Summary
Mycobacterium tuberculosis forma biofilms de drogas tolerantes cuando se cultivan en ciertas condiciones. Aquí se describen los métodos para el cultivo de M. biopelículas la tuberculosis y la determinación de la frecuencia de las drogas persisters tolerantes. Estos protocolos serán útiles para futuros estudios sobre los mecanismos de tolerancia a las drogas en M. la tuberculosis.
Abstract
Mycobacterium tuberculosis, el agente etiológico de la tuberculosis humana, tiene una extraordinaria capacidad para sobrevivir a las tensiones ambientales, incluidos los antibióticos. A pesar de la tolerancia al estrés de M. la tuberculosis es uno de los probables contribuyentes a la quimioterapia de largo de 6 meses de la tuberculosis 1, los mecanismos moleculares que subyacen a este fenotipo característico del patógeno siguen sin estar claros. Muchas de las especies microbianas han evolucionado para sobrevivir en ambientes estresantes auto-montaje en el altamente organizado, de superficie unida, y las estructuras matriciales encapsulados denominadas biofilms 2-4. El crecimiento de las comunidades parece ser una estrategia de supervivencia preferente de los microbios, y se logra a través de los componentes genéticos que regulan la fijación de superficie, la comunicación intercelular, y la síntesis de sustancias poliméricas extracelulares (EPS) 5,6. La tolerancia al estrés ambiental es probablemente facilitado por EPS, y tal vez por el physiolola adaptación lógica de bacilos individuo a microambientes heterogéneos dentro de la compleja arquitectura de las biopelículas 7.
En una serie de trabajos recientes se estableció que el señor la tuberculosis y Mycobacterium smegmatis tienen una fuerte tendencia a crecer en estructuras multicelulares organizados, llamados biofilms, que pueden tolerar más de 50 veces la concentración mínima inhibitoria de los medicamentos antituberculosos isoniazida y la rifampicina 10.08. M. la tuberculosis, sin embargo, curiosamente requiere condiciones específicas para formar biofilms maduros, en particular, relación 9:1 de espacio de cabeza: los medios de comunicación, así como el escaso intercambio de aire con la atmósfera 9. Requisitos de las condiciones ambientales especializados, posiblemente, podría estar relacionado con el hecho de que M. la tuberculosis es un patógeno humano obliga y por lo tanto se ha adaptado a los ambientes del tejido. En esta publicación se demuestra métodos para el cultivo de M. tuberculosisbiopelículas en una botella y un formato de placa de 12 pocillos, que es conveniente para los estudios bacteriológicos, así como genéticos. Hemos descrito el protocolo para una cepa atenuada de M. la tuberculosis, el mc 2 7000, con la supresión de los dos loci, PANCD y la RD1, que son fundamentales para el crecimiento in vivo del patógeno 9. Esta cepa puede ser utilizado con seguridad en una contención BSL-2 para la comprensión de la biología básica del patógeno de la tuberculosis evitando así la exigencia de una costosa instalación de BSL-3. El método puede ser extendido, con las modificaciones apropiadas en los medios de comunicación, para crecer biofilm de otras especies de micobacterias cultivables.
En general, un protocolo uniforme de las biopelículas de cultivo de micobacterias ayudará a los investigadores interesados en estudiar las características básicas de las micobacterias resistentes. Además, un método claro y conciso de las biopelículas de crecimiento de micobacterias también ayudará a la inv clínica y farmacéuticaestigators para probar la eficacia de un fármaco potencial.
Protocol
1. Biopelículas de crecimiento de M. la tuberculosis en una botella de 250 ml con tapa rosca
- Preparación de medios de comunicación: Disolver 0,5 g de KH 2 PO 4, 0,5 g de MgSO 4, 4 g de L-asparagina, 2 g de ácido cítrico, 0,05 g de citrato férrico amónico, 60 ml de glicerol en 900 ml de agua. Ajustar el pH a 7,0 con NaOH. Autoclave, enfriar y justo antes de iniciar el experimento, añadir estéril ZnSO 4 a una concentración final de 0,1% w / v Desde 7000 mc 2 es un auxótrofo pantotenato de esta cepa también requiere que el ácido pantoténico en 10μg/mL de la concentración final.
Nota: Esta es una composición estándar de los medios de comunicación Sauton utilizados para M. tuberculosis. Sin embargo, si se requiere otros medios especializados también se puede utilizar para otras especies de micobacterias.
- Preparación de inóculo: Crecer M. la tuberculosis en 7H9OADC con 0,05% de Tween-80 durante una semana, o 600 OD de 0,7 a 1,0. La culture puede ser utilizado directamente como inóculo a una dilución 1:100.
- Dispense 25 ml de medios de Sauton a una botella de 250 ml tapado de rosca de poliestireno (Corning). Añadir 250μl del inóculo en el medio, la tapa de la botella muy bien y colocarla sin problemas en un humidificado incubadora a 37 ° C durante 3 semanas. Observar la botella una vez cada día para asegurar que no hay contaminación.
- Al final de la tercera semana, aflojar el tapón de la botella para permitir un mayor crecimiento de M. la tuberculosis en la interfaz. Si el tapón no se afloja en esta etapa a continuación, la concentración de oxígeno insuficiente en el contenedor retardar el crecimiento adicional de las bacterias.
2. Crecimiento de M. biopelículas de tuberculosis en placas de 12 pocillos
- Preparar los medios de comunicación y el inóculo de 7.000 mc 2, como se describe en las secciones A1 y A2.
- Mezclar 60 ml de medios de comunicación con 600μl de inóculo. Dispense 4,5 millonesL de la mezcla en cada pocillo de la placa. Cubrir la placa con la tapa. Envuelva la placa varias veces con Parafilm. Se incuba la placa sin perturbaciones en incubador humidificado a 37 ° C durante 5 semanas.
3. Determinar la frecuencia de las drogas persisters tolerantes en M. la tuberculosis biopelículas
- Crecer M. biopelículas de tuberculosis en un formato de 12, así como se describe en la sección B. Esto tomará un total de alrededor de 5 semanas.
- Una vez que las biopelículas son madurados (después de 5 semanas de incubación) debe inyectar la elección del antibiótico a la concentración deseada en los medios de comunicación por debajo de las biopelículas utilizando un micropunta en una pipeta.
Nota: El volumen de los medios de debajo de las unas películas reduce a aproximadamente 3,0 ml. Así que los investigadores en consecuencia debe calcular la cantidad de droga.
- Agitar la placa suavemente de modo que el antibiótico se difunde a fondo en el medio. Para obtener resultados estadísticamente significativos, se inyectan antibióticos de laótico en cuatro pocillos. En paralelo, inyectar el mismo volumen de disolvente en el que se disolvió el antibiótico en otros cuatro pocillos, y dejar los últimos cuatro pocillos de la placa sin tocar. Cubrir la placa con la tapa y poner nuevas capas de parafina alrededor de la placa. Coloque de nuevo en la incubadora por un período de tiempo deseado.
- Al final de la incubación, abrir la placa y añadir Tween-80 a la concentración final de 0,1% (volumen / volumen) en cada uno de los pocillos. Agitar la placa suavemente durante toda la dispersión uniforme del detergente. Se incuba la placa a temperatura ambiente durante 15 minutos. Mezclar el contenido de cada pocillo con pipeta varias veces para que el contenido entero puede ser uniformemente transferidos a un tubo cónico de 15 ml.
- Centrifugar el contenido del tubo en 4000rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente. Resuspender el sedimento en 5 ml de tampón de lavado fresco (PBS con 10% de glicerol y 0,05% de Tween-80). Repetir las lavado tres veces. Resuspender el precipitado en 5 ml de tampón de lavado. Manténgalo en el eje de balancín para la overnight a 4 ° C.
Nota: A pesar de la baja temperatura se desarrolló originalmente para M. smegmatis (para minimizar su crecimiento durante la dispersión) y se utiliza para M. tuberculosis, así, las especies de crecimiento lento puede ser más probable es que sacudió a temperatura ambiente sin ningún tipo de impacto en el resultado. Mecedora a temperatura ambiente, puede ser necesario si se trabaja en las instalaciones BSL-3.
- Preparar una jeringa estéril equipado con micropunta (2-200μl) mediante la reducción de su extremo más ancho al tamaño adecuado, ajustándolo a la jeringa y envolviéndolo con parafilm. Pasar todo el contenido del tubo a través de la jeringa con punta equipada y recoger en tubos de 15 ml unos frescos. Repita este paso de 5 a 6 veces hasta que se observa una suspensión bastante homogénea.
- Preparar diluciones seriadas de la suspensión y la placa de las diluciones en la placa 7H11OADC para determinar el número de colonias viables en cada pocillo. Las placas se incuban durante tres semanas a 37 ° C incubadora. Determinar la frecuenciascy de persisters en la población biopelícula mediante el cálculo de la relación del número de colonias obtenidas en tratado con antibióticos a los obtenidos en disolventes placas tratadas.
4. Los resultados representativos
Cuando se cultiva en una botella, el crecimiento de M. la tuberculosis se puede ver en la base de la botella por el final de la primera semana. Al final de la segunda semana, el crecimiento irregular de bacterias en la interfase aire-medio puede verse, aunque el crecimiento en la interfase aire-medio es constantemente visible al final de la tercera semana (fig. 1A). En este momento la fijación de las bacterias a la pared del recipiente también se observa. A partir de este punto, el crecimiento del cultivo se produce principalmente en la interfase aire-medio. El líquido debajo de la superficie de crecimiento es clara. Típicamente, la estructura madura para el final de la quinta semana (Fig. 1B). Si incubación es prolongado, las estructuras comenzará a hundirse hasta el fondo del recipiente. Curiosamente,apriete de la tapa hasta el final de la tercera semana es un paso importante en el proceso, y por razones desconocidas una botella con tapón suelto significativamente retarda la iniciación del crecimiento en la interfaz 9.
En el formato de 12-así, una biopelícula robusta en la interfase aire-medio se ve en cada uno de los pocillos al final de cinco semanas (Fig. 2A). Si las placas no están protegidos por completo entonces, el crecimiento diferencial de la biopelícula que se observa. En el peor de los casos, la evaporación significativa de los medios pueden detener el crecimiento de las bacterias (Fig. 2B). Así, la envoltura de la placa es necesario tanto para evitar la evaporación, así como para proporcionar el medio ambiente para la formación de biopelículas (véase el párrafo anterior).
El número de bacilos viables en las biopelículas determinados con esta técnica es muy reproducible. Respuesta de M. tuberculosis biopelículas varía con la naturaleza de los antibióticos. Para un antibiótico bactericida como la rifampicina, la pérdida de viabilidad sigue una bipha sic tendencia 9. Una rápida disminución de la viabilidad durante las primeras tres a cuatro días, seguido de una fase persistente en el que un pequeño porcentaje de la población permanecen completamente recalcitrante a los antibióticos, independientemente de la concentración del antibiótico o el tiempo de exposición. La Figura 3 muestra el número de bacilos viables en las biopelículas maduras después de una exposición 7-días a 50μg/mL (50 veces más alta que la CIM) de rifampicina.
Figura 1. Aparición temprana de M. bacilos de la tuberculosis de la interfase aire-los medios de comunicación de las bacterias después de 3 semanas de incubación.
Figura 1B. Madurado biopelículas de M. tuberculosis en la interfase aire-medio después de cinco semanas de incubación.
820/3820fig2A.jpg "/>
Figura 2A. De 5 semanas de edad las biopelículas de M. la tuberculosis crece en 12 y en formato.
Figura 2B. Un intento fallido para crecer M. tuberculosis en las biopelículas de 12 pocillos, sin parafina.
Figura 3. Un gráfico representativo que muestra la frecuencia de persisters drogas tolerantes en M. tuberculosis biopelículas crecido en 12-así formato y expuestos a 50μg/mL de rifampicina durante siete días.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
La tuberculosis (TB), causada por la infección de Mycobacterium tuberculosis, sigue siendo una gran amenaza para la salud pública mundial. Casi un tercio de la población mundial se estima que se forma asintomática infectada por el patógeno, cerca de 9 millones de nuevos casos aparecen en la clínica todos los años con síntomas de tuberculosis activa y alrededor de 1,7 millones de personas mueren de la infección todos los años 11. El enorme peso de la enfermedad es principalmente aportados por la falta de una vacuna y una quimioterapia altamente complicado que implica un régimen de múltiples fármacos administrados durante seis a nueve meses. La quimioterapia prolongada se atribuye principalmente a la tolerancia fenotípica de una pequeña subpoblación del patógeno que requiere una exposición prolongada de antibióticos 12. Si bien la orientación de estas persisters es fundamental para el tratamiento a corto y eficaz de la tuberculosis, los mecanismos que subyacen al desarrollo de estas persisters siguen sin estar claros.
La mayoría de especímenes microbianoses en su hábitat natural crecen en forma espontánea auto-ensamblado, la superficie de las comunidades multicelulares adjunto llamado biopelículas, que son altamente tolerantes a los antibióticos 3. Recientemente, se ha demostrado que varias especies de micobacterias, tienen fuerte propensión a crecer in vitro como biopelículas, que proporcionan un microentorno que promover el desarrollo de fármacos persisters tolerantes 9,13-15. Mientras que las especies de crecimiento rápido del medio ambiente, tales como M. smegmatis puede formar fácilmente biofilms en los medios de comunicación libres de detergente, el lento crecimiento de especies patógenas M. la tuberculosis requieren condiciones específicas para formar las estructuras multicelulares 9. Desde el cultivo de M. la tuberculosis en los biofilms podrían proporcionar una información valiosa sobre los mecanismos de tolerancia a las drogas y la persistencia, la difusión de un protocolo detallado para el cultivo del patógeno en las biopelículas a través de un código abierto será de gran valor para la investigación de la tuberculosis, sobre todo en un COUNTR con recursos limitadosy.
Aquí se describe el método de cultivo de M. la tuberculosis en las biopelículas en detalle. Disponemos también de un protocolo para romper los biofilms y determinar el número de bacilos viables en la población. Esta técnica se puede utilizar para determinar el número de persisters drogas tolerantes en el cultivo. Los tres pasos más importantes en el cultivo de las biopelículas son: 1) elección de un adecuado detergente libre de medios de comunicación, cultura envase cerrado durante las primeras tres semanas, y ábrase el recipiente para la posterior incubación. Además, manteniendo el recipiente en una condición húmeda es también crítica para evitar la evaporación de los medios de incubación durante 5-semanas. Esto puede dificultar significativamente la reproducibilidad de los resultados.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
No tenemos nada que revelar.
Acknowledgments
El trabajo se llevó a cabo con el apoyo financiero del Instituto Nacional de Salud y Asociación Americana del Pulmón.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Incubator | VWR international | Model # 1923/25 | |
| Polystyrene culture bottles | Fisher Scientific | 03-374-300 | |
| 12-well tissue culture plate | VWR international | 62406-165 | |
| 50-mL conical tubes | VWR international | 89039-660 | |
| Rocker | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 57019-662 | |
| Chromatographic refrigerator | VWR international | 55702-520 | |
| petri dish | VWR international | 25384-342 | |
| KH2PO4 (monobasic) | EMD Millipore | PX1565-1 | |
| MgSO4 | Fisher Scientific | M65-500 | |
| L-asparagine | Sigma-Aldrich | A4284-100G | |
| citric acid | Sigma-Aldrich | C1857-100G | |
| ferric ammonium citrate | Sigma-Aldrich | F5879-100G | |
| glycerol | EMD Millipore | GX0185-5 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8045-500G | |
| ZnSO4 | Sigma-Aldrich | Z4750-500G | |
| D-pantothenic acid | Sigma-Aldrich | P2250-25G | |
| Difco Middlebrook 7H9 Broth | BD Biosciences | 271310 | |
| Middlebrook OADC Enrichment | BBL | 212351 | |
| Tween-80 | Fisher Scientific | T164-500 | |
| 250mL storage bottle | Corning | 430281 | |
| 12 well plates | Falcon BD | 353043 | |
| rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501-1G | |
| methanol | JT Baker | 9070-05 | |
| 10mlLsyringe | BD Biosciences | 301604 | |
| 1-200μL pipet tips | VWR international | 89079-458 | |
| parafilm M | VWR international | PM-996 | |
| 15mL centrifuge tube | Greiner Bio-One | 188-285 | |
| Difco Mycobacteria 7H11 Agar | BD Biosciences | 283810 | |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333-500G | |
| Na2HPO4 (dibasic) | Sigma-Aldrich | S0876-500G |
References
- Saltini, C.
- Hall-Stoodley, L., Stoodley, P. Biofilm formation and dispersal and the transmission of human pathogens. Trends Microbiol. 13, 7-10 (2005).
- Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
- Blankenship, J. R., Mitchell, A. P. How to build a biofilm: a fungal perspective. Curr Opin Microbiol. 9, 588-594 (2006).
- Henke, J. M., Bassler, B. L.
- Kolter, R., Losick, R. One for all and all for one. Science. 280, 226-227 (1998).
- Branda, S. S., Vik, S., Friedman, L., Kolter, R.
- Ojha, A. GroEL1: a dedicated chaperone involved in mycolic acid biosynthesis during biofilm formation in mycobacteria. Cell. 123, 861-873 (2005).
- Ojha, A. K. Growth of Mycobacterium tuberculosis biofilms containing free mycolic acids and harbouring drug-tolerant bacteria. Mol. Microbiol. 69, 164-174 (2008).
- Ojha, A. K., Trivelli, X., Guerardel, Y., Kremer, L., Hatfull, G. F. Enzymatic hydrolysis of trehalose dimycolate releases free mycolic acids during mycobacterial growth in biofilms. J. Biol. Chem. 285, 17380-17389 (2010).
- Dye, C., Lonnroth, K., Jaramillo, E., Williams, B. G., Raviglione, M. Trends in tuberculosis incidence and their determinants in 134 countries. Bull World Health Organ. 87, 683-691 (2009).
- Jindani, A., Dore, C. J., Mitchison, D. A. Bactericidal and sterilizing activities of antituberculosis drugs during the first 14 days. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 167, 1348-1354 (2003).
- Carter, G., Wu, M., Drummond, D. C., Bermudez, L. E. Characterization of biofilm formation by clinical isolates of Mycobacterium avium. J. Med. Microbiol. 52, 747-752 (2003).
- Hall-Stoodley, L., Lappin-Scott, H. Biofilm formation by the rapidly growing mycobacterial species Mycobacterium fortuitum. FEMS Microbiol. Lett. 168, 77-84 (1998).
- Alibaud, L. Temperature-dependent regulation of mycolic acid cyclopropanation in saprophytic mycobacteria: role of the Mycobacterium smegmatis 1351 gene (MSMEG_1351) in CIS-cyclopropanation of alpha-mycolates. J. Biol. Chem. 285, 21698-21707 (2010).
