Summary
हम तैयार करने के लिए और मस्तिष्क स्लाइसें कि औसत दर्जे का entorhinal प्रांतस्था (MEC) अक्ष पृष्ठीय उदर को बनाए रखने से electrophysiological रिकॉर्डिंग प्रक्रिया का वर्णन करता है. क्योंकि स्थान की तंत्रिका एन्कोडिंग MEC पृष्ठीय - उदर के भीतर एक संगठन इस प्रकार, इन प्रक्रियाओं सेलुलर नेविगेशन और स्मृति के लिए महत्वपूर्ण तंत्र की जांच की सुविधा.
Protocol
1. Parasagittal स्लाइस तैयार
1.1 मस्तिष्क गोलार्द्धों टुकड़े
सभी पशु प्रयोग स्थानीय नैतिक समीक्षा और राष्ट्रीय नियमों का पालन करना चाहिए. यहाँ वर्णित प्रयोगों के मामले में, काम करने के लिए यूनाइटेड किंगडम पशु (वैज्ञानिक प्रक्रिया) अधिनियम, 1986 के अनुरूप है. हम नियमित चतनाशून्य करनेवाली औषधि के बिना गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था उपयोग करने के लिए मस्तिष्क को हटाने से पहले माउस euthanize. वैकल्पिक रूप से माउस टर्मिनली संवेदनाहृत हो, लेकिन इस मामले में यह निर्धारित करती है कि संवेदनाहारी की पसंद neuronal गुण को प्रभावित करती है आवश्यक हो सकता है.
माउस से मस्तिष्क निकालें और ठंड में तुरंत जगह (4-8 डिग्री सेल्सियस) कृत्रिम मस्तिष्कमेरु (ACSF) के द्रव (1 समाधान रचनाओं के लिए टेबल देखें) काटने संतृप्ति carbogen (95% 2 हे, 5% सीओ 2) के साथ bubbled.
तीन मिनट की एक अधिकतम करने के बाद, ध्यान से ग से मस्तिष्क को हटा देंutting ACSF एक रंग का उपयोग करते हुए और धीरे यह फिल्टर पेपर पर एक ईमानदार (पृष्ठीय ऊपर की ओर का सामना करना पड़) स्थिति है कि के काटने ACSF (चित्रा 1 ए) के साथ सिक्त किया है में डाल दिया.
सही गोलार्द्धों के बढ़ते की सुविधा, एक उस्तरा या स्केलपेल का उपयोग करने के लिए MEC (मस्तिष्क की दुम का चरम पर स्थित) को प्रभावित किए बिना के रूप में संभव के रूप में सेरिबैलम की बहुत दूर और राज्याभिषेक विमान में सेक्शनिंग द्वारा मस्तिष्क की विजय - स्तम्भ तीसरे हटा (चित्रा 1 बी).
Hemisect मस्तिष्क, ख्याल रख रही है कि अनुभाग midline (चित्रा 1C) के ऊर्ध्वाधर विमान के साथ ठीक है.
एक और एक आधे मिनट के लिए bubbled काटने ACSF गोलार्द्धों लौटें.
1.2 vibratome पर गोलार्द्धों माउंट
बढ़ते से पहले सुनिश्चित करने के लिए, कि vibratome ब्लेड की धार से क्षैतिज 20 डिग्री पर angled है ( देखभाल करने के लिए शारीरिक प्रभाव को कम करने, रंग और स्थिति साथ काटने ACSF के प्रत्येक गोलार्द्ध से दूर इतना है कि इसकी औसत दर्जे का सतह रंग पर टिकी हुई है और इसकी पृष्ठीय हद तक सूक्ष्म ब्लेड की ओर चेहरे. धीरे superglue की पट्टी पर प्रत्येक गोलार्द्ध स्लाइड, देखभाल करने के लिए सुनिश्चित करें कि प्रत्येक गोलार्द्ध के औसत दर्जे का सतह सूक्ष्म आधार के समानांतर है. हमने पाया है कि प्रत्येक गोलार्द्ध के पृष्ठीय सतह सर्वोत्तम परिणामों के लिए समानांतर और vibratome ब्लेड (चित्रा -1) का सामना करना चाहिए. टुकड़ा करने की क्रिया के दौरान 1.3 तैयारी का रखरखाव के बाद तुरंत बढ़ते ठंड काटने ACSF (- 8 डिग्री सेल्सियस 4) में गोलार्द्धों डूब. Temperatur बनाए रखने केटुकड़ा करने की क्रिया प्रक्रिया भर में ई और carbogen संतृप्ति. अगर प्रत्यक्ष और काटने कक्ष में समाधान के ठंडा बुदबुदाती व्यावहारिक नहीं है, तो कक्ष में समय - समय पर ताजा ठंडा और bubbled समाधान साथ काटने ACSF के समाधान की भरपाई होगी. 1.4 कट वर्गों एक vibratome का प्रयोग, बाण के समान विमान में दोनों गोलार्द्धों से प्रांतस्था को दूर जब तक आप (चित्रा 1F) (पार्श्व सतह से आम तौर पर ~ 1mm नीचे) MEC के पार्श्व सबसे हद पहचान. के बीच में कटौती ~ को vibratome ब्लेड ब्लेड वापस खींच पर और उजागर ऊतकों को नुकसान पहुँचाए से बचने के लिए 200 माइक्रोन लिफ्ट. इसके साथ ही दोनों गोलार्द्धों से 400 माइक्रोन parasagittal वर्गों में कटौती (अगर वे लाइन में खड़ा कर रहे हैं चित्रा 1D में दिखाया के रूप में वे दोनों एक ही समय में कटौती की जाएगी) MEC की औसत दर्जे का हद तक पहुँच जाता है. यह टी के (उदार) का समास मे प्रयुक्त रूप से दुम का वक्र के चारों ओर मोटी सफेद बैंड की अनुपस्थिति से पहचाना जा सकता हैवह (बाहरी कैप्सूल) हिप्पोकैम्पस, अपनी विजय - स्तम्भ सीमा के आकार गैर उत्तल और कोणीय dorso दुम का 'कोने' चित्रा 1E. parasagittal विमान में हिप्पोकैम्पस के परिपत्र MEC के लिए पार्श्व उपस्थिति दिखाता आंकड़े 1F जी उदाहरण देकर स्पष्ट करना. कैसे MEC भीतर वर्गों विभिन्न पार्श्व औसत दर्जे का पदों पर दिखाई देते हैं जब टुकड़ा करने की क्रिया. उत्तरोत्तर अधिक अधिक औसत दर्जे का पदों पर सेम के आकार का हिप्पोकैम्पस की उपस्थिति ध्यान दें. प्रत्येक गोलार्द्ध में आमतौर पर दो या तीन 400 माइक्रोन मोटी MEC युक्त स्लाइस पैदावार है. 1.5 सेते हैं स्लाइस प्रत्येक कटौती के बाद तुरंत carbogen संतृप्त मानक ACSF में स्लाइस 35 ° सी. में एक नहाने के पानी में बनाए रखा जगह स्लाइस 35 ° C पर ACSF में लगभग 15 मिनट के लिए टुकड़ा करने की क्रिया के बाद सेते हैं करने के लिए अनुमति दें पूरा हो गया है. टुकड़ा धारक पानी के स्नान से निकालें और एल में कमरे के तापमान पर carbogen साथ बुदबुदाती जारीपूर्व 45 मिनट. 2. उदाहरण Parasagittal स्लाइस प्रयोग एक ठेठ इस तैयारी का उपयोग करके प्रयोग MEC की परत द्वितीय में तारामय कोशिकाओं से electrophysiological रिकॉर्डिंग कर रहा है. 2.1 ऑप्टिमाइज़ प्रकाशिकी रिकॉर्डिंग के पहले यह सुनिश्चित करना, कि संघनित्र टुकड़ा विमान (Koehler रोशनी) पर ध्यान केंद्रित करने में है और उच्च वृद्धि (जैसे 40x) उद्देश्य के तहत केंद्रित है. 2.2 ब्याज की पहचानें कोशिकाओं एक कम बढ़ाई (जैसे 4x) MEC (चित्रा 2A बी) के भीतर लगभग एक रिकॉर्डिंग क्षेत्र की पहचान के उद्देश्य का उपयोग करें. एक उच्च बढ़ाई उद्देश्य के लिए स्विच करने के लिए व्यवहार्य कोशिकाओं (चित्रा -2 सी डी) इस क्षेत्र के भीतर की पहचान के लिए. एक उदाहरण के रूप में ख्यात परत द्वितीय तारामय कोशिकाओं नेत्रहीन समान diame के साथ उनके polygonal या ovoid आकार के और कई प्राथमिक dendrites के द्वारा की पहचान कीआतंकवाद, और एक ही बड़ा शिखर व्यास dendrite 2,13,14 की अनुपस्थिति. वे मज़बूती से परत मैं / द्वितीय, सीमा के किनारे पर पहचान कर रहे हैं जहां वे प्रचुर मात्रा में है और अक्सर छोटे समूहों 2,9 (चित्रा -2 सी - डी) में दिखाई देते हैं. Interneurons और पिरामिड कोशिकाओं के रूप में अन्य प्रकार की कोशिकाओं, को भी पहचान योग्य होना चाहिए. इस बिंदु पर प्रयोग किया जा सकता है पूरे सेल पैच दबाना का उपयोग करने के लिए झिल्ली संभावित या पहचान न्यूरॉन्स से वर्तमान झिल्ली, और बिजली या optogenetic तरीके रिकार्ड दर्ज न्यूरॉन को synaptic जानकारी सक्रिय उदाहरण के लिए,. न्यूरॉन पहचान दर्ज न्यूरॉन के electrophysiological गुण से और intracellular समाधान भीतर फ्लोरोसेंट लेबल सहित द्वारा सत्यापित किया जा सकता है. 3. ऐक्सिस Dorso उदर साथ स्थान उपाय 3.1 ब्याज की छवि स्थान और आसपास के टुकड़ा Recor की स्थिति का निर्धारणपृष्ठीय - उदर अक्ष साथ ded न्यूरॉन, पहले एक कम बढ़ाई उद्देश्य का उपयोग करने टुकड़ा और आसपास के क्षेत्रों की MEC क्षेत्र छवि. हित के स्थान, उदाहरण के लिए एक छवि (चित्र 3A) में या नीचे क्षेत्र परितारिका डायाफ्राम कदम के लिए एक नकली छवि में ब्याज के स्थान के चारों ओर एक उज्ज्वल चक्र छोड़ द्वारा रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड सहित, मार्क. डुप्लिकेट फिर रिकॉर्डिंग स्थान और उसके आसपास (3B चित्रा) की प्रारंभिक छवि पर आरोपित किया जा सकता है छवि के भीतर रिकॉर्डिंग स्थान तुच्छ. 3 अलग कम (4x) बढ़ाई छवियों के लिए एक उदर रिकॉर्डिंग MEC की पृष्ठीय सीमा के स्थान से क्षेत्र को कवर करने के लिए आवश्यक हो सकता है. इन छवियों को फिर एक साथ सिले छवि हेरफेर सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के लिए एक छवि है कि दूरी माप से लिया जा सकता है (चित्रा 3) प्रदान किया जा सकता है. न्यूरॉन पहचान और स्थान के आगे सत्यापन रिकॉर्डिंग के बाद बाहर किया जा सकता शामिल करके कियाintracellular समाधान के भीतर और फिर रिकॉर्डिंग के बाद 2 ऊतक के उचित संसाधन का उपयोग biocytin एलेक्सा या रंजक के रूप में निष्क्रिय मार्कर. 3.2 MEC की पृष्ठीय सीमा की स्थापना MEC की पृष्ठीय सीमा एक सुविधाजनक मील का पत्थर है जो से पृष्ठीय - उदर की स्थिति को मापने के लिए प्रदान करता है. MEC की उदर सीमा के रूप में अच्छी तरह से परिभाषित नहीं है. चित्रा 4 दिखाता है कि कैसे MEC सेलुलर विभिन्न औसत दर्जे का पार्श्व पदों पर Nissl दाग स्लाइस में परिभाषित स्थलों डीआईसी रोशनी के तहत दिखाई देते हैं. चित्रा 4 एक परिपत्र (4 चित्रा (मैं)) हिप्पोकैम्पस और परत (4 (चार) चित्रा) के मैं पार्श्व entorhinal प्रांतस्था (LEC) युक्त parasagittal स्लाइस साथ जुड़े में एक parasubicular फलाव की कमी को दर्शाता है. चित्रा 4 ई.पू. ठेठ स्लाइस कि इ होते है दिखाने केसी. प्रमुख अंधेरे पृष्ठीय entorhinal Parasubicular / डीआईसी प्रबुद्ध स्लाइस में सीमा क्षेत्र के पृष्ठीय हिस्सा parasubiculum के एक क्षेत्र शामिल हैं. parasubiculum क्षेत्र स्तंभ (iii) में इसी छवियों में Nissl धुंधला द्वारा स्पष्ट रूप से पता चला है. MEC (4B और 4C (iv) स्तंभ में काला तीर) के पृष्ठीय सीमा के parasubicular कोशिकाओं के समूह है कि मैं (4B और 4C स्तंभ (iv) में लाल तीर) परत में अभी तक बाहर से protrudes उदर है. 4B आंकड़े और 4C कॉलम (ii) और (iii) से पता चलता है कि Nissl वर्गों में MEC पृष्ठीय सीमा एक स्थान कि डीआईसी टुकड़ा में काले सीमा / entorhinal Parasubicular क्षेत्र के पृष्ठीय किनारे करने के लिए उदर है मेल खाती है की तुलना ( काला) तीर. सीमा के स्थान को डीआईसी छवियों और तुलना के संदर्भ छवियों के लिए अनुमान लगाया जा सकता है (रेफरी 14 देखें). आणविक मार्कर के साथ पृष्ठीय MEC सीमा के भविष्य सत्यापन के इस अनुमान की सटीकता में सुधार होगा. हम था ध्यान देंसंदर्भ वर्गों दाग, और वर्गों है कि लेबल न्यूरॉन्स morphological पहचान के लिए संसाधित कर रहे हैं काफी संकोचन के अधीन हो सकता है. डीआईसी और संदर्भ वर्गों में स्थलों के सापेक्ष निरपेक्ष दूरी की तुलना इसलिए पहले माप और संकोचन (जैसे 2 रेफरी देखें) के लिए सुधार की आवश्यकता है. 3.3 जांचना और दूरी को मापने के आसान छवियों में दूरी की माप की सुविधा, एक संदर्भ ग्रिड छवि के लिए एक ही कम बढ़ाई उद्देश्य का उपयोग करने के लिए एक पिक्सेल की स्थापना: दूरी रूपांतरण अनुपात. MEC के पृष्ठीय सीमा से एक ग्राफिक्स प्रोग्राम का उपयोग कर MEC की समोच्च के साथ ब्याज के स्थान के लिए पिक्सेल दूरी और उपाय माइक्रोन में दूरी (चित्रा 5A) पिक्सेल दूरी परिवर्तित. यदि न्यूरॉन्स biocytin के रूप में एक मार्कर के साथ भर रहे हैं, तो दर्ज न्यूरॉन के स्थान फिर भी उचित प्रसंस्करण द्वारा बरामद कर सकते हैं (जैसे 2 रेफरी देखें). 4. Representative परिणाम चित्रा 5A कम बढ़ाई (4x) रिकॉर्डिंग के बाद एक parasagittal दर्ज न्यूरॉन्स और माप गाइड आरोपित के स्थानों के साथ, टुकड़ा के समग्र छवि एक उदाहरण से पता चलता है. चिह्नित पृष्ठीय और ventral तारामय कोशिकाओं से रिकॉर्डिंग चित्रा 5B में दिखाया जाता है. इन रिकॉर्डिंग में मदद करने के लिए कक्षों की पहचान स्थापित करने के लिए और वर्णन कैसे MEC परत द्वितीय तारामय कोशिकाओं के विद्युत गुणों पृष्ठीय और ventral स्थानों पर अलग. "=" चित्रा 3 files/ftp_upload/3802/3802fig3.jpg / "/> 
आकृति 1. Parasagittal स्लाइस की तैयारी. एक पूरी पृष्ठीय फिल्टर पेपर पर ऊपर का सामना करना पड़ पक्ष के साथ आराम मस्तिष्क ACSF बी काटने के साथ सिक्त सी. Hemisected के बढ़ते के लिए तैयार मस्तिष्क की विजय - स्तम्भ 3 के हटाने के बाद ब्रेन> डी गोंद पट्टी पर गोलार्द्धों मुहिम शुरू की समानांतर के दौरान vibratome ब्लेड के किनारे डुबकी के लिए पहले ACSF काटने में और कटौती LEC युक्त खंड के रूप में ई. टुकड़ा करने की क्रिया ऊतक के एक और आगे 400 माइक्रोन (सतह से 400 माइक्रोन में दिखाया गया है कि औसत दर्जे का है को हटाने के बाद MEC के पार्श्व भाग के पार्श्व ऊतक को हटाने के बाद प्रक्रिया टुकड़ा करने की क्रिया और एक मानक parasagittal MEC टुकड़ा के लिए पर्याप्त अभी तक औसत दर्जे का नहीं. एफ रूप (एफ)) जी 'औसत दर्जे' के बाद एक 400 माइक्रोन parasagittal टुकड़ा MEC के भाग के रूप में कटौती की है एफई की हाई Schematics क्रमशः संरचनात्मक स्थलों, ग का संकेत: सेरिबैलम, एल: के पार्श्व entorhinal (LEC) प्रांतस्था, मीटर: औसत दर्जे का entorhinal (MEC) प्रांतस्था, घंटे: हिप्पोकैम्पस, नारंगी: बाहरी कैप्सूल, नीला: महासंयोजिका, सियान: दांतेदार गाइरस जीआर,een: CA3 और CA1. स्लाइस कि LEC होते में हिप्पोकैम्पस के विजय - स्तम्भ सीमा की उपस्थिति अवतल (एच में काला तीर) स्लाइस कि केवल MEC होते जबकि सीमा रेखीय हो (मैं लाल तीर) या अवतल (जम्मू में लाल तीर) कर सकते हैं. रंग संरचनात्मक स्थलों की अनुमानित आकार एलन मस्तिष्क एटलस (एनोटेशन में से प्राप्त किया गया http://mouse.brain-map.org/atlas/ARA/Sagittal/browser.html ). 
चित्रा 2. डीआईसी रोशनी के तहत को MEC परत द्वितीय कोशिकाओं की पहचान. एक पैरा के एक उदाहरण के समग्र छवि कम बढ़ाई बाण के समान मस्तिष्क टुकड़ा (4x). अलग छवियों गठबंधन किया गया है और ध्यान भंग किनारों और vignetting को हटाने के लिए मिश्रित. महत्वपूर्ण मील का पत्थर क्षेत्रों ज: हिप्पोकैम्पस, मीटर. MEC से एक व्यक्ति कम (4x) बढ़ाई छवि है कि उच्च बढ़ाई MEC, दाहिने हाथ किनारे के पास अंधेरे ऊर्ध्वाधर पट्टी के रूप में दिखाई सी MEC परत द्वितीय द्वितीय परत शामिल फसल बी ( डीआईसी रोशनी के साथ 40x). छवि कई छवियों के एक संयुक्त गठबंधन और मिश्रित है. कोशिकाओं के घने केंद्रीय 'स्तंभ' परत द्वितीय डी एकल उच्च बढ़ाई डीआईसी स्वस्थ ख्यात तारामय कोशिकाओं और परत में द्वितीय interneurons का एक समूह को दर्शाता है छवि है. जैसा कि यहाँ दिखाया गया है, कोशिकाओं को अक्सर परत मैं / द्वितीय की सीमा पर समूहों में होते हैं ताराकार. पिरामिड कोशिकाओं परत सीमा द्वितीय / तृतीय के करीब पाया जा करते हैं. एसी में बिंदीदार रूपरेखा क्रमशः बी.डी. की हद से संकेत मिलता है. स्केल सलाखों: ए और बी 500 माइक्रोन में, सी और डी 100 माइक्रोन में.
चित्रा 3. ब्याज की स्थानों की स्थिति पृष्ठीय उदर मापने. एक निरपेक्ष कम (4x) बढ़ाई छवियाँ है कि ब्याज का स्थान (एक रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड की टिप से चिह्नित) और अंधेरे entorhinal / Parasubicular सीमा क्षेत्र में मील का पत्थर (पृष्ठीय सीमा स्थापित किया है के बीच MEC की पूरी हद तक dorso - उदर शामिल MEC की चित्रा 4 देखें) बी लेकिन एक में के रूप में एक नीचे क्षेत्र परितारिका डायाफ्राम (कम अस्पष्टता के साथ मढ़ा) के बजाय एक रिकॉर्डिंग हित के स्थान चिह्नित करने इलेक्ट्रोड बंद कर दिया है के साथ एक आरोपित छवि सहित. 
चित्रा 4. डीआईसी छवियों से parasagittal स्लाइस MEC की पृष्ठीय सीमा आकलन एसी entorhinal प्रांतस्था से Parasagittal वर्गों (पार्श्व औसत दर्जे का है). डीआईसी और Nissl वर्गों अलग mic से कर रहे हैंएसी () स्तंभ:. पूरे parasagittal स्लाइस (400 माइक्रोन मोटी) (गठबंधन और कम बढ़ाई (4x) छवियों की मिश्रित कंपोजिट) एसी (ii) स्तंभ: entorhinal प्रांतस्था में विशेषता अंधेरे सीमा / entorhinal Parasubicular क्षेत्र के साथ बंद प्रत्येक छवि के ऊपर एक अलग माउस से क्षेत्र एसी स्तंभ (iii) Nissl दाग स्लाइस (40 माइक्रोन मोटी) एसी (ii) में छवियों के साथ गठबंधन. गहरे, घने परत परत कोशिकाओं के द्वितीय है. तुलना कॉलम (ii) और (iii) से पता चलता है कैसे Nissl दाग कोशिकाओं डीआईसी चित्र में दिखाई देते हैं एसी स्तंभ (iv): स्लाइस की Nissl दाग विस्तार. बी और सी स्तंभ (iv) (डीआईसी छवियों में काले सीमा / entorhinal Parasubicular क्षेत्र के पृष्ठीय भाग) parasubiculum और पृष्ठीय MEC से कोशिकाओं कोशिकाओं से शामिल हैं. (Iv) बी और सी parasubicular कोशिकाओं है कि गहरी परत में फैली बड़े पृष्ठीय पैच (iv) में मैं आसानी से दिखाई देता है (लाल तीर). इन पैच के उदर किनारे पृष्ठीय बो से मेल खाती हैMEC की rder (काला तीर). एक में (iv) parasubicular पैच अनुपस्थित है, यह दर्शाता है कि टुकड़ा भी एक मानक parasagittal MEC टुकड़ा तैयार करने के लिए पार्श्व है. सभी पैनलों में, काला तीर MEC की पृष्ठीय सीमा से संकेत मिलता है. ग्रे तीर MEC की अनुमानित उदर सीमा से संकेत मिलता है. 
चित्रा 5. प्रतिनिधि परिणाम. चित्रा 3 में एक छवि का मिश्रित और फसली भाग एक पृष्ठीय सेल और एक उदर सेल की स्थिति नीले और हरे रंग भर हलकों क्रमशः संकेत कर रहे हैं. काला तीर MEC की अनुमानित पृष्ठीय सीमा के निशान और सफेद बिंदीदार रेखा गहरी परतों में बढ़ाया है. ठोस सफेद लाइन एक समोच्च मार्ग जो साथ सेल औदरीयता स्थित MEC के पृष्ठीय सीमा से दूरी की माप पिक्सेल ले जाया गया दिखा गाइड है. पैमाने पर पट्टी: 500 माइक्रोन बी इलेक्ट्रो.कोशिकाओं से शारीरिक निशान ए में बाएँ से सही करने के लिए संकेत दिया - subthreshold प्रतिक्रियाओं वर्तमान इनपुट प्रतिरोध की गणना करने के लिए कदम के लिए, एक बड़े सकारात्मक वर्तमान कदम, कील विस्तार करने के लिए प्रतिक्रिया spiking.
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Discussion
MEC सर्किट गुण है कि एक संगठन पृष्ठीय उदर हम यहाँ विस्तार में एक parasagittal टुकड़ा तैयारी है कि MEC की हद पृष्ठीय उदर को बरकरार रखता है के उत्पादन के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन किया है का पालन करें की जांच की सुविधा.
महत्वपूर्ण कदम
जानवर से मस्तिष्क हटा. मस्तिष्क पर दबाव दबाव से बचने के लिए विशेष देखभाल करने के लिए. यह मस्तिष्क के तेजी से हटाने की तुलना में अधिक महत्वपूर्ण है.
टुकड़ा करने की क्रिया स्लाइस. मजबूती से पकड़े कक्ष के फर्श पर चिपके किया जाना चाहिए. vibratome z-अक्ष कंपन <2 माइक्रोन है और उच्च आयाम और कम गति सेटिंग्स के साथ इस्तेमाल किया जाना चाहिए. इष्टतम सेटिंग्स मॉडलों के बीच अलग और परीक्षण और त्रुटि के द्वारा स्थापित किया जाना चाहिए कर सकते हैं.
समाधान तापमान निगरानी. हम पाते हैं कि टुकड़ा की गुणवत्ता के दौरान और बाद काटने के तापमान के प्रति संवेदनशील है. Outsid ई तापमान की सिफारिश की सीमाओं स्वस्थ न्यूरॉन्स की संख्या कम है, न्यूरॉन्स और अधिक पैच और प्रतिक्रियाओं synaptic इनपुट करने के लिए मुश्किल हो सकता है कम किया जा सकता है.
इमेजिंग Koehler रोशनी और केंद्रित क्षेत्र परितारिका डायाफ्राम की रिकॉर्डिंग से पहले कोशिकाओं के दृश्य के लिए महत्वपूर्ण हैं.
समस्या निवारण
स्लाइसें कुछ स्वस्थ कोशिकाओं को रोकने के समाधान बदलें. Vibratome z-अक्ष पर विस्थापन की जाँच करें. समाधान के तापमान की जाँच करें. टुकड़ा जब काटने के उन्मुखीकरण की जाँच करें.
टुकड़ा में न्यूरॉन्स के लिए देखने के लिए कठिन हैं Koehler रोशनी की जाँच करें सही ढंग से कॉन्फ़िगर किया गया है. लेंस सूक्ष्मदर्शी को साफ कर रहे हैं की जाँच करें.
कठिनाई बनाने gigaseals के. रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड के आकार की जाँच करें. कोशिका मृत्यु, उदाहरण के दौर सेल आकार या उच्च विपरीत कोशिकाओं के लक्षण के लिए टुकड़ा जांच करते हैं.
ve_content "टुकड़ा> संरेखित मुश्किल कर रहे हैं सुनिश्चित करें स्लाइस ध्यान में अधिकतम विस्तार पर कब्जा कर रहे हैं. स्वत: छवि संरेखण के लिए> 40% छवि ओवरलैप आमतौर पर पर्याप्त है.सीमाएँ
एक parasagittal टुकड़ा तैयारी की संभावित सीमा है कि बहुत लंबे समय सीमा MEC भीतर synaptic कनेक्शन सीधे समानांतर parasagittal विमान 9, 15 के लिए नहीं चलाने के लिए और संरक्षित नहीं किया जा सकता है हो सकता है. इन कनेक्शनों को बनाए रखने तैयारी के लिए या तो hemisecting या बढ़ते दुम का विमान विजय - स्तम्भ में एक कोण पर vibratome पर मस्तिष्क गोलार्द्धों कटौती टुकड़ा का कोण बदल की प्रक्रिया को संशोधित करने की आवश्यकता हो सकती है. इसी तरह के विचार अन्य कनेक्शन के संरक्षण के लिए औसत दर्जे का पट से उदाहरण अभिवाही जानकारी के लिए, लागू हो सकता है.
क्षैतिज MEC टुकड़ा तैयारी के साथ तुलना करें
- पृष्ठीय उदर स्थान की सटीक मापन महत्वपूर्ण हैअक्ष पृष्ठीय - उदर और शारीरिक गुण पर साथ स्थिति के बीच मात्रात्मक संबंधों की स्थापना के लिए. क्षैतिज टुकड़ा 7,8,11,12 तैयारी में यह कटौती की सटीक स्थान पृष्ठीय उदर और इस एक सुसंगत संदर्भ स्थान की स्थापना पेचीदा का निर्धारण करने के लिए मुश्किल है. इसके विपरीत, parasagittal टुकड़ा तैयारी में MEC की पृष्ठीय सीमा के लिए एक संदर्भ बिंदु और एक टुकड़ा में एक न्यूरॉन की गहराई का ज्ञान पृष्ठीय - उदर में अपनी स्थिति को मापने के लिए अनावश्यक है के रूप में स्थापित करने के लिए आसान है. Parasagittal स्लाइस इसलिए बहुत पृष्ठीय उदर स्थान की सटीक माप की सुविधा के, पृष्ठीय उदर स्थान और सेलुलर और सर्किट गुण के बीच मात्रात्मक संबंधों के और अधिक तेजी से और सटीक जांच की अनुमति.
- आणविक ढ़ाल MEC में स्थलाकृतिक सर्किट के संगठन के लिए महत्वपूर्ण हैं और देखे जा प्रतिदीप्ति या अन्य लेबलिंग तकनीक का उपयोग कर सकते हैं. क्षैतिज स्लाइस, तुलना वें जोई संकेत अलग पृष्ठीय उदर स्थानों पर स्लाइस के बीच तुलना करना होगा, parasagittal तैयारी आसान, और अधिक सुक्ष्म और अधिक विश्वसनीय और पृष्ठीय उदर आणविक ढ़ाल के दृश्य मात्रा का ठहराव के लिए अनुमति देता है.
- Synaptic कनेक्टिविटी में पृष्ठीय उदर ढ़ाल MEC समारोह में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकते हैं. parasagittal टुकड़ा तैयारी MEC, जो जांच कैसे कनेक्शन के भीतर और विशिष्ट स्थानों के बीच और MEC की धुरी पृष्ठीय उदर के साथ सर्किट अखंडता अलग पृष्ठीय उदर पर समान रूप से बनाए रखने के लिए अलग करने के लिए महत्वपूर्ण है के भीतर पृष्ठीय और ventral क्षेत्रों के बीच synaptic कनेक्शन की रक्षा कर सकते हैं स्थानों. यदि कनेक्टिविटी पृष्ठीय - उदर अक्ष के साथ काफी भिन्न होता है, क्षैतिज स्लाइस कम करने के लिए समान रूप से प्रत्येक चरम पर पूरे कार्यात्मक microcircuits शामिल होने की संभावना है.
भविष्य के घटनाक्रम और अनुप्रयोगों
आणविक निर्धारकों का ज्ञानMEC में सेलुलर पहचान neuronal पहचान का निश्चित लक्षण वर्णन सक्षम और पृष्ठीय उदर स्थान के और अधिक सटीक दृढ़ संकल्प की अनुमति होगी.
तैयारी का प्रयोग parasagittal टुकड़ा, सेल प्रकार और कई न्यूरॉन्स की गतिविधियों स्थान विशेष की भौगोलिक विवरण के अनुसार संगठित प्रतिक्रियाओं को एक साथ देखा जा सकता है एक टुकड़ा के भीतर (वोल्टेज संवेदनशील रंगों या कैल्शियम इमेजिंग का उपयोग कर उदाहरण के लिए).
Optogenetic उपकरणों के साथ संयोजन में, parasagittal तैयारी पृष्ठीय - उदर अक्ष के साथ विभिन्न पदों पर चुनिंदा सक्रियण परमिट. पूछ है कैसे अलग पृष्ठीय उदर स्थानों पर microcircuitry स्थानिक लक्षित सक्रियण जवाब - MEC Microcircuit समारोह में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान सकता है.
हमें उम्मीद है कि इस तैयारी शारीरिक गुण में पृष्ठीय - उदर ढ़ाल की जांच के लिए एक सरल, मजबूत और मानकीकृत आधार प्रदान करते हैं और यू सुविधा होगीकैसे इन ढ़ाल MEC की सूचना संसाधन गुणों के योगदान की nderstanding.
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Disclosures
खुलासा कुछ भी नहीं.
Acknowledgments
हम उनके समर्थन के लिए धन्यवाद निम्नलिखित: राष्ट्रमंडल छात्रवृत्ति आयोग (एचपी) ब्रिटेन धन, EPSRC (हिमाचल प्रदेश), बीबीएसआरसी (MFN) और यूरोपीय संघ मैरी क्यूरी क्रिया (MFN).
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