Summary
Forward genetica is een krachtige methode om moleculair niveau te ontrafelen van hoe
Abstract
De wijdverspreide, obligaat intracellulaire, protozoaire parasiet Toxoplasma gondii veroorzaakt opportunistische ziekte in immuno-gecompromitteerde patiënten en veroorzaakt aangeboren afwijkingen bij congenitale infectie. De lytische replicatiecyclus wordt gekenmerkt door drie stappen: 1. actief invasie van een kern gastheercel, 2. replicatie in de gastheercel; 3. actieve uitgang van de gastheercel. Het mechanisme van de uitgang wordt steeds meer gewaardeerd als een uniek, sterk gereguleerde proces, dat nog steeds slecht begrepen wordt op moleculair niveau. De signaalwegen die ten grondslag liggen uitgang werden gekenmerkt door het gebruik van farmacologische stoffen die op verschillende aspecten van de trajecten 1-5. Als zodanig verschillende onafhankelijke triggers van uitgang zijn aangewezen, die allemaal samen op het vrijkomen van intracellulaire Ca 2 +, een signaal dat ook is van cruciaal belang voor de gastheercel invasie 6-8. Dit inzicht op de hoogte van een kandidaat gen aanpak die heeft geleid tot de identificatieMOETEN VOLDOEN van planten, zoals calcium, afhankelijk proteïne kinase (CDPK) betrokken bij uitgang 9. Daarnaast hebben een aantal recente doorbraken in het begrijpen van uitgang is gemaakt met behulp van (chemische) genetische benaderingen 10-12. Om de rijkdom van de farmacologische informatie te combineren met de toenemende genetische toegankelijkheid van Toxoplasma we onlangs een scherm mogelijk maakt de verrijking voor de parasiet mutanten met een defect in gastheercel uitgang 13. Hoewel de chemische mutagenese met behulp van N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) of ethyl methaansulfonaat (EMS) is gebruikt voor tientallen jaren in de studie van Toxoplasma biologie 11,14,15, pas onlangs heeft genetische kaart brengen van mutaties ten grondslag liggen aan de fenotypes routine 16 -18. Bovendien, door het genereren van temperatuurgevoelige mutanten, kan essentiële processen worden ontleed en de onderliggende genen direct geïdentificeerd. Deze mutanten gedragen als wild-type onder de permissieve temperatuur (35 ° C), maar niet proliferate de beperkende temperatuur (40 ° C) als gevolg van de mutatie in kwestie. Hier tonen een nieuw fenotypische screening methode mutanten te isoleren met een temperatuurgevoelige uitgang fenotype 13. De uitdaging voor uitgaand schermen is af te scheiden uit waren hadden van niet-uit waren hadden parasieten, die wordt bemoeilijkt door een snelle re-invasie en de algemene kleverigheid van de parasieten aan gastheercellen. Een eerder vastgestelde uitgaand scherm was gebaseerd op een omslachtige reeks biotinylatie stappen om intracellulair te scheiden van extracellulaire parasieten 11. Met deze methode ook niet het genereren van voorwaardelijke mutanten wat resulteert in zwakke fenotypes. De hier beschreven methode overwint de sterke binding van egressing parasieten door er een glycan concurrent dextransulfaat (DS), die voorkomt parasieten kleven aan de gastheercel 19. Bovendien zijn extracellulaire parasieten specifiek gedood door pyrrolidine dithiocarbamaat (PDTC), die intracellulaire parasieten verlaatongedeerd 20. Daarom, met een nieuwe fenotypische scherm om specifiek parasiet mutanten te isoleren met defecten in geïnduceerde uitgang, kan de kracht van de genetica nu worden ingezet om de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen gastheercel uitgang te ontrafelen.
Protocol
Overzicht
Protocollen aan eerste definiëren dosering van het mutageen leidt tot een 70% doden van parasieten (protocol 1). De volgende procedure wordt verstrekt aan de uitgang geïnduceerde mutanten verrijken van een gemutageniseerde parasiet pool (protocol 2, figuur 2). Dit wordt gevolgd door een protocol bij de incidentie van uitgang mutanten te testen in de verrijkte zwembad, of aan de uitgang fenotype in individuele mutanten (protocol 3) te valideren. Ten slotte wordt een protocol verstrekt aan een parasiet klonen genereren uit verrijkt populaties door beperkende verdunning (protocol 4).
1. Titratie van de mutagene stof
Wees extra voorzichtig, zoals dubbele handschoenen, bij het werken met zeer mutagene stoffen en vloeistoffen. Gescheiden in te zamelen vloeibaar afval voor de juiste afvoer.
- Inoculeer T25 weefselkweekflessen samenvloeiing met de menselijke voorhuid fibroblast (HFF) cellen met 1 ml vers gelyseerd tachyzoites en groeien 18-25 uur bij 37 °; C onder 5% CO2 in ED1 medium (D-MEM aangevuld met 1% hitte-geïnactiveerd foetaal runderserum, 0,2 mM L-glutamine, 50 E / ml penicilline, 50 ug / ml streptomycine en 0,25 ug / ml amfotericine B ). Zie Roos et al.. voor de algemene groei en media van de HFF cellen en parasieten 21.
- Vervangen medium met 10 ml 0,1% Foetaal runderserum medium (verdund 1:10 in ED1 D-MEM) en laat in bevochtigde 37 ° C incubator onder 5% CO2 (zogenaamde "37 ° C incubator" van hier) gedurende 10 min .
- Voeg 0, 12,5, 25, 50 of 100 ul ENU (1 M Stock in DMSO) of EMS (1 M Stock in DMSO) per vat (mutageen werkverdunningen zijn 1,25, 2,5, 5 en 10 mM, respectievelijk). Voeg DMSO 100 ul per fles. Incubeer 4 uur in een 37 ° C incubator.
- Was driemaal 10 seconden bij kamertemperatuur door spoelen monolaag met 10 ml koud PBS (voorgekoeld bij 4 ° C).
- Voeg 5 ml PBS, schraap de monolaag los met een rubberen spatel (cel scraper), langs de cellen geschraapt door middel van een 26,5 G naald om de parasiet fysiek te verwijderen uit de fibroblasten (clip van de as buiten de naald met zware schaar om niet bloot de naald), en het filter met 3,0 micrometer polycarbonaat filter. Meerdere naald passages zal de efficiëntie van het vrijgeven van parasieten van de gastheercel.
- Tel de parasiet concentratie met behulp van een hemocytometer. Laat de parasieten gedurende 5 min in de hemocytomer vestigen vóór het tellen.
- Verdun de parasieten tot 10.000 parasieten per 3 ml in ED1 (voor 10 ml 33.333 parasieten nodig zijn).
- Goed Inoculeer een in een 6 wells plaat met 3 ml van het verdunde parasieten (met 10.000 parasieten). Serieel verwatering van de parasieten 10-voudig over 3 putten in een 6-wells plaat samenvloeiing met HFF cellen met 2,7 ml ED1 door de overdracht van 300 ul uit de eerste put. Laat platen ongestoord in de 37 ° C incubator gedurende 7 dagen.
- Zuig medium, vast 15 min met 3 ml / putje 100% ethanol, vlekmet 3 ml / putje kristalvioletoplossing (12,5 g kristalviolet in 125 ml ethanol met 500 ml 1% ammoniumoxalaat) gedurende 15 minuten spoelen met 3 ml / putje PBS (1 minuut) en drogen. Alle bij kamertemperatuur.
- Tel plaques en selecteer de concentratie van de mutagene stof die nodig is om overleving van 30% van de blootgestelde parasieten (70% doden van de dosering: zie figuur 1) te bereiken. Een dosering van 70% doden is historisch gezien 14 gebruikt en veroorzaakt minder dan 100 puntmutaties per genoom (Farrell, Marth, Gubbels et al.., Manuscript ingediend).
2. Verrijking van uitgaand mutanten (figuur 2)
- Voer mutagenese zoals hierboven beschreven gebruik van een mutageen dosering het induceren van 70% doden. Grow up van de gemutageniseerde bevolking voor een passage in een nieuwe fles van gastheercellen.
- Infecteren van een T25, HFF samenvloeiende weefselkweek kolf met 120.000 vers gelyseerd parasieten van een gemutageniseerde populatie in 10 ml ED1. Incubeer 2 uur in een 35 ° C incubator onder 5% CO2 en bevochtigd (van hieruit zogenaamde "35 ° C incubator").
- Zuig medium en 10 seconden spoelen met 10 ml koud PBS en 10 ml ED1 medium aangevuld met 25 mg / ml dextransulfaat (DS) 13. Incubeer 26 uur in een 40 ° C incubator onder 5% CO2 en bevochtigd (van hieruit zogenaamde "40 ° C incubator").
- Bereid te werken oplossing van uitgang enhancers. Verdun de uitgang inductor naar keuze bij het werken concentratie in een 15 ml Falcon buis met 10 ml HBSSc aangevuld met 25 mg / ml DS. Pre-warm de verdunningen gedurende 30 minuten in een 37 ° C waterbad. Zie tabel 1 voor het bewerken concentraties.
- Zuig medium van de parasiet-geïnfecteerde kolven en voeg voorverwarmde egress inductor oplossing. Incubeer in het 37 ° C incubator gedurende de aangegeven tijdsduren in tabel 1.
- Zuig medium en spoel 10 seconden met 10 ml koud PBS en voeg dan 10 ml ED1 aangevuld met 25 mg / ml DS en 50 uM pyrrolidine dithiocarbamaat (PDTC: add 5 pi 100 mM PDTC Stock in PBS) 13. Incubeer 5 uur in een 35 ° C incubator.
- Zuig medium en spoel een keer 10 seconden met 10 ml PBS (kamertemperatuur) en voeg dan 10 ml ED1 medium. Plaats kolven in de 35 ° C incubator tot parasieten te vernietigen de monolaag: dagelijks schudkolven. Dit herstel duurt ongeveer 7 dagen.
3. Validatie van de mutant fenotype door de uitgang assays
Na het uitvoeren van de verrijking scherm en het opgroeien van de bevolking verrijkt voor een passage in HFF cellen, de fenotypes moeten worden bevestigd door een uitgang assay 11,13. Deze test moet ook worden gebruikt om enkele klonen te valideren na protocol 4.
- Inoculeer 20.000 parasieten per well in een 24-wells plaat met samenvloeiende HFF cellen gekweekt op dekglaasjes (1 ml ED1 medium per well). Incubeer 8 uur in een 35 ° C incubator vervolgens over in een 40 ° C incubator voor 24 uur.
- Wassen met 1 ml / putje PBS (10 seconden bij kamertemperatuur). Voeg 1 ml uitgang inductoren (voorzien van een DMSO alleen negatieve controle), pre-opgewarmd en verdund in HBSSc en incubeer gedurende de tijden beschreven in tabel 1.
- Zuig medium en vast met 1 ml / putje werd 100% methanol gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
- Als ouder parasieten hebben een autofluorescente eiwit werden gebruikt voor de mutagenese, ga dan naar # 3.5 stap 13. Als niet-fluorescerend eiwit tot expressie parasieten werden gebruikt als ouderlijn, vlekken op het vaste dekglaasjes met Diff-Quick vlek 1 min bij kamertemperatuur 11.
- Was 5 min met 1 ml / putje PBS in 24-putjes plaat bij kamertemperatuur.
- Voor fluorescerend eiwit tot expressie parasieten: snel Spoel de dekglaasje in DDH 2 O (dompelen) en op dia's onder gelmount om de fluorescentie-signaal te beschermen. Voor Diff-Quick lood parasieten, was 10 seconden in 100% ethanol en laat de lucht drogen voor de montage op dia.
- Een (fluorescentie) microscoop met een40-60x doel telt het percentage van de vacuolen uit waren hadden ten opzichte van de vacuolen dat bleef intracellulaire (zie figuur 4).
4. Kloon egress mutanten door beperkende verdunning
Na validatie van het fenotype van de verrijkte uitgang mutant bevolking met behulp van protocol 3, de polyklonale populatie moet worden gekloond om enkele parasiet klonen te verkrijgen.
- Tel parasiet populatie in een hemocytometer en verdun tot een concentratie van 500 parasieten per ml in ED1 medium.
- In een 384-wells plaat met daarin een confluente monolaag van HFF cellen, vervangen door het medium met 40 ul / putje van ED1 medium met behulp van een multi-channel pipet. Zoals getoond in figuur 5, kunnen vier polyklonale populaties gekloneerd per plaat als volgt: pipet 40 ul / putje verdunde mutant 1 in putten C3-C12, mutant 2 in putten C13-C22, mutant 3 in putten H3-H12 en mutant 4 in putten H13-H22 (eind volume in putten is nu 80 pi). Met behulp van een multi-channel pipet, pipet de solution en neer 5 keer, vervolgens over 40 pi de rij onder de startrij (van rij C naar D of rij H I). Verder deze 2-voudige seriële verdunningen door rij G (mutanten 1 en 2) of rij N (mutanten 3 en 4). Gooi de extra 40 pi van de laatste rij. Incubeer in een 35 ° C incubator gedurende 7-10 dagen zonder verstoring van de plaat.
- Controleer de putjes op een omgekeerde microscoop met 10 tot 20 doel voor de aanwezigheid van enkelvoudige platen, zichtbaar "gaten" in de monolaag.
- Kies 4 putten per mutant met een plaquette en breng de parasieten in een weefselkweek fles samenvloeiing met HFF cellen en gevuld met ED1 medium. Grow de parasieten in een 35 ° C incubator, schud de flesjes dagelijks aan de extracellulaire parasieten verspreiden. Dit duurt gewoonlijk 7 dagen.
5. Representatieve resultaten
De mutagene ENU en EMS zijn niet stabiel wanneer ze worden bewaard gedurende een lange periode van tijd. Daarom testen mutagene kracht vande voorraden is van cruciaal belang om reproduceerbare resultaten te verkrijgen. Typische resultaten titratie en doden curves voor ENU en EMS in figuur 1. Wordt echter aanbevolen om plaque assays uitgevoerd voor elke mutagenèse experiment na te gaan of de juiste dosis werd gebruikt. Voor het behoud van de diversiteit in de gemutageniseerde parasiet bevolking, is het belangrijk door te gaan met de uitgang mutant scherm zo snel mogelijk. Doorgaans wordt een passage van de parasieten in een nieuwe fles uitgevoerd om te laten de overlevende parasieten te herstellen voordat ze naar voren met het scherm. Moet worden bedacht dat dit te doen zal resulteren in verdeling van de mutanten. Daarom kan niet uitgesloten worden dat meerdere klonen mutanten geïsoleerd na het voltooien van de volledige procedure exact hetzelfde genotype bevatten. Om te voorkomen dat het isoleren van de dezelfde mutant meerdere keren is het aanbevolen om slechts een enkele uitgang mutant per mutagenese te isoleren, tenzij hun fenotypen (bv. differentiële uitgang inductor gevoeligheden) zijnzeer verschillend. Aan de andere kant niet elk scherm resultaten isolatie van mutanten met het gewenste fenotype. Met name de Ca2 +-ionofoor A23187 resistent fenotype is zeldzaam zijn meerdere mutagenese experimenten en schermen te isoleren een uitgang mutant. Daarom wordt aanbevolen tot 5-10 mutagenese en scherm experimenten uit te voeren in parallel.
Verrijking kracht van het scherm werd getest door het mengen van een bekende uitgang mutant met het wild-parasieten in verschillende verhoudingen. Deze mixen werden onderworpen aan het scherm en de incidentie van het mutante fenotype van de verrijkte bevolking werd beoordeeld. Door het gebruik van wild-type parasieten uiten cytoplasmatische RFP en een mutant lijn te drukken cytoplasmatisch YFP de incidentie snel kunnen worden vastgesteld door middel van flowcytometrie (figuur 3) 13. De resultaten tonen aan dat mutant fenotypen routinematig worden verrijkt met 80% zuiverheid, te beginnen met een uitgang mutant parasiet 10.000 wild-type parasites 13. Wanneer de uitgang mutant: wild-type parasiet start verhouding 1:100.000 parasieten de geïsoleerde populatie slechts 1-2% (1:100) uitgang mutanten. Daarom is de verrijking kracht van het scherm is 1.000-voudig. Omdat het scherm begint met enting van 120.000 parasieten, van die typisch 70% levensvatbaar zijn, hebben we meestal voeren twee ronden van verrijking. De geïsoleerde parasieten zijn opgegroeid tussen de verrijking rondes. Deze procedure leidt tot een 100% mutant bevolking ook bij het starten met 1:1.000.000 uitgang mutant: wild-type parasieten.
De uitgang test te valideren en te karakteriseren van de fenotypes is een veelvoud van gastheercel infectie die differentiatie van de individuele vacuolen mogelijk maakt. Dit is vooral van belang bij het analyseren van omstandigheden met hoge percentages van uitgang als de individuele parasieten zijn versnipperd. Zoals getoond in figuur 4 als waren hadden populaties niet goed gescheiden is het gemakkelijk te onderschatten percentagevan uitgang door het tellen twee waren hadden vacuoles als een vacuole. Aangezien de uitgang en de invasie zijn processen, en een aantal temperatuurgevoelige fenotypes vertonen een milde fenotype bij de lagere temperatuur, zullen niet alle mutanten hebben soortgelijke invasie efficiëntie. Dergelijke mutanten moet dus worden ingeënt tegen een aantal maal hogere doseringen om een voldoende hoge dichtheid vacuole te verkrijgen voor een nauwkeurige beoordeling van hun uitgang fenotype. Bovendien, sommige uitgang inductoren niet efficiënt te stimuleren uitgang van vacuolen met vier parasieten of minder. Als zodanig is het belangrijk dat vacuoles acht parasieten of meer bevatten bij het starten van de uitgang assay. In ons lab hebben we het scherm mutanten geïsoleerd met een bepaalde uitgang versterker tegen andere uitgang enhancers. Door een profiel hun cross-reactiviteit van de mutanten kunnen worden ingedeeld in verschillende klassen. Ten slotte zullen niet alle uitstappen mutanten zijn temperatuurgevoelig. In het bijzonder mutanten geïsoleerd met uitgang inductoren triggering stappen voor de release van intracellular Ca2 + gevoelig zijn niet temperatuur gevoelig fenotype. Dit komt door de parallelle trajecten die kunnen leiden tot uittreden voor het signaal convergeert de vrijmaking van intracellulair Ca2 +.
Figuur 1. Chemische mutageen dosistitratie. A. plaque assays uitgevoerd in een 6-wells plaat met verschillende concentraties EMS en verschillende aantallen parasieten per ook aangegeven. De witte vlekken parasiet plaques gevormd in de HFF monolaag. B, C. overlevingscurven van parasieten bij blootstelling aan verschillende doseringen EMS (B) en ENU (C). Overleving werd bepaald door plaque assays. Een dosering induceren 70% gedood wordt gekozen voor mutagenèse experimenten. Gemiddelden van drie onafhankelijke experimenten + / - standaardafwijking worden weergegeven.
Figuur 3. Typische verrijking van uitgang mutant fenotypen. Enrichment resultaten van een uitgang mutant gemengd wild-type parasieten in verschillende verhoudingen (x-as). Het percentage uitgang mutant fenotypen in de populatie gegroeid na het scherm wordt uitgezet op de y-as en werd bepaald door flow cytometrie (uitgang mutant parasieten uitgedrukt cytoplasmatische YFP wild-type parasieten uitgedrukt cytoplasmic RFP). Resultaten van drie onafhankelijke experimenten worden vertegenwoordigd door rood, blauw en groen datapunten. Aangenomen van Eidell et al.. 13.
Figuur 4. Typische resultaten van een uitgang assay. A. Pijlen geven vier intact vacuoles met 4-8 parasieten. B. Pijlen geven vier groepen van verspreide parasieten als gevolg van vier onafhankelijke uit waren hadden vacuolen. Egress werd geïnduceerd door A23187 (B) of DMSO als een negatieve controle (A). Parasieten drukken cytoplasmatische YFP 22.
Figuur 5. Serial verwatering voor klonale parasiet lijnen. Vier polyklonale populaties (rood, blauw, geel, groen) worden serieel verdund in een 384-wells plaat samenvloeiing met HFF cellen. Rij C en ik ontvang 10 parasieten per goed enzijn 2-voudig verdunde (40 pi + 40 pi) tot rijen H en N resp. De schaduw van grijs geeft aan het dalende aantal parasieten per putje. Meestal worden enkele klonen te vinden in rijen DF en JL.
| Samenstelling | Voorraad | Werkconcentratie | il nodig T25 (10 ml) | Incubatie tijd (min) |
| DTT | 1 M in DMSO | 5 mM | 50 | 15 |
| ethanol | 190 standaardsterkte | 5% | 500 | 30 |
| A23187 | 2 mM in DMSO | 1 pM | 5 | 5 |
| nigericin * | 2 mM in DMSO | 10 uM | 50 | 30 |
* Nigericin kan niet worden gebruikt in de verrijkenment scherm als de parasieten niet overleven nigericin stimulatie, alleen nigericin gebruiken in de validatie van uitgang mutanten.
Tabel 1. Egress inductoren gebruikt in procedures. Verdunnen in 10 ml HBBSc met 25 mg / ml DS voor het scherm, of geen DS voor mutant validatie (egress test). Alle verbindingen van Sigma-Aldrich.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De beschreven protocol biedt een efficiënte methode om Toxoplasma mutanten te isoleren met een uitgang defect. We hebben succes geïsoleerd mutanten langs verschillende stappen van de uitgang route, waarvan een dubbele invasie fenotype 13. Mogelijke effecten op de invasie kan worden bepaald met behulp van de zogenaamde rood-groen-test, die zich onderscheidt van niet-inval parasieten binnengevallen door differentiële antilichaam kleuring 23,24. Zowel invasie en uitgang assays het kan geschikt zijn een autofluorescente eiwitmerker drukken in het cytoplasma van de parasieten 13,22. Indien de parasieten worden gemutageniseerd al geven een fluorescerend eiwit zou kunnen interfereren met extra fenotypische karakterisatie van immunofluorescentie later. Het is altijd mogelijk om een fluorescente marker toe te voegen aan een mutant na de isolatie. Zoals beschreven, een eenvoudige, niet fluorescerende alternatief Diff-Quick kleuring voor uitgang.
t "> Historisch gezien is de mutagene stof ENU is toegepast op Toxoplasma genetica 14. Echter, bij voorkeur ENU doelstellingen op basenparen 25, die we gevalideerd in Toxoplasma (Farrell, Marth, Gubbels et al.., manuscript ingediend). Omdat de frequentie van een / T lager in aminozuursequentie coderende sequentie dan niet-coderende sequentie, wordt de meeste mutaties geïnduceerd door ENU in niet-coderende sequentie. echter EMS typisch een voorkeur voor GC baseparen, te weten coderende sequenties. De meeste temperatuurgevoelige oorsprong mutaties in codon veranderende mutaties, een reden om EMS gebruiken op ENU.Hoewel een verscheidenheid van uitgaand inductoren triggering verschillende aspecten van de signaalweg zijn beschreven in tabel 1, zijn er nog andere geneesmiddelen gebruikten waarvan bekend om op te treden op de processen die nodig zijn voor de uitgang. Zo is caffeine aangetoond microneme secretie induceren extracellulaire parasieten, die vereist is vooruitgang en de invasie 7,26,27. Echter, cafeïne niet worden gebruikt uitgang activeren van geïnfecteerde cellen, waarschijnlijk omdat cafeïne niet efficiënt diffunderen door de gastheercel naar de parasieten die in een vacuolaire compartiment. Ook een uitgang trekker de accumulatie van abscisinezuur, maar het is onmogelijk om te screenen op mutanten in dit pad vanaf abscisinezuur niet diffunderen in de gastheercel 28. En zoals aangegeven in tabel 1, de K +-ionofoor nigericin een efficiënte uitgang inductor 5 echter niet overleven parasieten nigericin stimulatie. Daarom is deze verbinding ook niet geschikt voor het scherm. In een alternatieve, meer uitgebreide screening procedure voor ionofoor mutanten werd gemeld dat veel mutanten met een vertraging in ionofoor geïnduceerde uitgang langdurige extracellulaire blootstelling aan ionofore 11 overleven. Er werden echter geen uitgang mutanten tegen geïnduceerde uitstappen ionofoor geïsoleerd in dit scherm, het maken van de fenotypeszwakker. Het is thans duidelijk of mutanten met resistentie langdurige blootstelling aan andere uitgang induceren kan worden verkregen.
Omdat er lijkt te zijn een aantal parallelle paden die kunnen leiden tot uitstappen, rijst de vraag naar welke zou het meest relevant in een (experimentele) infectie. Het lijkt erop dat het immuunsysteem aanvallen op de geïnfecteerde cel zijn de belangrijkste trekker van uitgang 29. Het is mogelijk dergelijke triggers gebruiken in de mutant scherm. Zo kan CD8 T-cellen te stimuleren uitgang via zowel Fas-gemedieerde en perforine gemedieerde route 30. Daarom met een FasL die humaan T-cellen als gastheercellen de uitgang scherm kunnen uitgang worden veroorzaakt door incubatie met een anti-Fas antilichaam verrijken mutanten in deze route.
Om genetisch in kaart brengen van de mutaties ten grondslag liggen aan de uitgang fenotypes, twee verschillende benaderingen zijn beschikbaar in Toxoplasma. In tegenstelling tot genetisch model organismen die alleelic segregatie door kruising is geen optie, omdat de seksuele cyclus van de parasiet alleen kan worden geactiveerd in de darm van de kat. Naast niet haalbaar is en een slechte efficiëntie van dit proces, parasiet stammen gekweekt in het lab heel snel verliezen het vermogen om katten besmetten. Om dit probleem te omzeilen efficiënte wild-type cosmidenbibliotheek complementatie benadering is ontwikkeld, dat aangevuld 90% van de celdeling mutanten 18. Daarnaast is onlangs hebben we complete genoom opgericht resequencing protocollen bij alle mutaties veroorzaakt in het genoom te identificeren (Farrell, Marth, Gubbels et al.., Manuscript ingediend). Typisch identificeren we 20-70 single nucleotide polymorfismen in chemisch geïnduceerde mutanten. Tussen deze twee benaderingen zijn we in staat geweest om de oorzakelijke mutatie in alle chemisch geïnduceerde mutanten gekenmerkt to-date te identificeren.
Al met al de beschreven scherm biedt een veelzijdig instrument dat naar voren genetische dissectie van zalde uitgang paden. We verwachten dat deze zullen verschillende onderdelen van de signaalweg bekend dat er op basis van farmacologische gegevens te identificeren, maar waarvoor geen goede kandidaat genen konden worden geïdentificeerd in de Toxoplasma genoom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Wij hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door de Amerikaanse Heart Association Scientist Development Grant 0635480N en de National Institutes of Health onderzoek te verlenen AI081220. BIC wordt ondersteund door een Tempeliers Eye Foundation onderzoek te verlenen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ENU | Sigma-Aldrich | N3385 | 1 M Stock in DMSO, store at -20 °C |
| EMS | Sigma-Aldrich | M0880 | 1 M Stock in DMSO, store at -20 °C |
| Dextran Sulfate | Sigma-Aldrich | D4911 | |
| PDTC | Sigma-Aldrich | P8765 | 100 mM Stock in PBS |
| Diff Quick | EMD Chemicals | 65044-93 | |
| Filter holder | Cole-Parmer | 540100 | |
| 3 μm polycarbonate filter | Whatman Schleicher Schuell | 110612 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 1475 | |
| CO2 incubators | Various manufacturers | Humidified, 5% CO2, at 35, 37 and 40 °C | |
| Fluorescence microscope | Various manufacturers | Ideally inverted, wide-field with 63x or 100x oil objective | |
HBSSc (according to Black et al.11): |
|||
|
|||
References
- Carruthers, V. B., Moreno, S. N., Sibley, L. D. Ethanol and acetaldehyde elevate intracellular [Ca2+] and stimulate microneme discharge in Toxoplasma gondii. Biochem. J. 342 (Pt 2), 379-386 (1999).
- Moudy, R., Manning, T. J., Beckers, C. J. The loss of cytoplasmic potassium upon host cell breakdown triggers egress of Toxoplasma gondii. J. Biol. Chem. 276 (44), 41492-41501 (2001).
- Silverman, J. A. Induced activation of the Toxoplasma gondii nucleoside triphosphate hydrolase leads to depletion of host cell ATP levels and rapid exit of intracellular parasites from infected cells. J. Biol. Chem. 273 (20), 12352-12359 (1998).
- Stommel, E. W., Ely, K. H., Schwartzman, J. D., Kasper, L. H. Toxoplasma gondii: dithiol-induced Ca2+ flux causes egress of parasites from the parasitophorous vacuole. Exp. Parasitol. 87 (2), 88-97 (1997).
- Fruth, I. A., Arrizabalaga, G. Toxoplasma gondii: induction of egress by the potassium ionophore nigericin. Int. J. Parasitol. 37 (14), 1559-1567 (2007).
- Endo, T., Sethi, K. K., Piekarski, G. Toxoplasma gondii: calcium ionophore A23187-mediated exit of trophozoites from infected murine macrophages. Exp. Parasitol. 53 (2), 179-188 (1982).
- Hoff, E. F., Carruthers, V. B. Is Toxoplasma egress the first step in invasion. Trends Parasitol. 18 (6), 251-255 (2002).
- Wetzel, D. M., Chen, L. A., Ruiz, F. A., Moreno, S. N., Sibley, L. D. Calcium-mediated protein secretion potentiates motility in Toxoplasma gondii. J. Cell. Sci. 117 (Pt 24), 5739-5748 (2004).
- Lourido, S. Calcium-dependent protein kinase 1 is an essential regulator of exocytosis in Toxoplasma. Nature. 465 (7296), 359-362 (2010).
- Arrizabalaga, G., Ruiz, F., Moreno, S., Boothroyd, J. C. Ionophore-resistant mutant of Toxoplasma gondii reveals involvement of a sodium/hydrogen exchanger in calcium regulation. J. Cell. Biol. 165 (5), 653-662 (2004).
- Black, M. W., Arrizabalaga, G., Boothroyd, J. C. Ionophore-resistant mutants of Toxoplasma gondii reveal host cell permeabilization as an early event in egress. Mol. Cell. Biol. 20 (24), 9399-9408 (2000).
- Chandramohanadas, R. Apicomplexan Parasites Co-Opt Host Calpains to Facilitate Their Escape from Infected Cells. Science. , (2009).
- Eidell, K. P., Burke, T., Gubbels, M. J. Development of a screen to dissect Toxoplasma gondii egress. Mol. Biochem. Parasitol. 171 (2), 97-103 (2010).
- Pfefferkorn, E. R., Pfefferkorn, L. C. Toxoplasma gondii: isolation and preliminary characterization of temperature-sensitive mutants. Exp. Parasitol. 39 (3), 365-376 (1976).
- Pfefferkorn, E. R., Schwartzman, J. D., Kasper, L. H. Toxoplasma gondii: use of mutants to study the host-parasite relationship. Ciba. Found. Symp. 99, 74-91 (1983).
- Striepen, B. Genetic complementation in apicomplexan parasites. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99 (9), 6304-6309 (2002).
- White, M. W. Genetic rescue of a Toxoplasma gondii conditional cell cycle mutant. Mol. Microbiol. 55 (4), 1060-1071 (2005).
- Gubbels, M. J. Forward Genetic Analysis of the Apicomplexan Cell Division Cycle in Toxoplasma gondii. PLoS Pathog. 4 (2), e36-e36 (2008).
- Carruthers, V. B., Hakansson, S., Giddings, O. K., Sibley, L. D. Toxoplasma gondii uses sulfated proteoglycans for substrate and host cell attachment. Infect. Immun. 68 (7), 4005-4011 (2000).
- Camps, M., Boothroyd, J. C. Toxoplasma gondii: selective killing of extracellular parasites by oxidation using pyrrolidine dithiocarbamate. Exp. Parasitol. 98 (4), 206-214 (2001).
- Roos, D. S., Donald, R. G., Morrissette, N. S., Moulton, A. L. Molecular tools for genetic dissection of the protozoan parasite Toxoplasma gondii. Methods Cell Biol. 45, 27-63 (1994).
- Gubbels, M. J., Li, C., Striepen, B. High-throughput growth assay for Toxoplasma gondii using yellow fluorescent protein. Antimicrob. Agents Chemother. 47 (1), 309-316 (2003).
- Carey, K. L., Westwood, N. J., Mitchison, T. J., Ward, G. E. A small-molecule approach to studying invasive mechanisms of Toxoplasma gondii. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101 (19), 7433-7438 (2004).
- Kafsack, B. F., Carruthers, V. B., Pineda, F. J. Kinetic modeling of Toxoplasma gondii invasion. J. Theor. Biol. 249 (4), 817-825 (2007).
- Hanash, S. M., Boehnke, M., Chu, E. H., Neel, J. V., Kuick, R. D. Nonrandom distribution of structural mutants in ethylnitrosourea-treated cultured human lymphoblastoid cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 85 (1), 165-169 (1988).
- Kafsack, B. F. Rapid membrane disruption by a perforin-like protein facilitates parasite exit from host cells. Science. 323 (5913), 530-533 (2009).
- Lovett, J. L., Marchesini, N., Moreno, S. N., Sibley, L. D. Toxoplasma gondii microneme secretion involves intracellular Ca(2+) release from inositol 1,4,5-triphosphate (IP(3))/ryanodine-sensitive stores. J. Biol. Chem. 277 (29), 25870-25876 (2002).
- Nagamune, K. Abscisic acid controls calcium-dependent egress and development in Toxoplasma gondii. Nature. 451 (7175), 207-210 (2008).
- Tomita, T., Yamada, T., Weiss, L. M., Orlofsky, A. Externally triggered egress is the major fate of Toxoplasma gondii during acute infection. J. Immunol. 183 (10), 6667-6680 (2009).
- Persson, E. K. Death receptor ligation or exposure to perforin trigger rapid egress of the intracellular parasite Toxoplasma gondii. J. Immunol. 179 (12), 8357-8365 (2007).
