Summary
Вперед генетики мощный метод, чтобы разгадать молекулярном уровне, как
Protocol
Обзор
Протоколы предоставляются сначала определить дозы мутагенов приводит к 70% гибели паразитов (протокол 1). Следующая процедура предусмотрена для обогащения индуцированных мутантов выход из мутагенизированный бассейн паразита (протокол 2, рисунок 2). Это сопровождается протоколом проверить частоту выхода мутантов в бассейне обогащенный, или для проверки выхода фенотипа в отдельных мутантов (протокол 3). Наконец, протокол обеспечивает для создания одного клона паразита из обогащенного населения путем ограничения разведения (протокол 4).
1. Титрование мутаген
Будьте особенно осторожны, такие как двойные перчатки при работе с высоко мутагенных соединений и жидкостей. Сбор жидких отходов отдельно для надлежащей утилизации.
- Инокулировать T25 культуры тканей колбы сливающийся с человеческой плоти фибробластов (HFF) клеток в 1 мл свежей лизируются tachyzoites и расти 18-25 часов при температуре 37 °; С в 5% CO 2 в Ed1 среды (D-MEM с добавлением 1% тепла инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки, 0,2 мМ L-глутамина, 50 ЕД / мл пенициллина, 50 мкг / мл стрептомицина и 0,25 мкг / мл амфотерицина ). Смотрите Роос и соавт. для общего роста и СМИ HFF клеток и паразитов, 21.
- Замените среду с 10 мл 0,1% эмбриональной телячьей сыворотки среде (разбавленной Ed1 1:10 в D-MEM) и оставить в увлажненном 37 ° C инкубатор под 5% CO 2 (так называемый "37 ° C инкубатор" здесь и далее) в течение 10 минут .
- Добавить 0, 12,5, 25, 50 или 100 мкл ЕНУ (1 М фондовой ДМСО) или EMS (1 М фондовой ДМСО) в колбу (мутаген рабочего разведения будет 1.25, 2.5, 5 и 10 мм, соответственно). Добавить DMSO до 100 мкл в каждую колбу. Выдержите в течение 4 часов при 37 ° C инкубатора.
- Промыть три раза в течение 10 секунд при комнатной температуре путем промывки монослоя с 10 мл холодного PBS (предварительно охлаждается при температуре 4 ° С).
- Добавьте 5 мл PBS, очистить монослоя свободно с резиновой полицейский (ячейка экрапертуры), проходят через клетки Царапины на 26,5 игла G физически удалить паразита из фибробластов (клип с вала вне иглы с тяжелыми ножницами обязанность не подвергать иглы) и фильтра с 3,0 мкм поликарбоната фильтр. Несколько проходов иглой позволит повысить эффективность выпуска паразитов из клетки-хозяина.
- Считайте концентрации паразитов помощью гемоцитометра. Пусть паразиты решить в течение 5 мин в hemocytomer до подсчета голосов.
- Разбавить до 10000 паразитов паразиты в 3 мл в Ed1 (по 10 мл 33 333 паразитов нужно).
- Инокулировать одной скважины в 6-луночный планшет с 3 мл разведенной паразитов (содержащих 10 000 паразитов). Поочередно разводить паразитов в 10 раз по 3 скважины в 6-луночного планшета сливающийся с клетками HFF содержащие 2,7 мл Ed1 путем передачи 300 мкл из первой скважины. Оставьте плиты спокойно в 37 ° C инкубаторе в течение 7 дней.
- Аспирируйте среды, исправить 15 мин с 3 мл / и 100% этанола, пятнос 3 мл / и кристалл фиолетовый раствор (12,5 г кристаллического фиолетового в 125 мл этанола, смешать с 500 мл 1% оксалата аммония) в течение 15 минут, смойте 3 мл / и PBS (1 минута) и сухой воздух. Все при комнатной температуре.
- Граф бляшек и выберите концентрации мутагенов, необходимых для достижения выживание 30% выставленных паразитов (70% убийстве дозировка: см. Рисунок 1). Дозировка 70% убийств было использовано исторически 14 и индуцированных менее 100 точечных мутаций в геноме (Farrell, Marth, Gubbels и соавт., Рукопись представлена).
2. Обогащение выхода мутантов (рис. 2)
- Выполните мутагенез, как описано выше, с использованием дозы мутагенов вызывать 70% убийств. Расти мутагенизированный населения за один проход в новую колбу клеток хозяина.
- Инфекция T25, HFF сливной колбу с культурой ткани 120000 свежих лизируются паразитов мутагенизированный населением в 10 мл Ed1. Выдержите в течение 2 часов в 35 ° C инкубатор под 5% CO2 и увлажнение (с hereon под названием "35 ° C инкубатор").
- Аспирируйте среднего и промыть 10 секунд с 10 мл холодного PBS, а затем добавить 10 мл Ed1 среде с 25 мг / мл сульфата декстрана (DS) 13. Выдержите в течение 26 часов в 40 ° C инкубатор под 5% CO 2 и увлажненный (от hereon под названием "40 ° C инкубатор").
- Подготовка рабочего раствора выход усилителей. Развести выход индуктором выбор на рабочей концентрации в 15 мл Сокол пробирку, содержащую 10 мл HBSSc дополнена с 25 мг / мл DS. Предварительно теплой разведения в течение 30 мин при 37 ° С водяной бане. См. Таблицу 1 для работы концентрациях.
- Аспирируйте среды от паразитов-инфицированные колб и добавить предварительно нагретой выход индуктор решение. Инкубируйте в 37 ° C инкубатор для времен, указанных в таблице 1.
- Аспирируйте среднего и промыть 10 секунд с 10 мл холодного PBS, а затем добавить 10 мл Ed1 дополнено 25 мг / мл DS и 50 мкМ пирролидина дитиокарбаматных (PDTC: объявлениег 5 мкл 100 мМ PDTC фондовой PBS) 13. Инкубировать 5 часов 35 ° C инкубатора.
- Аспирируйте среднего и промыть 10 секунд один раз 10 мл PBS (комнатной температуры), а затем добавить 10 мл Ed1 среды. Положите колбы обратно в 35 ° C до инкубатор паразитов уничтожить монослоя: дрожание колбы в день. Это восстановление занимает около 7 дней.
3. Проверка мутантных фенотипов на выходе анализов
После выполнения обогащения экран и растут обогащение населения за один проход в HFF клеток, фенотип должны быть подтверждены на выходе 11,13 анализа. Этот анализ должен также использоваться для проверки одного клона после протокол 4.
- Инокулировать 20000 паразитов на лунку в 24-луночного планшета содержащие вырожденные клетки HFF, выращенные на покровных (1 мл средней Ed1 на лунку). Инкубируйте 8 часов в 35 ° C инкубатор затем передать в 40 ° C инкубаторе в течение 24 часов.
- Промыть 1 мл / и PBS (10 секунд при комнатной температуре). Добавить 1 мл выход индукторов (в том числе ДМСО только отрицательный контроль), предварительно нагревают и разбавляют в HBSSc и инкубировать раз описаны в таблице 1.
- Аспирируйте среднего и зафиксировать с 1 мл / и 100% метанола в течение 15 мин при комнатной температуре.
- Если родитель паразитов выражения autofluorescent белка были использованы для мутагенеза, переходите к шагу # 3.5 13. Если не флуоресцентный белок выразил паразиты были использованы в качестве материнской линии, пятна фиксированной покровных с Diff-Quick пятно в течение 1 мин при комнатной температуре 11.
- Вымойте 5 мин с 1 мл / и PBS в течение 24-луночного планшета при комнатной температуре.
- Для флуоресцентного белка выражения паразитов: быстро промыть покровное в DDH 2 O (погружение) и установить на слайдах под gelmount для защиты сигнала флуоресценции. Для быстрого Diff-окрашенных паразитов, промыть 10 секунд на 100% этанола и пусть воздушно-сухой перед установкой на слайде.
- Используя (флуоресценция) микроскопа с40-60x целью подсчитать процент вакуоли egressed против вакуолей, которые остались внутриклеточной (см. Рисунок 4).
4. Клонирование выход мутантов предельного разбавления
После проверки фенотипа обогащенного выход мутант населения, использующего протокол 3 поликлональных населения должны быть записаны на одном получения клонов паразита.
- Граф паразита населения в гемоцитометре и разбавить до концентрации 500 паразитов на миллилитр Ed1 среды.
- В 384-луночного планшета содержащих сливной монослоя клеток HFF, замените носитель с 40 мкл / лунку Ed1 среде с использованием многоканальной пипеткой. Как показано на рисунке 5, четыре поликлональных популяций могут быть клонированы в пластинку следующим образом: пипеткой 40 мкл / лунку разбавленного мутант 1 в скважинах C3-C12, мутант 2 в скважинах C13-C22, мутант 3 в скважинах H3-H12, и мутант 4 в скважинах H13-H22 (конец объема скважин в настоящее время 80 мкл). С помощью многоканальной пипетки, пипетки зольution вверх и вниз в 5 раз, а затем перенести 40 мкл на строку ниже начальной строке (строка из C в D или строки Н I). Продолжайте это в 2 раза серийных разведений через ряд G (мутанты, 1 и 2) или строки N (мутанты, 3 и 4). Откажитесь от дополнительных 40 мкл с последнего ряда. Инкубируйте в 35 ° C инкубатора в течение 7-10 дней, не нарушая пластины.
- Проверьте скважин на инвертированный микроскоп с 10-20х цель на наличие одной таблички, видно как "дыры" в монослое.
- Возьмите 4 скважины в мутанта с одной доски и передавать паразитов в колбу культуры тканей сливающийся с клетками HFF и наполнен Ed1 среды. Рост паразитов в 35 ° C инкубатора; потрясти колбы ежедневно, чтобы разогнать внеклеточной паразитов. Это обычно занимает от 7 дней.
5. Представитель Результаты
Мутагенов ЕНУ и EMS не стабильны при хранении в течение длительного периода времени. Таким образом, тестирование мутагенного силуакции имеет решающее значение для получения воспроизводимых результатов. Типичные результаты титрования и убийство кривые для ЕНУ и EMS показано на рисунке 1. Тем не менее, рекомендуется проводить тесты доски для каждого эксперимента мутагенеза чтобы убедиться, что соответствующие дозы были использованы. Для поддержания разнообразия в популяции паразита мутагенизированный, важно, чтобы продолжить выход мутантов экране как можно быстрее. Как правило, за один проход паразитов в новой колбе проводится, чтобы выжить паразиты восстановления прежде, чем идти вперед с экрана. Следует иметь в виду, что делать это приведет к разделению мутантов. Поэтому не исключено, что несколько клонального мутантов изолированы после завершения всей процедуры содержат одни и те же генотипа. Чтобы избежать изоляции же мутант несколько раз рекомендуется изолировать только один мутантный выход в мутагенеза, если их фенотипа (например, чувствительность дифференциального выхода индуктор) являютсяочень отличаются друг от друга. С другой стороны, не каждый экран приводит к изоляции мутантов с нужными фенотипа. В частности, Ca 2 +-ионофором А23187 устойчивый фенотип встречается редко и требует нескольких экспериментов мутагенеза и экраны для изоляции одного мутанта выход. Поэтому рекомендуется выполнять 5-10 мутагенеза и экран эксперименты параллельно.
Обогащение власть на экране была проверена путем смешивания известный выход мутантов дикого типа паразитов в различных соотношениях. Эти смеси были подвергнуты экрана и частота мутантного фенотипа в популяции обогащенного оценивали. При использовании дикого типа паразитов выражения цитоплазматических ППП и мутантов линии выражения цитоплазматических YFP случаев может быть быстро установлена с помощью проточной цитометрии (рис. 3) 13. Результаты показывают, что мутантный фенотип может быть регулярно, обогащенного до 80% чистоты, начиная с 1 выход мутантов паразита на 10000 дикого типа рarasites 13. Однако, когда выход мутантов: дикий тип паразита начала соотношении 1:100000 паразитов, изолированной популяции составляет всего 1-2% (1:100) мутантов выход. Таким образом, обогащение власть экрана составляет 1000 раз. Так как экран начинает с прививкой 120000 паразитов, из которых обычно 70% жизнеспособных, мы обычно выполняют два этапа обогащения. Изолированной паразитов выросло с обогащением раундов. Эта процедура приводит к 100% мутантных населения даже тогда, когда, начиная с выхода 1:1000000 мутант: дикий тип паразитов.
Выход теста для проверки и характеризуют фенотипов требует множества клетки-хозяина инфекция, которая позволяет дифференцировать отдельных вакуолей. Это особенно важно при анализе условий с высоким процентом выхода, как отдельных паразитов разбросаны вокруг. Как показано на рисунке 4, если egressed население не очень хорошо отделены легко недооценить процентисходящего от считать двух egressed вакуолей как одна амеба. Так как выход и вторжения являются взаимосвязанными процессами, и некоторые чувствительные к температуре фенотипов отображения мягкий фенотип при более низкой температуре, не все мутанты будут иметь аналогичные эффективности вторжения. Такие мутанты поэтому должны быть привиты в несколько раз более высокие дозы для получения достаточно высокой плотности вакуоль для точной оценки их выхода фенотипа. Кроме того, некоторые индукторы выход не эффективно стимулировать выход из вакуолей, содержащих четыре или меньше паразитов. Таким образом, важно, что вакуоли содержат восемь паразитов или более при запуске выход анализа. В нашей лаборатории мы мутанты экран изолированы частности выход усилителя с другими усилителями выход. По профилирования их перекрестной реактивности мутантов могут быть сгруппированы в различные классы. Наконец, не все мутанты выход будет чувствительных к температуре. В частности мутантов изолировать выход индукторы запуска шагов до выхода intracellulaГ Са 2 + склонны к не-чувствительных к температуре фенотипов. Это связано с параллельным путям, что может привести к выходным до сигнала сходится на выпуске внутриклеточного Са 2 +.
Рисунок 1. Химическая мутаген доза титрования. Анализы А. Налет проводится в 6-луночный планшет с использованием различных концентраций EMS и различного числа паразитов на одну скважину, как указано. Белые пятна образуются бляшки паразита в монослое HFF. B, C. Кривые выживаемости паразитов при воздействии различных доз EMS (B) и ЕНУ (C). Выживаемость оценивалась по налета анализов. Дозировка вызывая 70% убийств выбран для мутагенеза экспериментов. Средние трех независимых экспериментах + / - стандартное отклонение показано на рисунке.
Рисунок 3. Типичные обогащения выход мутант фенотипы. Обогащению результаты выхода мутантов смешивается с диким типом паразитов в различных соотношениях (оси Х). Процент выхода мутант фенотипы населения выросли после того, как на экране строится на оси ординат и оценивали с помощью проточной цитометрии (выход мутантов паразитов выразил цитоплазматических YFP, дикого типа паразитов выразил суtoplasmic RFP). Результаты трех независимых экспериментов представлены красные, синие и зеленые точки данных. Принятые от Eidell соавт. 13.
Рисунок 4. Типичные результаты анализа выход. . Стрелками отмечены четыре нетронутыми вакуоли содержащие 4-8 паразитов. B. Стрелками отмечены четыре группы рассеянного паразитов отражает четыре независимых egressed вакуоли. Выхода было вызвано А23187 (B) или DMSO в качестве отрицательного контроля (A). Паразиты выразить цитоплазматических YFP 22.
Рисунок 5. Последовательные разбавления для клональной линии паразита. Четыре поликлональных популяций (красный, синий, желтый, зеленый) серийно разводили в одном 384-луночного планшета сливающийся с HFF клеток. Ряд C, и я получите 10 паразитов на одну скважину иэто в 2 раза разбавленным (40 мкл + 40 мкл) до строки H и N, соответственно. Оттенки серого указывает на снижение количества паразитов на одну скважину. Как правило, одного клона находятся в рядах DF и JL.
| Соединение | Акции | Рабочая концентрация | мкл необходимые для T25 (10 мл) | Время инкубации (мин) |
| DVB-T | 1 М в ДМСО | 5 мМ | 50 | 15 |
| этанол | 190 Доказательство | 5% | 500 | 30 |
| А23187 | 2 мм в ДМСО | 1 мкМ | 5 | 5 |
| нигерицина * | 2 мм в ДМСО | 10 мкМ | 50 | 30 |
* Нигерицина не могут быть использованы в обогащаютМент экране паразиты не выживают нигерицина стимуляции; использовать только нигерицина в проверке выхода мутантов.
Таблица 1. Egress индукторов, используемых в процедурах. Развести в 10 мл HBBSc содержащего 25 мг / мл DS на экране, или нет DS для проверки мутант (выход анализа). Все соединения от Sigma-Aldrich.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Описанный протокол обеспечивает эффективный способ изолировать Toxoplasma мутантов с выходным дефекта. Мы успешно изолировать мутантов по различным этапам пути выхода, некоторые из которых имеют двойное фенотип вторжения 13. Потенциальное воздействие на вторжение можно определить с помощью так называемого красно-зеленый анализ, который отличается от вторжения, не вторглись паразитов дифференциального окрашивания антителами 23,24. Для обоих вторжения и выхода анализов он может быть удобным, чтобы выразить autofluorescent маркер белка в цитоплазме паразитов 13,22. Однако, если паразиты время мутагенизированный уже выражают флуоресцентного белка это может помешать дополнительные фенотипические характеристики с помощью иммунофлуоресценции позже. Всегда есть возможность добавить флуоресцентный маркер мутанта после его изоляции. Как описано выше, простой, без флуоресцентного альтернатива Diff-Быстрый выход для окрашивания.
т "> Исторически сложилось, что мутаген ЕНУ была применена к Toxoplasma генетики 14. Тем не менее, ЕНУ преимущественно целей на базе пары 25, которые мы проверили в Toxoplasma (Farrell, Marth, Gubbels и соавт., рукопись представлена). Поскольку частота / т ниже, в аминокислоту кодирующей последовательностью, чем не-кодирующих последовательностей, большинство мутаций, индуцированных ЕНУ будет в не кодирующей последовательности. Тем не менее, EMS обычно отдает предпочтение пар GC база, то есть кодирующих последовательностей. Подавляющее большинство термочувствительных мутации происходят в кодон-изменение мутации, которая является причиной для использования EMS по ЕНУ.Несмотря на различные индукторы выход запуска различных аспектов сигнального пути описаны в таблице 1, существуют и другие фармакологические препараты известно, действуют на процессы, необходимые для выхода. Например, кофеин, как было показано, вызывают microneme секреции внеклеточных паразитов, которые необходимы длявыход и вторжение 7,26,27. Однако, кофеин не может быть использован, чтобы вызвать выход из инфицированных клеток хозяина, вероятно, потому что кофеин не эффективно диффундируют через клетки-хозяина к паразитам, проживающих в вакуоли отсека. Точно так же выход триггера накопление АБК, но это невозможно для выявления мутантов в этот путь, так как АБК не диффундируют в клетку-хозяина 28. И, как указано в таблице 1, K +-ионофором нигерицина является эффективным индуктором выход 5, однако, паразиты не выживают нигерицина стимуляции. Поэтому это соединение также не подходит для экрана. В другом, более сложные процедуры проверки для ионофором мутантов стало известно, что многие мутанты с задержкой выхода ионофором индуцированной пережить длительный внеклеточного воздействия ионофором 11. Тем не менее, не выход мутантов, устойчивых к ионофором индуцированного выхода были выделены на этом экране, в результате чего фенотипслабее. Это в настоящее время неясно мутантов, устойчивых к длительному воздействию других индукторов выход может быть получено.
Поскольку, как представляется, несколько параллельных путей, которые могут привести к выходным, то возникает вопрос о том, какой был бы наиболее актуальными в (экспериментальных) инфекции. Похоже, что иммунная система атаки на инфицированные клетки являются основной триггер выход 29. Можно использовать такие триггеры в мутанта экране. Например, CD8 Т-клеток может стимулировать выход как через Fas-опосредованного и перфорина-опосредованного пути 30. Таким образом, с помощью FasL выражения человеческих Т-клеток в клетки-хозяина в выходной экран, выход может быть вызвано инкубации с анти-Fas антитела к обогащению для мутантов в этом пути.
Для генетической карте мутации, лежащие в основе выхода фенотипов, два различных подхода имеются в токсоплазмы. В отличие от генетических модельных организмов, всеelic сегрегации путем скрещивания это не вариант, так как половой цикл паразита может быть вызван только в кишечнике кошек. Помимо непрактичность и низкая эффективность этого процесса, паразит штаммов, выращенных в лаборатории очень быстро теряют способность инфицировать кошек. Чтобы обойти эту проблему эффективного дикого типа космидный подход дополнения библиотека была разработана, который дополняется 90% деления клеток мутантов 18. Кроме того, мы недавно созданной полный геном проводя повторного протокола для выявления всех мутаций, индуцированных в геноме (Farrell, Marth, Gubbels и соавт., Рукопись представлена). Обычно мы определяем 20-70 одиночных нуклеотидных полиморфизмов в химически индуцированных мутантов. Между этими двумя подходами мы смогли выявить причинные мутации во всех химически индуцированных мутантов характеризуется на сегодняшний день.
Взятые вместе, описанных экран обеспечивает универсальный инструмент, который позволит вперед генетические вскрытиявыход путей. Мы ожидаем, что будут определены несколько компонентов сигнального пути, как известно, существуют на основе фармакологических данных, но для которых нет хороших генов-кандидатов могут быть определены в Toxoplasma генома.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была профинансирована американской Сердечной Ассоциации ученых гранта на развитие 0635480N и Национального института здоровья грант AI081220. BIC поддерживает тамплиеров Eye Foundation грант.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ENU | Sigma-Aldrich | N3385 | 1 M Stock in DMSO, store at -20 °C |
| EMS | Sigma-Aldrich | M0880 | 1 M Stock in DMSO, store at -20 °C |
| Dextran Sulfate | Sigma-Aldrich | D4911 | |
| PDTC | Sigma-Aldrich | P8765 | 100 mM Stock in PBS |
| Diff Quick | EMD Chemicals | 65044-93 | |
| Filter holder | Cole-Parmer | 540100 | |
| 3 μm polycarbonate filter | Whatman Schleicher Schuell | 110612 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 1475 | |
| CO2 incubators | Various manufacturers | Humidified, 5% CO2, at 35, 37 and 40 °C | |
| Fluorescence microscope | Various manufacturers | Ideally inverted, wide-field with 63x or 100x oil objective | |
HBSSc (according to Black et al.11): |
|||
|
|||
References
- Carruthers, V. B., Moreno, S. N., Sibley, L. D. Ethanol and acetaldehyde elevate intracellular [Ca2+] and stimulate microneme discharge in Toxoplasma gondii. Biochem. J. 342 (Pt 2), 379-386 (1999).
- Moudy, R., Manning, T. J., Beckers, C. J. The loss of cytoplasmic potassium upon host cell breakdown triggers egress of Toxoplasma gondii. J. Biol. Chem. 276 (44), 41492-41501 (2001).
- Silverman, J. A. Induced activation of the Toxoplasma gondii nucleoside triphosphate hydrolase leads to depletion of host cell ATP levels and rapid exit of intracellular parasites from infected cells. J. Biol. Chem. 273 (20), 12352-12359 (1998).
- Stommel, E. W., Ely, K. H., Schwartzman, J. D., Kasper, L. H. Toxoplasma gondii: dithiol-induced Ca2+ flux causes egress of parasites from the parasitophorous vacuole. Exp. Parasitol. 87 (2), 88-97 (1997).
- Fruth, I. A., Arrizabalaga, G. Toxoplasma gondii: induction of egress by the potassium ionophore nigericin. Int. J. Parasitol. 37 (14), 1559-1567 (2007).
- Endo, T., Sethi, K. K., Piekarski, G. Toxoplasma gondii: calcium ionophore A23187-mediated exit of trophozoites from infected murine macrophages. Exp. Parasitol. 53 (2), 179-188 (1982).
- Hoff, E. F., Carruthers, V. B. Is Toxoplasma egress the first step in invasion. Trends Parasitol. 18 (6), 251-255 (2002).
- Wetzel, D. M., Chen, L. A., Ruiz, F. A., Moreno, S. N., Sibley, L. D. Calcium-mediated protein secretion potentiates motility in Toxoplasma gondii. J. Cell. Sci. 117 (Pt 24), 5739-5748 (2004).
- Lourido, S. Calcium-dependent protein kinase 1 is an essential regulator of exocytosis in Toxoplasma. Nature. 465 (7296), 359-362 (2010).
- Arrizabalaga, G., Ruiz, F., Moreno, S., Boothroyd, J. C. Ionophore-resistant mutant of Toxoplasma gondii reveals involvement of a sodium/hydrogen exchanger in calcium regulation. J. Cell. Biol. 165 (5), 653-662 (2004).
- Black, M. W., Arrizabalaga, G., Boothroyd, J. C. Ionophore-resistant mutants of Toxoplasma gondii reveal host cell permeabilization as an early event in egress. Mol. Cell. Biol. 20 (24), 9399-9408 (2000).
- Chandramohanadas, R. Apicomplexan Parasites Co-Opt Host Calpains to Facilitate Their Escape from Infected Cells. Science. , (2009).
- Eidell, K. P., Burke, T., Gubbels, M. J. Development of a screen to dissect Toxoplasma gondii egress. Mol. Biochem. Parasitol. 171 (2), 97-103 (2010).
- Pfefferkorn, E. R., Pfefferkorn, L. C. Toxoplasma gondii: isolation and preliminary characterization of temperature-sensitive mutants. Exp. Parasitol. 39 (3), 365-376 (1976).
- Pfefferkorn, E. R., Schwartzman, J. D., Kasper, L. H. Toxoplasma gondii: use of mutants to study the host-parasite relationship. Ciba. Found. Symp. 99, 74-91 (1983).
- Striepen, B. Genetic complementation in apicomplexan parasites. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99 (9), 6304-6309 (2002).
- White, M. W. Genetic rescue of a Toxoplasma gondii conditional cell cycle mutant. Mol. Microbiol. 55 (4), 1060-1071 (2005).
- Gubbels, M. J. Forward Genetic Analysis of the Apicomplexan Cell Division Cycle in Toxoplasma gondii. PLoS Pathog. 4 (2), e36-e36 (2008).
- Carruthers, V. B., Hakansson, S., Giddings, O. K., Sibley, L. D. Toxoplasma gondii uses sulfated proteoglycans for substrate and host cell attachment. Infect. Immun. 68 (7), 4005-4011 (2000).
- Camps, M., Boothroyd, J. C. Toxoplasma gondii: selective killing of extracellular parasites by oxidation using pyrrolidine dithiocarbamate. Exp. Parasitol. 98 (4), 206-214 (2001).
- Roos, D. S., Donald, R. G., Morrissette, N. S., Moulton, A. L. Molecular tools for genetic dissection of the protozoan parasite Toxoplasma gondii. Methods Cell Biol. 45, 27-63 (1994).
- Gubbels, M. J., Li, C., Striepen, B. High-throughput growth assay for Toxoplasma gondii using yellow fluorescent protein. Antimicrob. Agents Chemother. 47 (1), 309-316 (2003).
- Carey, K. L., Westwood, N. J., Mitchison, T. J., Ward, G. E. A small-molecule approach to studying invasive mechanisms of Toxoplasma gondii. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101 (19), 7433-7438 (2004).
- Kafsack, B. F., Carruthers, V. B., Pineda, F. J. Kinetic modeling of Toxoplasma gondii invasion. J. Theor. Biol. 249 (4), 817-825 (2007).
- Hanash, S. M., Boehnke, M., Chu, E. H., Neel, J. V., Kuick, R. D. Nonrandom distribution of structural mutants in ethylnitrosourea-treated cultured human lymphoblastoid cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 85 (1), 165-169 (1988).
- Kafsack, B. F. Rapid membrane disruption by a perforin-like protein facilitates parasite exit from host cells. Science. 323 (5913), 530-533 (2009).
- Lovett, J. L., Marchesini, N., Moreno, S. N., Sibley, L. D. Toxoplasma gondii microneme secretion involves intracellular Ca(2+) release from inositol 1,4,5-triphosphate (IP(3))/ryanodine-sensitive stores. J. Biol. Chem. 277 (29), 25870-25876 (2002).
- Nagamune, K. Abscisic acid controls calcium-dependent egress and development in Toxoplasma gondii. Nature. 451 (7175), 207-210 (2008).
- Tomita, T., Yamada, T., Weiss, L. M., Orlofsky, A. Externally triggered egress is the major fate of Toxoplasma gondii during acute infection. J. Immunol. 183 (10), 6667-6680 (2009).
- Persson, E. K. Death receptor ligation or exposure to perforin trigger rapid egress of the intracellular parasite Toxoplasma gondii. J. Immunol. 179 (12), 8357-8365 (2007).
