheinen AC Spalte (iv):. Detail der Nissl gefärbten Schnitten. B-und C-Säule (iv)-Zellen aus dem parasubiculum (dorsalen Teil des dunklen Entorhinale / Parasubicular Grenzbereich in den DIC-Bilder) und Zellen aus dorsalen MEC. In B (iv) und C (iv) die große Rückenflosse Patch von parasubicular Zellen, die tief in die Schicht erstreckt I ist gut sichtbar (rote Pfeile). Die ventralen Rand dieser Patches entspricht der dorsalen border der MEC (schwarze Pfeile). In A (iv) die parasubicular Patch nicht vorhanden ist, der angibt, dass das Segment zu lateral für eine Standard-parasagittalen MEC Hirnschnittpräparat ist. In allen Platten, zeigen schwarze Pfeile die dorsale Grenze des MEC. Graue Pfeile geben die ungefähre ventralen Rand des MEC.

Abbildung 5. Repräsentative Ergebnisse. Ein Blended abgeschnitten und Teil des Bildes in Abbildung 3 A. Die Positionen der Zelle einer dorsalen und einer ventralen Zelle werden durch blaue und grüne Kreise angezeigt bzw. gefüllt. Der schwarze Pfeil markiert den geschätzten Dorsalrand des MEC und wird in die tiefen Schichten durch die weiße gestrichelte Linie verlängert. Das feste weiße Linie ist eine Führung, welche die Kontur entlang der das Pixel Messung des Abstandes von der dorsalen des MEC der ventral gelegene Zelle aufgenommen wurde. Maßstab: B 500 um Electro.physiologische Spuren aus den Zellen angegeben in A. Von links nach rechts - unterschwellige Reaktionen auf aktuelle Schritte zur Eingangswiderstand berechnen, Spiking Antwort auf eine große positive aktuellen Schritt, Spike Detail.

Discussion

Zur Untersuchung des MEC Schaltung Eigenschaften, die eine dorsal-ventrale Organisation, die wir hier im Detail beschrieben ein Verfahren zur Herstellung einer Scheibe parasagittale Vorbereitung, die die dorsal-ventralen Umfang der MEC bewahrt folgen zu erleichtern.

Kritische Schritte

Entfernung des Gehirns aus dem Tier. Seien Sie besonders vorsichtig, um Druck auf das Gehirn zu vermeiden. Dies ist wichtiger als die schnelle Entfernung des Gehirns.

Spanen. Scheiben sollten fest mit dem Boden der Haltekammer verklebt werden. Die Vibratom sollte z-Achse Vibration <2 um und sollten mit hoher Amplitude und niedriger Drehzahl Einstellungen verwendet werden. Die optimalen Einstellungen können zwischen Modellen abweichen und müssen durch Versuch und Irrtum festgestellt werden.

Überwachung von Temperaturen Lösung. Wir finden, dass Qualität Scheibe empfindlich auf Temperatur ist während und nach dem Schneiden. Außerha e Die empfohlene Temperatur liegt die Zahl der gesunden Neuronen reduziert wird, können Neuronen schwieriger geworden, Patch und Antworten auf synaptische Input reduziert werden kann.

Imaging. Koehler-Beleuchtung und die Zentrierung der Leuchtfeldblende Für die Visualisierung der Zellen vor der Aufnahme wichtig.

Fehlerbehebung

Scheiben enthalten einige gesunde Zellen. Ersetzen Lösungen. Prüfen z-Achsen-Verschiebung auf der Vibratom. Prüfen Sie die Temperatur der Lösungen. Die Ausrichtung der Scheibe beim Schneiden.

Neuronen in der Scheibe sind schwer zu erkennen. Überprüfen Köhler-Beleuchtung richtig konfiguriert ist. Überprüfen Mikroskop-Objektive sind sauber.

Schwierigkeitsgrad bilden Gigaseals. Überprüfen Sie die Form der Aufzeichnung Elektroden. Untersuchen Scheibe auf Anzeichen von Zelltod, zB Knopfzelle Formen, oder Zellen mit hohem Kontrast.

ve_content "> Bilder von der Scheibe sind schwer zu richten. Stellen Sie sicher, die Scheiben sind im Fokus, um maximale Detail zu erfassen. für automatische Bildausrichtung> 40% Überlappung Bild ist in der Regel ausreichend.

Einschränkungen

Eine mögliche Einschränkung der parasagittale Scheibe Vorbereitung ist, dass sehr große Reichweite synaptischen Verbindungen innerhalb des MEC möglicherweise nicht ausgeführt, unmittelbar parallel zur parasagittale Ebene ^{9, 15} und so möglicherweise nicht erhalten. Die Aufrechterhaltung dieser Verbindungen kann verlangen Änderung des Herstellungsverfahrens, um den Winkel der Scheibe, indem Sie entweder hemisecting oder die Montage der Gehirnhälften auf der Vibratom in einem Winkel im rostralen-caudalen Ebene geschnitten ändern. Ähnliche Überlegungen können für die Erhaltung von anderen Verbindungen gelten, zum Beispiel afferenten Inputs aus dem medialen Septum.

Der Vergleich mit horizontalen MEC Hirnschnittpräparate

1. Genaue Messung der dorso-ventralen Lage ist wichtigfür die Festlegung quantitativer Beziehungen zwischen Position entlang der dorso-ventralen Achse und physiologischen Eigenschaften. Im horizontalen Scheibe Vorbereitungen ^7,8,11,12 ist es schwierig, die genaue dorsal-ventrale Lage des Schnittes und Das erschwert den Aufbau einer kohärenten Referenz Standort zu bestimmen. Im Gegensatz dazu in der Scheibe parasagittale Vorbereitung der dorsale Rand des MEC ist einfach zu bedienen wie ein Bezugspunkt und Kenntnis der Tiefe eines Neurons in einer Scheibe ist unnötig, seine dorsal-ventrale Position messen zu etablieren. Parasagittale Scheiben daher erheblich erleichtern genaue Messung der dorso-ventralen Lage, so dass eine schnellere und präzise Untersuchung der quantitativen Beziehungen zwischen dorsal-ventrale Lage und Eigenschaften zellulärer und Schaltung.
2. Molekulare Gradienten sind für topographische Schaltung Organisation in der MEC wichtig und visualisiert werden können mit der Fluoreszenz-Markierung oder andere Techniken. Im Vergleich zu horizontalen Scheiben, in dem the-Signal müsste zwischen Scheiben an verschiedenen Standorten dorsal-ventralen verglichen werden, ermöglicht die parasagittale Vorbereitung einfacher, feinkörnigen und zuverlässiger Visualisierung und Quantifizierung von dorsal-ventralen molekularen Steigungen.
3. . Dorsal-ventralen Gradienten in der synaptischen Konnektivität kann eine wichtige Rolle spielen in MEC-Funktion. Die Zubereitung kann parasagittalen Slice synaptischen Verbindungen zwischen dorsalen und ventralen Gebiete im MEC, was wichtig ist für die Untersuchung, wie die Verbindungen innerhalb und zwischen verschiedenen Stellen entlang der dorso-ventralen Achse des MEC und zum Aufrechterhalten Funktionserhalt gleichermaßen zur jeweiligen dorso-ventralen unterscheiden zu erhalten Zielen. Wenn die Verbindung schwankt im wesentlichen entlang der dorso-ventralen Achse, sind horizontale Schnitte weniger wahrscheinlich, ebenso gehören gesamte Funktionsumfang Mikroschaltungen an jedem Extrem.

Die zukünftigen Entwicklungen und Anwendungen

Das Wissen um die molekularen Determinantenzellulärer Identität in der MEC ermöglicht endgültigen Charakterisierung neuronaler Identität und ermöglichen eine genauere Bestimmung der dorso-ventralen Lage.

Mit dem Slice parasagittale Vorbereitung, konnte topographisch organisiert Antworten von Zelltyp-und Standort-spezifischen Aktivität mehrerer Neuronen gleichzeitig beobachtet werden (zum Beispiel mit Spannung sensitiven Farbstoffen oder Calcium Imaging) in einer einzigen Scheibe.

In Kombination mit optogenetischen Werkzeuge erlaubt die Herstellung parasagittalen selektive Aktivierung an verschiedenen Positionen entlang der dorso-ventralen Achse. Fragen, wie der Mikrotechnik an verschiedenen Standorten dorsal-ventralen räumlich gezielte Aktivierung reagiert könnte wichtige Einblicke in MEC Mikroschaltung Funktion liefern.

Wir erwarten, dass diese Zubereitung wird eine einfache, robuste und standardisierte Basis für die Untersuchung dorso-ventralen Gradienten in physiologischen Eigenschaften und zur Erleichterungzu verstehen, wie diese Gradienten dazu beitragen, die Informationsverarbeitung Eigenschaften des MEC.