Summary
Mehrphotonenmikroskopie ganzer Mausorganen ist durch optisches Löschen des Organs vor der Bildgebung möglich, aber nicht alle Protokolle bewahren das Fluoreszenzsignal von fluoreszierenden Proteinen. Unter Verwendung eines optischen Clearing-Methode mit Ethanol-basierte Austrocknung und Benzylalkohol: Benzylbenzoat Lichtung zeigen wir, hochauflösende Multiphotonen Bilder gesamte Gehirn der Maus zum Ausdruck YFP.
Abstract
Mehrphotonenmikroskopie intrinsischer Fluoreszenz und Erzeugung der zweiten Harmonischen (SHG) von ganzen Mausorganen ermöglicht wird. Durch optisches Löschen des Organs vor der Bildgebung 1,2 Jedoch für Organe, die fluoreszierende Proteine wie GFP und YFP enthalten, optische Clearing-Protokolle verwenden, die Methanol Austrocknung und klare Benzylalkohol: Benzylbenzoat (BABB), während ungeschützt Licht 3 nicht beibehalten das Fluoreszenzsignal. Das Protokoll präsentiert hier ist eine neue Art und Weise, in der ganzen Organs optische Lichtung am Gehirn der Maus ausführen, um unter Wahrung der Fluoreszenzsignal YFP ausgedrückt in Neuronen. Verändern der optischen Clearing-Protokoll, so dass das Organ dehydratisiert wird mit einem Ethanol abgestuften Serie wurde gefunden, um den Schaden an den fluoreszierenden Proteinen reduzieren und Erhaltung ihrer Fluoreszenzsignal für Mehrphotonen Bildgebung. 4 Verwendung eines optimierten Verfahren der optischen Lichtung mit Ethanolbasis Dehydratisierung und Clearing durch BABBwährend von Licht abgeschirmt wird gezeigt, hochauflösende Bilder der Multiphotonen gelb fluoreszierendes Protein (YFP)-Expression in den Neuronen einer Mäusehirn mehr als 2 mm unter der Gewebeoberfläche.
Protocol
Ein. Tierische Perfusion 5 und Whole Maushirn Clearing
- Die gesamte Dauer des Verfahrens kann in Abhängigkeit von der Länge der Zeit pro Dehydratisierungsschritt verwendet, aber insgesamt der gesamte Prozess kann in zwei Tagen durchgeführt werden.
- Wiegen YFP Mäusen und dann intensiv mit einer intraperitonealen Injektion von Ketamin / Xylazin (100 mg / kg: 10 mg / kg) anästhesiert.
- Bestätigen einer chirurgischen Ebene tiefer Narkose, bevor eine Operation. Überprüfen Sie das Tier alle 5 min zu sehen, ob es zu einer festen Fuß oder Schwanz Prise reagiert. Wenn das Tier reagiert, wird eine zusätzliche Dosis (1/3 der ursprünglichen Dosis) von Ketamin / Xylazin erforderlich.
- Einmal tief narkotisiert, zügeln die Maus durch die Einhaltung jedes Glied an einem chirurgischen Bett mit Labor-Band, so dass die Maus in Rückenlage (dorsal recumbancy), Aussetzen der Brust für die Chirurgie. Die chirurgische Bett ist in der Regel aus einem Metall-oder Kunststoff-Mesh und in ein Waschbecken oder auf einem Lippen-Pfanne, so dass Blut und FixiermittelAbfälle können leicht gesammelt werden.
- Um zu beginnen, einen Einschnitt unter dem Xyphoid Prozess. Schneiden Sie entlang der Basis des Brustkorbs mit einer Schere und Pinzette und ziehen zurück Haut als der Schnitt gemacht. Make zwei Schnitte entlang beiden Seiten des Brustbeins Maus (durch die Rippen), um eine Klappe des Gewebes, die sich von der Brusthöhle unter Verwendung einer Gefäßklemme zu verlassen das Herz freigelegt gehalten erstellen.
- Einfügen einer 23 g Nadel in den linken Ventrikel des Herzens und einen kleinen Einschnitt in den Muskel Wand des rechten Atriums, damit Blut zu entkommen. Siehe Artikel 2497 für ein Video von diesem Verfahren Jupiter. 5
- Unmittelbar nach dem rechten Vorhof geschnitten wird, beginnt eine Perfusion mit 4 ° C phosphatgepufferter Salzlösung, PBS (pH 7,2), bis Blut nicht mehr eingehalten werden Ablassen aus dem rechten Vorhof des Herzens (30 - 40 ml bei einer Geschwindigkeit von etwa 5 ml / min).
- Sobald das Blut abgelassen wurde (austretende Flüssigkeit in den rechten Vorhof ist klar), schalten Sie das Perfusionsmedium zu einer gekühlten 4%PFA-Lösung. Perfundieren bis die Maus Körper wird spürbar starr und kalt anfühlt (ca. 30 - 40 ml mit einer Rate von etwa 5 ml / min). (Concentrated 16% PFA-Lösung ist nach den Anweisungen des Herstellers und NaOH zugegeben, bis pH 7,2 erreicht ist verdünnt. Handschuhe und einen Laborkittel und zu handhaben und mischen Chemikalien im Inneren einer Abzugshaube.)
- Nach der Perfusion, entfernen Sie die Maus aus der chirurgischen Bett und enthaupten, um die Entfernung des Gehirns beginnen.
- Mit einer Pinzette und Iris Schere, entfernen Sie den Schädel in kleine Abschnitte ab der Rückseite des Schädels und vorwärts. Machen Sie kleine Schnitte alle 2 - 4 mm mit der Schere über den Schädel während der Verwendung der Pinzette vorsichtig den Knochen weg vom Gehirn in kleinen Abschnitten. Dies tun, bis die gesamte obere Oberfläche des Gehirns ausgesetzt ist.
- Excise das Gehirn aus dem Schädel mit einem 5 mm breiten, flachen Spachtel und Ort in einem Glasfläschchen. Eintauchen in 4% PFA für 6 Stunden bei 4 ° C für post Fixierung.
- Nach BeitragFixierung, waschen das Gehirn zweimal bei Raumtemperatur PBS durch Eingießen der PFA aus der Glasflasche und ersetzt sie mit PBS. Swirl das Gehirn in PBS Lösung vor Ausgießen und Ersetzen mit PBS für eine zweite Wäsche.
- Dehydratisieren das Gehirn bei Raumtemperatur durch eine abgestufte Reihe von Ethanol Inkubationen (einmal in 50%, 70%, 95%, und zweimal in 100%) bei 2 hr pro Inkubation und dann 12 h bei der zweiten 100% Ethanol Inkubation um Extrahieren des Wassers aus dem festen Gewebe. Für jede Inkubationszeit, gieße die vorherige Ethanol-Lösung aus dem Glasfläschchen und ersetzen Sie es mit der anschließenden Lösung, bis das Gehirn vollständig untergetaucht ist.
- Nach der zweiten Inkubation in 100% Ethanol, gieße die Lösung und ersetzen mit gleichen Teilen Ethanol und Clearing-Lösung mit Benzylalkohol und Benzylbenzoat (1:2 vol: vol-Verhältnis). Nach 2 Stunden Inkubation, dekantieren dieser Lösung und Ersetzen mit einer 100% igen Lösung von Benzylalkohol und Benzylbenzoat (1:2 vol: vol-Verhältnis). Die refractive Index des Clearing-Lösung ist n = 1,54.
- Einmal in BABB, wird das Gehirn spürbar transparent, in 4 - 5 Stunden. Für beste Clearing Ergebnisse, lassen das Gehirn für 6 Tage bei Raumtemperatur klar, während aus dem hellen Licht abgeschirmt.
2. Mikroskop-Setup
- Sobald das Gehirn wird gelöscht und wartet auf Bildgebung mit Hilfe bringt es auf den Boden der Petrischale mit einem Cyanoacrylat. Lassen Sie den Kleber, bevor Sie fortfahren trocknen.
- Nach dem Trocknen, tauchen das Gehirn in BABB und legen Sie die Petrischale unter dem Mikroskop-Objektiv für die Bildgebung.
- Wir verwenden ein Multiphotonen-Mikroskop, das einen Mai Tai Titan-Saphir-Laser zwischen einer 710 nm bis 990 nm Anregungswellenlänge enthält. Die Anregungswellenlänge wir verwenden, um YFP-Signale erzeugen, ist 886 nm. Laserleistung variiert von 30 bis 100 mW je Bildtiefe.
- Nehmen Sie das reflektierte Fluoreszenzsignal mit einer Nikon 5X Objektiv (NA, 0,5), die für große ermöglichtfield-of-view Bildgebung (2 x 2 mm).
- Filtern der reflektierten fluoreszierenden Signals unter Verwendung eines 535/50 Bandpass-Filter und sammeln sie unter Verwendung einer GaAsP PMT (H7422PA-40, Hamamatsu, Bridgewater, New Jersey).
- Prozess Bilder mit scanimage Software 6 bei einer Auflösung von 2048 x 2048 Pixel mit einer Abtastrate von 2 ms pro Zeile, um hochauflösende, YFP Bilder zu erzeugen.
- Sobald Bildgebung abgeschlossen ist, entfernen das Gehirn aus der Petrischale mit einer Pinzette und lagern BABB von Licht für die Zukunft Bildgebung abgeschirmt. Für Proben verklebt, entfernen das Gewebe durch Ausführen einer Rasierklinge zwischen dem Klebstoff und der Petrischale mit einem Winkel nicht größer als 30 Grad ist. Wir haben Proben in BABB gespeichert bis zu 1 Jahr ohne sichtbare Verschlechterung.
3. Repräsentative Ergebnisse
Die repräsentativen Bilder und Videos hier gezeigten belegen die hohe Auflösung Multiphotonen-Imaging-Fähigkeit ermöglicht durch optische Lichtung. Whole-Brain-Imaging ermöglichtfür YFP-markierten Neuronen in den verschiedenen Schichten des Hippocampus und Kortex deutlich sichtbar sein, so tief wie 2 mm unterhalb der Gewebeoberfläche. Abbildung 1 zeigt ein repräsentatives Bild eines koronalen Ansicht entsprechend den anatomischen Merkmalen des Hippocampus bei 2,92 mm caudal zum Bregma 7. Die Tiefe der Bildgebung in der Probe betrug 1,94 mm. Einige dieser Unterschied war aufgrund der Entfernung des Kleinhirns am kaudalen Ende des Gehirns und der Rest war aufgrund von Schrumpfung aus dem Dehydratationsverfahren. Ein weiteres Bild aus dem Stapel zeigt Schicht V / VI Pyramidenzellen des Neokortex Ausdruck YFP 2 mm unterhalb der Gewebeoberfläche (Abbildung 2). Alle Bilder wurden mit der Nikon 5X objektive und Vergrößerung fertig war mit dem digitalen Zoom-Funktion für die Bildaufnahme in scanimage Software.
Durch Vergrößern des Neocortex, sind die einzelnen Axone und Neuron Zellkörper der Pyramidenzellen in Layer V des Neokortex klarely unterscheidbaren bis 1,02 mm unter der Gewebeoberfläche (Abbildung 3). Mit dem Bildstapel aus Abbildung 3 wurde eine 3D-Rekonstruktion des Neurons Region gemacht mit ImageJ-Software 8 (Abbildung 4).
Das hochauflösende Fähigkeit MPM erlaubt uns auch Bilder insgesamt, einzelne Neuronen zu präsentieren. Hier zeigen wir, eine Rekonstruktion einer Schicht V pyramidalen Neuronen der Großhirnrinde, in denen einzelne dendritischen Prozesse deutlich sichtbar sind (Abbildung 5).
Abbildung 1 Repräsentative Bild aus einer 1,2 mm Bildstapels (0,8 - 2 mm unterhalb der Gewebeoberfläche). Ganzer Mäusehirn Neokortex und zeigt die verschiedenen Schichten des Hippocampus. Kennzeichen des Hippocampus sind sichtbar 1,1 mm unterhalb der Gewebeoberfläche und wurden unter Verwendung der markierten Followten Code:. DG = Gyrus dentatus, GrDG = Körnerschicht DG, Lmol = lacunosum moleculare Schicht Mol = molekulare Schicht DG, Or = oriens Schicht PoDG = polymorphe Schicht DG, Py = pyramidalen Zellschicht, Rad = Stratum radiatum 7 Das Bild ist 1,8 x 1,8 mm in der Größe, Maßstab = 200 um. Die rostralen Ende des Gehirns wurde in eine Petrischale mit der kaudalen Ende nach oben in Richtung des Ziels befestigt. Dies erleichterte Bildgebung in der Frontalebene.
Abbildung 2 Repräsentative Rahmens vom 1,2 mm Bildstapels (0,8 - 2 mm unterhalb der Gewebeoberfläche). Ganzer Mäusehirn Hervorhebung der Großhirnrinde. Pyramidenzellen und Prozesse exprimieren YFP in Schicht V / VI des Cortex sichtbar sind 2 mm unterhalb der Gewebeoberfläche. Der Grad der Kennzeichnung steht im Einklang mit früheren Berichten des spärlichen Kennzeichnung in der Großhirnrinde. 9 Inset (rechts) von b vergrößert oxed Bereich auf der linken Seite. Das Bild ist 1,8 x 1,8 mm in der Größe, Maßstab = 200 um (50 um Kasten).
Abbildung 3. Repräsentative Rahmens 774 um unterhalb der Gewebeoberfläche aus dem Bildvolumen der Schicht V pyramidalen Neuronen in der Großhirnrinde des Gehirns entnommen. Stack geht von 700 um bis 1.020 um unterhalb der Gewebeoberfläche. Ein 8-fachem Digitalzoom verwendet wurde, um Details wie feine Prozesse zu erfassen. Das Bild ist 225 x 225 um Größe, Maßstab = 20 um.
Abbildung 4. Repräsentatives Bild der 3D-Rekonstruktion (225 x 225 x 320 um) der Bildstapel in Abbildung 3. Das Bild ist 225 x 225 um Größe, Maßstab = 28 um.
Abbildung 5. Hochauflösende rekonstruierten Bildes einer Schicht V Pyramidenzellen Neuronen des Neocortex mit einem 10x digitalen Zoom. Neuron misst 485 um in der Länge, Maßstab = 25 um. Das Sichtfeld für jedes Bild Fliese 180 um x 180 um. Jede Fliese ist in unterschiedlicher Tiefe (z-Ebene). Die kortikalen apikalen Dendriten nicht im allgemeinen ausdrückliche YFP sowie der Soma. Um beide im selben Sichtfeld haben, wie hier gezeigt, die Macht abgesenkt wurde bis zur Sättigung von Soma zu minimieren; dies macht den feinen Verfahrens Blick Dimmer. Unser Schwerpunkt hier war die Demonstration field-of-view anstatt feinen Details. Um feinere Details verraten, verwenden Sie einen digitalen Zoom, Fokus auf eine Region ohne Soma und erhöhen die Laserleistung.
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Discussion
Während herkömmliche organische Farbstoffe kompatibel mit einer Reihe von organischen Lösungsmitteln sind, und daher nicht stellen eine besondere Herausforderung für das Clearing von Protokollen, sind fluoreszierende Proteine oft weniger tolerant Veränderungen in Lösungsmittel. 4 Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, eine ernsthafte Einschränkung zu überwinden bisherigen optischen Clearing Protokolle, bei denen Fluoreszenz XFPs verloren oder wurde stark beeinträchtigt. Die Bilder, die hier vorgestellt werden, zeigen, dass die Fluoreszenz von YFP aufbewahrt wurde. Die optische Clearing hier beschriebene Technik ermöglicht hochauflösende Bildgebung von YFP-markierten Neuronen im gesamten Gehirn der Maus bis zu 2 mm unterhalb der Gewebeoberfläche. Verwendung von Ethanol Dehydratisierung, wie zuvor gezeigt, ebenfalls erhalten grün und rot fluoreszierendes Protein Signale. 4 Die Abbildungen zeigen, wie hier dieses optische Sauberschaben angewendet werden, um ganze Organ Regionen, wie dem Hippocampus oder Neokortex daß ausdrückliche fluoreszierende Proteine zu untersuchen gezeigt. Die hohe-Auflösungsvermögen Mehrphotonenmikroskopie ermöglicht auch klar Vergrößerung von spezifischen Zellen oder Bereiche von Interesse im Organregion. Die Eckpunkte zum Konservieren Proteinfluoreszenz sind über-Fixierung zu vermeiden, darauf zu achten, dass die Fixiermittelpartikel und alle Lösungen mit nahezu neutralem pH-Wert gehalten werden, um Ethanol anstatt Methanol zur Dehydratisierung zu verwenden, und um die Proben in der Dunkelheit zu speichern.
Obwohl hier die Verwendung von optischen Lichtung zum Abbilden von Mäusehirn demonstrieren, ist die Technik, die allgemein in den meisten Organen. In dieser Studie haben wir gezeigt, hochauflösende Bilder von ganzen Maus Hirnregionen (Neocortex und Hippocampus) und spezifische Neuronen in der Schicht V des Neokortex (The Thy1-YFPH Mauslinie Etiketten Pyramidenzellen im Hippocampus und dünn in der Großhirnrinde, 9 anderen Regionen dunkel erscheinen.). Mit dem Bildstapel von Layer V Pyramidenzellen wurde ein 3D rekonstruierten Volumen der Neuronen erstellt. Die Leichtigkeit, mit which Diese Bilder wurden tief im Gehirn der Maus mit hoher Auflösung erfasst nach optischer Clearing macht dies ein leistungsfähiges Werkzeug für das Studium Neuroanatomie. Allerdings wurde während der grauen Substanz löscht sehr gut, Bildtiefe im Gehirn letztendlich durch unvollständige Clearing von dichten weißen Substanz Verträge in der Nähe der Mitte des Gehirns beschränkt. Dies ist nicht ein Problem in anderen Organen.
Ein Nachteil der Verwendung BABB für Clearing ist, dass es nicht kompatibel ist mit herkömmlichen Eintauchen Ziele. Den hohen Brechungsindex des Lösungsmittels, das Clearing Ergebnisse ermöglicht in optischen Aberrationen, und das Lösungsmittel kann der Klebstoff, der die Linsen an Stelle im Objektiv hält aufzulösen. Wir haben daher ein Makro-Objektiv, das Nikon AZ PlanFluor 5X 0.5NA WD 15 mm, die eine ~ 2-mm-Feld-of-view mit einer lateralen Auflösung von ca. 400 nm (1 / e Radius) und axiale Auflösung von ~ 4,9 vereint um (1 / e Radius). Das Objektiv hat auch eine Korrektur Kragen für sphärische Aberrationen kompensieren. Jedoch dieses Objektivverfügt über einen 22-mm Rückapertur und kann daher nicht leicht zu handelsüblichen Systemen angepasst werden. Man könnte Maschine einen benutzerdefinierten Gewindeadapter ermöglichen Montage der Linse auf ein Standard-Mikroskop, sondern sollte darauf geachtet werden, um sicherzustellen, dass der Anregungsstrahl Profil der hinteren Apertur füllt so viel wie möglich, um maximale Nutzung der verfügbaren numerischen Apertur zu machen. Während dieses Objektiv konnte durch eine relativ große Tiefe (~ 2 mm) ohne Eintauchen in die BABB Lösung konzentrieren, das seine 0,5 NA keine ausreichende Auflösung für bildgebende dendritischen Dornen. Eine Linse mit einer höheren NA von wenigstens 0,6 und ~ 40facher Vergrößerung der Lage ist, die Lösung dendritischen Dornen. Es muss jedoch genügend Arbeitsabstand zum Eintauchen in die BABB Lösung zu vermeiden. Die Aufrechterhaltung dieser Abstand wird wahrscheinlich begrenzen die Tiefe des Z-Stapel-Aufnahme deutlich unter der 2-mm tiefe und über Clearing.
Anzumerken ist, dass Fixierung und Clearing kann das Signal von Ende zu erhöhenexogene Quellen von Fluoreszenz. Dies wird am besten durch die Wahl längerer Wellenlänge Anregung (> 800 nm) und sorgfältige Auswahl der Emissionsfilter gut übereinstimmen das Fluoreszenzspektrum des Indikatorfarbstoffes vermieden.
Kürzlich wurde eine neue Harnstoff-Basis Clearingstelle genannt SCALE wurde nachgewiesen, dass das Signal von fluoreszierenden Proteinen 10 erhalten, jedoch dauert es 2 Wochen - 6 Monate, um eine Probe zu löschen, verglichen mit ein paar Stunden für BABB. SCALE lässt auch das Gewebe sehr zerbrechlich, mit großen Mengen von Gewebe-Expansion und die Verwendung von Harnstoff, die viele Proteine denaturiert, ist wahrscheinlich für Follow-up-Studien mit Immunhistochemie problematisch. Im Gegensatz dazu hat, obwohl Clearing-Prozess kann in einigen einheitliche Gewebeschrumpfung (~ 20%), Clearing mit BABB führen konnte gezeigt werden, kompatibel mit Standard-histologische Verarbeitung 1,2.
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Disclosures
Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Regelungen, die durch Institutional Tier Yale University Care & Use Committee eingerichtet durchgeführt.
Acknowledgments
Wir möchten Jacob Solis für seine Hilfe bei der Videobearbeitung danken.
Diese Arbeit wurde zum Teil durch einen NSF CAREER Award DBI-0953902 bis MJ Levene finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich, Inc. | D8537 | 500 ml, pH 7.2 |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | 10 x 10 ml, 16% paraformaldehyde |
| Ethyl alcohol | American Bioanalytical | AB00515-00500 | 500 ml, 200 proof |
| Ethyl alcohol | Pharmco Products, Inc. | 111000190 | 1 gal., 190 proof |
| Benzyl alcohol | Sigma-Aldrich, Inc. | 402834 | 500 ml, 99+% |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich, Inc. | B6630-IL | 500 ml, ≥ 99% |
| 5X/0.5 NA objective | Nikon | AZ Plan Flour 5X | 15 WD |
References
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