Summary
Mycobacterium tuberculosis danner narkotika tolerante biofilm når dyrket i visse vilkår. Her beskriver vi metoder for dyrking M. tuberkulose biofilmer og bestemme frekvensen av narkotika tolerante persisters. Disse protokollene vil være nyttig for videre studier i mekanismene for narkotika toleranse i M. tuberkulose.
Abstract
Mycobacterium tuberculosis, etiologic agent for human tuberkulose, har en forunderlig evne til å overleve mot miljømessige påkjenninger, inkludert antibiotika. Selv stresstoleranse av M. tuberkulose er en av de sannsynlige bidragsytere til den 6 måneder lange kjemoterapi av tuberkulose 1, de molekylære mekanismene bak dette karakteristiske fenotype av organismen fortsatt uklare. Mange mikrobielle arter har utviklet seg til å overleve i stressende miljøer ved selv-montering i svært organisert, overflate festet, og matrise innkapslet strukturer som kalles biofilm 2-4. Veksten i samfunn synes å være en foretrukket overlevelse strategi av mikrober, og oppnås gjennom genetiske komponenter som regulerer overflate vedlegg, intercellulær kommunikasjon, og syntese av ekstracellulære polymere stoffer (EPS) 5,6. Den toleranse mot miljøstress er sannsynligvis tilrettelagt av EPS, og kanskje ved physiolokirurgiske tilpasning av individuell basiller til heterogene microenvironments innenfor komplekset arkitektur biofilm 7.
I en serie nye papirer etablerte vi at M. tuberkulose og Mycobacterium smegmatis har en sterk tilbøyelighet til å vokse i organiserte flercellede strukturer, kalt biofilm, som kan tåle mer enn 50 ganger de minste hemmende konsentrasjonen av legemidler mot tuberkulose isoniazid og rifampicin 8-10. M. tuberkulose krever imidlertid intrigere spesielle forhold for å danne modne biofilm, særlig 9:01 forholdet headspace: media samt begrenset utveksling av luft med atmosfæren 9. Krav til spesialiserte miljøforhold kan muligens knyttes til det faktum at M. tuberkulose er en obligat menneskelig patogen og dermed har tilpasset vev miljøer. I denne publikasjonen viser vi metoder for dyrking M. tuberkulosebiofilm i en flaske og en 12-brønns plate format, noe som er praktisk for bakteriologiske samt genetiske studier. Vi har beskrevet protokollen for en svekket stamme av M. tuberkulose, mc 2 7000, med sletting i de to loci, panCD og RD1, som er kritiske for in vivo vekst av patogen 9. Denne belastningen kan trygt brukes i en BSL-2 containment for å forstå grunnleggende biologi tuberkulose patogen og dermed unngår kravet om en kostbar BSL-3 anlegg. Metoden kan utvides, med passende endringer i media, for å vokse biofilm av andre culturable mykobakterielle arter.
Samlet vil en uniform protokoll av dyrking mykobakterielle biofilmer hjelpe etterforskerne interessert i å studere de grunnleggende elastiske egenskapene til mykobakterier. I tillegg vil en klar og konsis metode for voksende mykobakterielle biofilm også hjelpe klinisk og farmasøytisk investigators å teste effekten av en potensiell narkotika.
Protocol
1. Voksende biofilm av M. tuberkulose i en 250ml skrue avkortet flaske
- Media forberedelse: Løs 0,5 g av KH 2 4 PO, 0,5 g av MgSO 4, 4g L-asparagin, 2G sitronsyre, 0.05g av Ferric Ammonium Citrate, 60ml av glyserol i 900mL vann. Juster pH til 7,0 med NaOH. Autoklav, kjølig og like før du starter eksperimentet, legge sterile ZnSO 4 til en endelig konsentrasjon på 0,1% w / v. Siden mc 2 7000 er en pantothenate auxotroph denne belastningen krever også pantotensyre ved 10μg/mL av endelig konsentrasjon.
Merk: Dette er en standard sammensetning av Sauton medier brukes til M. tuberculosis. Men hvis det kreves andre spesialiserte medier kan også brukes til andre mykobakterielle arter.
- Inoculums forberedelse: Grow M. tuberkulose i 7H9OADC med 0,05% Tween-80 for en uke, eller OD 600 på 0,7 til 1,0. Den culture kan brukes direkte som podestoff ved en 1:100 fortynning.
- Tilsett 25ml av Sauton media til en 250ml skrue avkortet polystyren flaske (Corning). Legg 250μl av podestoff til mediet, lue flasken veldig tett og legg den uforstyrret i en fuktet 37 ° C inkubator i 3 uker. Observer flasken en gang hver dag for å sikre at det ikke er forurensning.
- Ved utgangen av tredje uke, løsne lokket av flasken for å tillate ytterligere vekst av M. tuberkulose på grensesnittet. Hvis lokket ikke er løsnet på dette stadiet så utilstrekkelig oksygen konsentrasjonen i containeren vil forsinke ytterligere vekst av bakterier.
2. Vekst av M. tuberkulose biofilm i 12-brønns plater
- Klargjør media og podestoff av mc 2 7000 som beskrevet i pkt. A1 og A2.
- Bland 60ml av media med 600μl av podestoff. Tilsett 4.5mL av blandingen i hver brønn av tallerkenen. Dekk platen med lokk. Pakk platen flere ganger med Parafilm. Inkuber platen uforstyrret i fuktet inkubator ved 37 ° C i 5 uker.
3. Bestemme hyppigheten av narkotika tolerante persisters i M. tuberkulose biofilmer
- Grow M. tuberkulose biofilm i en 12-brønns format som beskrevet i punkt B. Dette vil ta totalt ca 5-uker.
- Når biofilmer er modnet (etter 5 ukers inkubasjonstid) injisere ditt valg av antibiotika ved ønsket konsentrasjon i media under de biofilm ved hjelp av en microtip i en pipette.
Merk: Volumet av mediene under pellicles reduseres til om 3.0mL. Så etterforskere bør derfor beregne mengden av stoffet.
- Swirl platen forsiktig slik at antibiotika er grundig spredt i mediet. For statistisk signifikante resultater, injisere antibiotic i fire brønner. Parallelt injiserer det samme volumet av løsemiddel hvor antibiotika ble oppløst i fire andre brønner, og la de siste fire brønner på platen urørt. Dekk platen med lokk og la friske lag av Parafilm rundt platen. Plasser den tilbake i kuvøse for ønsket tidsrom.
- På slutten av inkubasjonstiden, åpner platen og legg Tween-80 til finalen konsentrasjon på 0,1% (volum / volum) i hver av brønnene. Swirl hele platen forsiktig for uniform spredning av vaskemiddel. Inkuber platen ved romtemperatur i 15 minutter. Bland innholdet i hver brønn med pipette flere ganger slik at hele innholdet kan jevnt overføres til en 15ml konisk tube.
- Spinn ned innholdet av røret ved 4000rpm i 10 minutter ved romtemperatur. Resuspender kulen i 5ml av fersk vaskebuffer (PBS med 10% glyserol og 0,05% Tween-80). Gjenta vaske tre ganger. Resuspender kulen i 5ml av vaskebuffer. Hold den på rocker for overnight ved 4 ° C.
Merk: Selv om lav temperatur ble opprinnelig utviklet for M. smegmatis (for å minimere sin vekst i løpet av spredning) og som brukes for M. tuberculosis i tillegg, kan de sentvoksende arten mest sannsynlig bli vugget i romtemperatur uten noen innvirkning på resultatet. Rocking ved romtemperatur kan være nødvendig hvis du arbeider i BSL-3 anlegg.
- Forbered en steril sprøyte utstyrt med microtip (2-200μl) ved å kutte sitt brede enden til riktig størrelse, pass på at den til sprøyten og pakke det med Parafilm. Pass hele innholdet i røret gjennom tuppen utstyrt sprøyte og samles i en frisk 15ml rør. Gjenta dette trinnet 5 til 6 ganger til du ser en ganske homogen suspensjon.
- Forbered serielle fortynninger av suspensjon og platen de fortynninger på 7H11OADC plate for å bestemme antall levedyktige kolonier i hver brønn. Inkuber platene i tre uker i 37 ° C inkubator. Bestem frekvenserCY av persisters i biofilm befolkningen ved å beregne forholdet mellom antall kolonier oppnådd i antibiotika behandles de som oppnås på løsemidler behandlet plater.
4. Representative Resultater
Når dyrkes i en flaske, vekst av M. tuberkulose kan sees i bunnen av flasken ved utgangen av den første uken. Ved slutten av den andre uken, kan flekkvis vekst av bakterier på air-Media Interface bli sett, selv om veksten i air-Media Interface er konsekvent synlig ved utgangen av tredje uke (Fig. 1A). På denne tiden feste av bakterier til veggen av beholderen er også observert. Fra dette punktet videre veksten av kulturen skjer primært på air-Media Interface. Væsken under overflaten veksten er klart. Vanligvis modnes strukturen ved slutten av femte uke (Fig. 1B). Hvis inkubasjon er langvarig, vil strukturene begynne å synke til bunnen av beholderen. Forbløffende nokinnstramming av hetten til slutten av tredje uke er et viktig skritt i prosessen, og av ukjente årsaker en løs-capped flaske signifikant forsinker oppstart av veksten på grensesnittet 9.
I 12-brønnen format, er en robust biofilm på air-Media Interface sett i hver av brønnene på slutten av fem uker (fig 2a). Hvis platene ikke er pakket helt da differensial biofilm vekst er observert. I verste fall kan betydelig media fordampning stoppe veksten av bakterier (Fig. 2B). Dermed pakking av platen er nødvendig både for å hindre fordamping, samt å tilby miljø for biofilmdannelse (se forrige avsnitt).
Antallet levedyktig basiller i biofilmer fastsatt med denne teknikken er ganske reproduserbar. Response of M. tuberkulose biofilmer varierer med arten av antibiotika. For en bakteriedrepende antibiotika som rifampicin, følger tap av levedyktighet en bipha sic trend 9. En rask nedgang i levedyktighet løpet av de første tre til fire dager etterfulgt av en vedvarende fase hvor en liten andel av befolkningen fortsatt helt trassig mot antibiotika uavhengig av konsentrasjonen av antibiotika eller tidspunktet for eksponering. Figur 3 viser antall levedyktige bakterier i modne biofilmer etter en 7-dagers eksponering for 50μg/mL (50 ganger høyere enn MIC) av rifampicin.
Figur 1A. Tidlig opptreden av M. tuberkulose basiller på lufta-media grensesnitt av bakterier etter 3 ukers inkubasjon.
Figur 1B. Forfalt biofilm av M. tuberkulose på lufta-media grensesnitt etter fem ukers inkubasjon.
820/3820fig2A.jpg "/>
Figur 2a. 5-ukers gamle biofilm av M. tuberkulose vokst i 12-brønnen format.
Figur 2B. En mislykket forsøk på å vokse M. tuberculosis biofilm i 12-brønns plate uten Parafilm.
Figur 3. En representant plott som viser hyppigheten av narkotika tolerante persisters i M. tuberkulose biofilmer vokst i 12-brønnen format og utsatt for 50μg/mL av Rifampicin i syv dager.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tuberkulose (TB), forårsaket av infeksjon av Mycobacterium tuberculosis, er fortsatt en stor trussel mot den globale folkehelsen. Nesten en tredjedel av verdens befolkning er anslått til å være asymptomatically smittet av patogen, ca 9 millioner nye tilfeller dukker opp i klinikken hvert år med symptomer på aktiv tuberkulose og om lag 1,7 millioner dør av infeksjonen hvert år 11. Den enorme byrden av sykdommen er først og fremst bidratt med mangel av en vaksine og en svært komplisert kjemoterapi som innebærer en multidrug regime gitt over seks til ni måneder. Den forlengede kjemoterapi er i stor grad tilskrives fenotypisk toleranse av en liten undergruppe av organismen som kreves utvidet eksponering av antibiotika 12. Mens målretting disse persisters er kritisk for kort og effektiv behandling av tuberkulose, mekanismene bak utviklingen av disse persisters fortsatt uklare.
Mest mikrobiell species i deres naturlige habitat spontant vokse i selv-montert, heter overflaten vedlagte flercellede samfunn biofilm, som er svært tolerant mot antibiotika 3. Nylig har det vist seg at flere mykobakterielle arter, har sterk tilbøyelighet til å vokse in vitro som biofilm, som gir en mikromiljøet som fremmer utvikling av narkotika tolerante persisters 9,13-15. Mens raskt voksende miljø arter som M. smegmatis kan lett danne biofilm i vaskemiddel-frie medier, sentvoksende sykdomsfremkallende arter M. tuberkulose krever bestemte vilkår for å danne de flercellede strukturer 9. Siden dyrking M. tuberkulose i biofilm vil kunne gi betydelig innsikt i mekanismene for narkotika toleranse og utholdenhet, formidling av en detaljert protokoll for dyrking av mikrobe i biofilmer gjennom en åpen kildekode vil være verdifull for tuberkulose forskning, spesielt i en ressurs-begrenset country.
Her beskriver vi metoden for voksende M. tuberkulose i biofilmer i detalj. Vi tilbyr også en protokoll for å bryte biofilm og bestemme antall levedyktige bakterier i befolkningen. Denne teknikken kan brukes til å bestemme antall narkotika tolerante persisters i kulturen. De tre mest kritiske trinn i dyrking biofilmer er: 1) valg av egnet vaskemiddel-frie medier, lukket kultur container i løpet av første tre ukene, og åpen beholder for senere inkubasjon. Videre holder beholderen i en fuktet tilstand er også avgjørende for å hindre fordamping av media i løpet av fem-ukers inkubasjon. Dette kan betydelig hemme reproduserbarhet av resultatene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Arbeidet ble gjennomført med økonomisk støtte fra National Institute of Health og American Lung Association.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Incubator | VWR international | Model # 1923/25 | |
| Polystyrene culture bottles | Fisher Scientific | 03-374-300 | |
| 12-well tissue culture plate | VWR international | 62406-165 | |
| 50-mL conical tubes | VWR international | 89039-660 | |
| Rocker | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 57019-662 | |
| Chromatographic refrigerator | VWR international | 55702-520 | |
| petri dish | VWR international | 25384-342 | |
| KH2PO4 (monobasic) | EMD Millipore | PX1565-1 | |
| MgSO4 | Fisher Scientific | M65-500 | |
| L-asparagine | Sigma-Aldrich | A4284-100G | |
| citric acid | Sigma-Aldrich | C1857-100G | |
| ferric ammonium citrate | Sigma-Aldrich | F5879-100G | |
| glycerol | EMD Millipore | GX0185-5 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8045-500G | |
| ZnSO4 | Sigma-Aldrich | Z4750-500G | |
| D-pantothenic acid | Sigma-Aldrich | P2250-25G | |
| Difco Middlebrook 7H9 Broth | BD Biosciences | 271310 | |
| Middlebrook OADC Enrichment | BBL | 212351 | |
| Tween-80 | Fisher Scientific | T164-500 | |
| 250mL storage bottle | Corning | 430281 | |
| 12 well plates | Falcon BD | 353043 | |
| rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501-1G | |
| methanol | JT Baker | 9070-05 | |
| 10mlLsyringe | BD Biosciences | 301604 | |
| 1-200μL pipet tips | VWR international | 89079-458 | |
| parafilm M | VWR international | PM-996 | |
| 15mL centrifuge tube | Greiner Bio-One | 188-285 | |
| Difco Mycobacteria 7H11 Agar | BD Biosciences | 283810 | |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333-500G | |
| Na2HPO4 (dibasic) | Sigma-Aldrich | S0876-500G |
References
- Saltini, C.
- Hall-Stoodley, L., Stoodley, P. Biofilm formation and dispersal and the transmission of human pathogens. Trends Microbiol. 13, 7-10 (2005).
- Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
- Blankenship, J. R., Mitchell, A. P. How to build a biofilm: a fungal perspective. Curr Opin Microbiol. 9, 588-594 (2006).
- Henke, J. M., Bassler, B. L.
- Kolter, R., Losick, R. One for all and all for one. Science. 280, 226-227 (1998).
- Branda, S. S., Vik, S., Friedman, L., Kolter, R.
- Ojha, A. GroEL1: a dedicated chaperone involved in mycolic acid biosynthesis during biofilm formation in mycobacteria. Cell. 123, 861-873 (2005).
- Ojha, A. K. Growth of Mycobacterium tuberculosis biofilms containing free mycolic acids and harbouring drug-tolerant bacteria. Mol. Microbiol. 69, 164-174 (2008).
- Ojha, A. K., Trivelli, X., Guerardel, Y., Kremer, L., Hatfull, G. F. Enzymatic hydrolysis of trehalose dimycolate releases free mycolic acids during mycobacterial growth in biofilms. J. Biol. Chem. 285, 17380-17389 (2010).
- Dye, C., Lonnroth, K., Jaramillo, E., Williams, B. G., Raviglione, M. Trends in tuberculosis incidence and their determinants in 134 countries. Bull World Health Organ. 87, 683-691 (2009).
- Jindani, A., Dore, C. J., Mitchison, D. A. Bactericidal and sterilizing activities of antituberculosis drugs during the first 14 days. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 167, 1348-1354 (2003).
- Carter, G., Wu, M., Drummond, D. C., Bermudez, L. E. Characterization of biofilm formation by clinical isolates of Mycobacterium avium. J. Med. Microbiol. 52, 747-752 (2003).
- Hall-Stoodley, L., Lappin-Scott, H. Biofilm formation by the rapidly growing mycobacterial species Mycobacterium fortuitum. FEMS Microbiol. Lett. 168, 77-84 (1998).
- Alibaud, L. Temperature-dependent regulation of mycolic acid cyclopropanation in saprophytic mycobacteria: role of the Mycobacterium smegmatis 1351 gene (MSMEG_1351) in CIS-cyclopropanation of alpha-mycolates. J. Biol. Chem. 285, 21698-21707 (2010).
