Beredning av parasagittal segment för undersökning av dorsal-ventral organisation gnagare Medial entorhinal Cortex

Summary

Vi beskriver förfaranden för framställning och elektrofysiologisk registrering från hjärnsnitt som upprätthåller dorsal-ventral axel av den mediala entorhinal cortex (MEC). På grund neural kodning av plats följer en dorsal-ventral organisation inom MEC, dessa förfaranden underlätta utredningen av cellulära mekanismer som är viktiga för navigering och minne.

Abstract

Beräkning i hjärnan bygger på neuroner reagera på lämpligt sätt till sina synaptiska ingångar. Neuroner skiljer sig komplement och distribution av membranjonkanaler som bestämmer hur de svarar på synaptiska ingångar. Dock förhållandet mellan dessa cellulära egenskaper och neuronal funktion i bete djur som inte förstått. Ett sätt att lösa detta problem är att undersöka topografiskt organiserade neurala kretsar i vilka ställning enskilda nervceller kartor på information som de koda eller beräkningar de utför ^1. Experiment som använder denna metod tyder principer för avstämning av synaptiska svar underliggande information kodning i sensoriska och kognitiva kretsar ^2,3.

Den topografiska organisation rumsliga representationer längs dorsal-ventral axel mediala entorhinal cortex (MEC) ger en möjlighet att etablera relationer mellan cellulära mekanismer och beräkningar iiktigt för rumslig kognition. Neuroner i lagret II av gnagare MEC koda plats med grid-liknande bränning fälten ^4-6. För nervceller finns på rygg positioner i MEC avståndet mellan de enskilda bränning fält som bildar ett rutnät är i storleksordningen 30 cm, medan neuroner i allt mer ventrala positioner avståndet ökar till mer än 1 meter. Flera studier har avslöjat cellulära egenskaper neuroner i skikt II av MEC som, liksom avståndet mellan gallerpunkterna bränning fält, skiljer sig också beroende på deras dorsal-ventral positionen, vilket antyder att dessa cellulära egenskaper som är viktiga för fysisk beräkning ^2,7-10.

Här beskriver vi rutiner för förberedelse och elektrofysiologiska inspelning från hjärnan skivor som upprätthåller dorsal-ventral omfattning MEC möjliggör undersökning av den topografiska organisation biofysiska och anatomiska egenskaper hos MEC nervceller. Den dorsal-ventral position identifierade neurons förhållande till anatomiska landmärken är svårt att fastställa exakt med protokoll som använder horisontella skivor MEC ^7,8,11,12, eftersom det är svårt att fastställa referenspunkter för exakt dorsal-ventral placering skiva. De förfaranden som vi beskriver att korrekt och konsekvent mätning av läge inspelade celler längs dorsal-ventral axel MEC, liksom visualisering av molekylära gradienter ^2,10. Förfarandena har utvecklats för användning med vuxna möss (> 28 dagar) och har framgångsrikt använts med möss upp till 1,5 år. Med justeringar som de kan användas med yngre möss eller andra arter av gnagare. Ett standardiserat system för beredning och mätning kommer att underlätta systematisk undersökning av de cellulära och mikrokrets egenskaper detta område.

Protocol

1. Parasagittal Slice Framställning

1,1 Dissekera ut hjärnhalvorna

Alla djurförsök bör följa lokala etikprövning och nationella bestämmelser. När det gäller de experiment som beskrivs här, överensstämmer arbetet med att de brittiska Djur (vetenskapliga förfaranden) Act 1986. Vi använder rutinmässigt cervikal dislokation utan bedövning för att avliva musen innan du tar bort hjärnan. Alternativt musen kan vara terminalt sövd, men i detta fall kan det bli nödvändigt att avgöra om valet av anestesimedel påverkar neuronala egenskaper.

Avlägsna hjärnan från mus och omedelbart rum i kall (4-8 ° C) skär artificiell cerebrospinalvätska (ACSF) (se Tabell 1 för lösningskompositioner) bubblades till mättnad med karbogen _(95% O2, _5% CO2).

Efter en högst tre minuter, försiktigt bort hjärnan från CUtting ACSF med hjälp av en spatel och försiktigt placera den i upprätt läge (ryggsidan uppåt) på filterpapper som har fuktats med skärande ACSF (Figur 1A).

För att underlätta exakt montering av halvsfärer, använda ett rakblad eller skalpell för att avlägsna så mycket av cerebellum som möjligt utan att påverka MEC (belägen vid den kaudala extrema av storhjärnan) och avlägsna den rostrala tredjedel av storhjärnan genom sektionering i det koronala planet (Figur 1 B).

Hemisect hjärnan, se till att sektionen är exakt längs den vertikala plan mittlinjen (Figur 1C).

Returnera hjärnhalvorna till bubblade skära ACSF en och en halv minut.

1,2 Montera halvkloten på vibratom

Före montering, se till att den skärande kanten på vibratom bladet vinklad 20 grader från horisontalplanet (

Ta hand för att minimera fysisk påverkan, ta bort varje hemisfär från skärning ACSF med en spatel och placera så att dess mediala yta vilar på spateln och den dorsala omfattning vänt mot mikrotomen bladet. Försiktigt varje hemisfär på remsan av superlim, var noga med att se till att den mediala ytan av varje halvklotet är parallell med mikrotomen basen. Vi har funnit att för bästa resultat den dorsala ytan av varje halvklotet bör vara parallell med och möta vibratom bladet (Figur 1D).

1,3 Underhåll av beredningen under skivning

Efter montering direkt dränka de halvkloten i kallt skärning ACSF (4 - 8 ° C). Underhålla arbetstemperature och karbogen mättnad hela skivning förfarandet. Om direkt kylning och bubblande av lösningen i skärkammaren inte är praktiskt regelbundet fylla styckning ACSF lösningen i kammaren med färsk kyld och bubblade lösning.

1.4 Cut sektioner

Med hjälp av en vibratom, ta bort barken från båda hjärnhalvorna i sagittalplanet tills du identifierar den laterala mesta omfattning MEC (vanligtvis ~ 1 mm ned från den laterala ytan) (Figur 1F).

Mellan nedskärningar lyfta vibratom bladet upp ~ 200 m för att undvika att dra bladet tillbaka över och skadar den exponerade vävnaden. Samtidigt skära 400 | im parasagittal sektioner från båda hemisfärerna (om de är uppradade såsom visas i figur 1D de båda skäras samtidigt) tills den mediala del av MEC uppnås. Detta kan identifieras genom frånvaron av den tjocka vita band runt ventro-kaudala kurva av than hippocampus (den yttre kapseln), den icke-konvexa formen hos dess rostrala gräns och vinkelhastigheten dorso-kaudala 'hörn. Figur 1E visar den cirkulära utseende av hippocampus i parasagittal plan lateralt till MEC. figurerna 1F-G illustrerar Hur sektioner inom MEC visas vid olika lateral-medial positioner när skivning. Notera alltmer bönformad utseende hippocampus fler mediala positioner. Varje hemisfär ger typiskt två eller tre 400 | im tjocka skivor som innehåller den MEC.

1,5 Inkubera skivor

Varje skär omedelbart placera skivorna i karbogen-mättad standarden ACSF upprätthållna i ett vattenbad vid 35 ° C. Tillåta skivorna inkuberades vid 35 ° C under ca 15 minuter i ACSF efter skivning är fullbordad.

Ta bort slice innehavaren från vattenbadet och fortsätt bubblande med karbogen vid rumstemperatur under löster 45 minuter.

2. Exempelvis parasagittal Slice Experiment

Ett typiskt experiment med användning av denna beredning är att göra Elektrofysiologiska registreringar från stellatceller i skikt II av MEC.

2.1 Optimera optik

Innan inspelningen, se till att kondensorn är i fokus på den del planet (Koehler belysning) och centrerad under hög förstoring (t.ex. 40x) mål.

2.2 identifiera celler av intresse

Använda en låg förstoring (t.ex. 4x) målet att identifiera en ungefärlig uppteckningsregionen inom MEC (figur 2A-B). Byt till en hög förstoring syfte att fastställa livskraftiga celler i denna region (Figur 2C-D).

Som ett exempel, är förmodade Layer II stellatceller identifieras visuellt genom deras polygonala eller ovala form och multipla primära dendriter med liknande diater, och frånvaro av en enda stor diameter apikala Dendrite ^2,13,14. De tillförlitligt sätt på kanten av lagret I / II gränsen, där de finns i överflöd och ofta förekommer i små grupper ^2,9 (Figur 2C-D). Andra celltyper, till exempel interneuronen och pyramidala celler bör också kunna identifieras.

Vid denna punkt experiment kan utföras, till exempel med användning av helcell-patch-clamp-för att spela in membranpotentialen eller membran ström från identifierade neuroner, och elektriska eller optogenetic metoder för att aktivera synaptiska inmatningar till det inspelade neuronen. Neuron identitet kan verifieras från de elektrofysiologiska egenskaperna hos det inspelade neuron och genom att inkludera fluorescerande etiketter inom den intracellulära lösningen.

3. Mät läge längs Dorso-ventral Axis

3,1 Bild plats intresse och omgivande skiva

Att bestämma positionen för en RECORDED neuron längs dorsal-ventral axeln, först använda en låg förstoring mål att avbilda MEC regionen av skivan och omgivande områden. Markera platsen av intresse genom att till exempel, bland annat inspelningen elektroden i en bild (figur 3A) eller genom att stega ner membranet fältet iris för att lämna ett ljust cirkel runt platsen av intresse i en kopia bild. Att lokalisera inspelningen läge i bilden i duplikat kan sedan överlagras på den initiala bilden av inspelningen läge och dess omgivningar (figur 3B). Upp till 3 separata låg förstoring (4x) bilder kan krävas för att täcka området från en ventral inspelning plats till dorsala gräns MEC. Dessa bilder kan sedan sys ihop med bild-manipulation programvara för att ge en bild som avstånd mätningar kan tas från (Figur 3). Ytterligare kontroll av neuron identitet och plats kan utföras efter inspelningen genom att inkluderainaktiva markörer som biocytin eller Alexa färgämnen i den intracellulära lösningen och sedan använda lämplig behandling av vävnad efter inspelningen ^2.

3,2 Upprätta den dorsala gräns MEC

Den dorsala gräns MEC ger en bekväm landmärke från att mäta dorsal-ventral position. Den ventrala kant av MEC är inte så väl definierad.

Figur 4 illustrerar hur de MEC cellulära landmärken definieras i Nissl färgade skivor vid olika mediala-laterala positioner visas under DIC belysning.

Figur 4 A visar den cirkulära hippocampus (figur 4 (i)) och brist på en parasubicular utsprång in i skiktet I (Figur 4 (iv)) associerad med parasagittal skivor innehållande lateral entorhinal cortex (LEC).

Figur 4 BC visar typiska skivor som innehåller MEC. dorsala delen av framstående mörka rygg entorhinal / Parasubicular gränsen regionen i DIC upplysta skivorna innehåller en del av parasubiculum. Den parasubiculum området är tydligt avslöjas av Nissl färgning i motsvarande bilder i kolumn (iii). Den dorsala kanten av de MeC (svarta pilar i 4B och 4C-kolonn (iv)) är ventrala till gruppen av parasubicular celler som skjuter långt ut i skikt I (röda pilarna i 4B och 4C-kolonn (iv)).

Jämförelse av figurerna 4B och 4C-kolonner (ii) och (iii) visar att den dorsala kanten av MEC i Nissl sektionerna motsvarar en plats som är ventrala att den dorsala kanten av den mörka entorhinal / Parasubicular gränsområdet i DIC skiva ( svarta pilar). Placeringen av gränsen kan inte beräknas från DIC bilder och jämförelse med referens bilder (se även ref 14). Framtida validering av dorsala MEC gränsen molekylära markörer kommer att förbättra noggrannheten i denna uppskattning. Vi noterar that färgas referens sektioner och sektioner som behandlas för morfologisk identifiering av märkta nervceller, kan bli föremål för betydande krympning. Jämförelse av absoluta avstånd i förhållande till landmärken i DIC och referensspåravsnitten därför först kräver mätning och korrigering för krympning (se t.ex. ref 2).

3,3 Kalibrera och mäta avstånd

För att underlätta enkel mätning av avstånd i bilder, använda samma låg förstoring mål att bilden en referensrutnätet att upprätta en pixel: Avstånd omräkningstal. Mäta pixelavstånd från den dorsala kanten av MEC till platsen av intresse utmed konturen av MEC med användning av en grafik-programmet och konverterar pixelavstånd av avstånd i pm (figur 5A). Om nervceller är fyllda med en markör som biocytin, då platsen för den inspelade neuron kan då också återvinnas genom lämplig bearbetning (se t.ex. ref 2).

4. Representative Resultat

Figur 5A visar ett exempel låg förstoring (4x) sammansatt bild av en parasagittal skiva efter inspelning, med placeringen av inspelade nervceller och överlagrade guider mätning. Inspelningar från de markerade dorsala och ventrala stellatceller visas i figur 5B. Dessa inspelningar hjälpa till att fastställa identiteten hos cellerna och visar hur elektriska egenskaperna hos MEC Layer II stellatceller celler skiljer på dorsala och ventrala platser.

Figur 1. Beredning av parasagittal skivor. En Hel hjärnan vilar med ryggsidan uppåt på filterpapper fuktat med skärande ACSF. B C hemisnittad hjärnan redo för montering. D monteras halvkloten på limremsan parallellt med skärande kanten av vibratom blad innan nedsänkning i skärning ACSF och skivning. E Utseende i avsnitt innehåller LEC under skivning förfarandet efter avlägsnande av lateral vävnad och ännu inte tillräckligt mediala för en standard parasagittal MEC skiva. F Utseende av "lateral" en del av MEC efter avlägsnande av ytterligare 400 m av vävnad (ytan är 400 m mediala som visas i . (F)) G Utseende av "mediala" en del av MEC efter 400 m parasagittal bit har skurits HI Schema för EF vilket tyder på anatomiska landmärken, C:. lillhjärnan, L: lateral entorhinal cortex (LEC), m: Medial entorhinal Cortex (MEC), h: hippocampus, orange: extern kapsel, blå: corpus callosum, cyan: dentate gyrus, GReen: CA3 & CA1. Utseendet på rostralt gränsen av hippocampus i skivor som innehåller LEC är konkav (svart pil i H) medan i skivor som endast innehåller MEC kan gränsen vara linjär (röd pil I) eller konkav (röd pil i J). De ungefärliga form av färgade anatomiska landmärken erhölls från anteckningar i Allen Brain Atlas ( http://mouse.brain-map.org/atlas/ARA/Sagittal/browser.html ).

Figur 2. Identifiera MEC Layer II celler under DIC belysning. En Exempel sammansatta bilden av en para- sagittal hjärnan slice vid låg förstoring (4x). Separata bilder har anpassats och blandas för att ta bort distraherande kanter och vinjettering. Viktig milstolpe områden H: hippocampus, m:. MEC B Beskära från en enskild låg förstoring (4x) bild som innehåller lager II i MEC, syns som den mörka vertikala ränder nära högra kanten C MEC lagret II vid hög förstoring (. 40x) med DIC belysning. Bilden är en linje med varandra och blandas komposit av ett flertal bilder. Den täta centrala "Kolumnen" celler är Layer II. D Single hög förstoring DIC bild som visar en grupp friska förmodade stellatceller celler och interneuron i lager II. Såsom visas här, stellatceller ofta förekommer i grupper på gränsen av skiktet I / II. Pyramidala celler tenderar att finna närmare Layer II / III gränsen. De streckade linjerna i AC ange omfattningen av BD resp. Skalstrecken: i A-och B-500 ^ m, i C och D 100 | im.

Figur 3 "src =" / files/ftp_upload/3802/3802fig3.jpg "/>
Figur 3. Mätning av dorsal-ventral position platser av intresse. En Alliansfria låg förstoring (4x) bilder som inkluderar hela dorso-ventral omfattning MEC mellan platsen av intresse (markerad med spetsen på en inspelning elektrod) och den mörka entorhinal / Parasubicular gränslandet landmärke (används för att fastställa dorsala gränsen av MEC - se figur 4) B som i A, men med en överlagrad bild med ett stoppat ner fält irisbländare (täckt med reducerad opacitet) i stället för en inspelning elektrod för att markera platsen av intresse..

Figur 4. Uppskattning av dorsala kanten av MEC från DIC bilder av parasagittal skivor. AC parasagittal sektioner (lateral till medial) från entorhinal cortex. DIC och Nissl sektioner är från olika MICe AC kolumn (i):.. Hela parasagittal skivor (400 m tjock) (linje och blandade kompositer med låg förstoring (4x) bilder) AC kolumn (ii): Närbild av entorhinal cortex med karakteristisk mörk entorhinal / Parasubicular gränsen region den övre delen av varje bild. AC kolumn iii) Nissl färgade skivor (40 m tjockt) från en annan mus i linje med bilder i AC (ii). Ju mörkare, tätt lager av celler är lagret II. Jämföra kolumnerna ii) och (iii) visar hur Nissl färgade cellerna visas i DIC bilder AC kolumn (iv). Detail of Nissl färgade skivor. B och C-kolonn (iv) innefattar celler från den parasubiculum (ryggdelen av den mörka entorhinal / Parasubicular gränsområdet i DIC bilder) och celler från bröst-MEC. I B (iv) och C (iv) den stora dorsala plåster av parasubicular celler som sträcker sig djupt in i lagret I är väl synlig (röda pilar). Den ventrala kanten av dessa patchar motsvarar dorsala border av MEC (svarta pilar). I A (iv) parasubicular plåstret är frånvarande, vilket indikerar att skivan är för lateral för en standard parasagittal MEC slice beredning. I alla paneler, svarta pilar indikerar den dorsala kanten av MEC. Grå pilar indikerar den ungefärliga ventrala gräns MEC.

Figur 5. Representativa resultat. Ett blandat och beskurna del av bilden i figur 3 A. Positionerna för en dorsal cell och en ventral cell indikeras av blå och gröna fyllda cirklar respektive. Den svarta pilen markerar den beräknade dorsala kanten av MEC och är utsträckt in i de djupa lagren av den vita streckade linjen. Den heldragna vita linjen är en guide som visar konturen vägen längs vilken pixel mätning av avståndet från den dorsala gräns MEC till ventralt belägna cellen togs. Skala bar: 500 m B Electro.fysiologiska spår från cellerna som anges i A. Från vänster till höger - under tröskelvärdet svar aktuella stegen används för att beräkna Ingångsresistans, spetsa svar på ett stort positivt aktuella steget, Spike detalj.

Discussion

För att underlätta undersökning av MEC krets egenskaper som följer en dorsal-ventral organisation vi har beskrivit här i detalj ett förfarande för att producera en parasagittal bit preparat som bevarar ryggens-ventrala omfattning MEC.

Kritiska steg

Ta bort hjärnan från djuret. Var särskilt noga med att undvika att utöva påtryckningar på hjärnan. Detta är viktigare än snabbt avlägsnande av hjärnan.

Skivning. Slice ska vara stadigt limmade till golvet i anläggningen kammaren. Den vibratom bör ha z-axel vibrationer <2 m och bör användas med hög amplitud och låg hastighetsinställningar. De optimala inställningarna kan skilja mellan olika modeller och måste fastställas av trial and error.

Övervakning lösning temperaturer. Vi finner att slice kvalitet är känslig för temperatur under och efter kapning. Outsid e rekommenderad temperatur varierar antalet friska neuroner minskas, kan neuroner blir svårare att plåstret, och svar på synaptisk inmatning kan reduceras.

Avbildning. Koehler belysning och centrering av fältet irisbländare är viktiga för visualisering av celler före inspelning.

Felsökning

Skivor innehåller få friska celler. Byt lösningar. Ta z-axeln förskjutning på vibratom. Kontrollera temperaturen av lösningar. Kontrollera inriktning av skivan vid kapning.

Nervceller i segmentet är svåra att se. Kolla Koehler belysning är korrekt konfigurerad. Kontrollera mikroskop linser är rena.

Svårigheter bildar gigatätningar. Kontrollera formen på inspelning elektroder. Undersöka skiva för tecken på celldöd, t ex runda former cell, eller höga celler kontrast.

ve_content "> Bilder av skivan är svåra att anpassa. Se till att skivorna är i fokus för att fånga maximalt detalj. För automatisk bildjustering> 40 procent bild överlappning är typiskt tillräcklig.

Begränsningar

En potentiell begränsning av parasagittal slice preparatet är att mycket lång räckvidd synapsförbindelser inom MEC kan inte köra direkt parallellt med parasagittal planet ^{9, 15} och kan därför inte bevaras. Att upprätthålla dessa förbindelser kan kräva modifiering av preparatet för att ändra vinkeln på skiva minskat med antingen hemisecting eller montering av hjärnhalvorna på vibratom i en vinkel i rostral-caudal planet. Liknande överväganden kan ansöka om bevarande av andra anslutningar, till exempel afferenta input från den mediala septum.

Jämförelse med horisontella MEC slice förberedelser

1. Noggrann mätning av dorsal-ventral läge är viktigtför att upprätta kvantitativa relationer mellan position längs den dorsal-ventral axeln och fysiologiska egenskaper. I horisontella skiva förberedelser ^7,8,11,12 det är svårt att bestämma den exakta dorsal-ventral plats snittet och detta komplicerar inrättande av en enhetlig referens plats. I motsats i parasagittal slice beredningen rygg gränsen till MEC är lätt att etablera sig som en referenspunkt och kunskap om djupet av en neuron i en skiva är onödigt att mäta dess dorsal-ventral position. Parasagittal skivor därför i hög grad underlätta exakt mätning av dorsal-ventral läge som gör att snabbare och exakt undersökning av kvantitativa förhållanden mellan dorsal-ventral läge och cellulära och kretsen egenskaper.
2. Molekylära gradienter är viktiga för topografisk kretsen organisation i MEC och kan visualiseras med hjälp fluorescens eller annan märkning tekniker. I jämförelse med horisontella skivor, där the signal skulle behöva jämföras mellan skivor på olika dorsal-ventrala platser, medger parasagittal förberedelse för enklare, mer finkornig och säkrare visualisering och kvantifiering av dorsal-ventrala molekylära gradienter.
3. . Dorsal-ventrala gradienter i synaptisk förbindelse kan spela en viktig roll i MEC funktion. Den parasagittal slice preparatet kan bevara synaptiska kopplingar mellan dorsala och ventrala områden inom MEC, vilket är viktigt för att undersöka hur kopplingar skilja sig åt inom och mellan olika orter längs dorsal-ventral axel MEC och för att upprätthålla kretsen integriteten lika vid olika dorsal-ventral platser. Om anslutning varierar kraftigt längs dorsal-ventral axeln, horisontella skivor är mindre troligt att även omfatta hela funktionella mikrokretsar vid varje extrem.

Framtida utveckling och tillämpningar

Kunskap om de molekylära faktorerav cellulär identitet i MEC kommer att möjliggöra definitiva karakterisering av neuronal identitet och tillåter mer exakt bestämning av dorsal-ventral plats.

Använda parasagittal slice preparatet kan topografiskt organiserade svar från celltyp-och plats-specifik aktivitet av flera nervceller observeras samtidigt (till exempel med hjälp spänningskänsliga färgämnen eller kalcium imaging) i en enda skiva.

I kombination med optogenetic verktyg medger parasagittal framställning selektiv aktivering vid olika positioner längs den dorsal-ventral axel. Frågar hur mikrokretsar vid olika dorsal-ventrala lägen svarar att rumsligt riktade aktivering kunde leverera viktiga insikter i MEC mikrokrets funktion.

Vi förväntar oss att denna beredning ger en enkel, robust och standardiserade underlag för att undersöka dorsal-ventral gradienter i fysiologiska egenskaper och underlättaförståelse för hur dessa gradienter bidrar till egenskaperna för informationsbehandling hos MEC.