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Neuroscience

Microscopia Multiphoton di cervello di topo Cancellato Esprimere YFP

Published: September 23, 2012 doi: 10.3791/3848
Automatic Translation
*1, *1, 1,2, 1
1Department of Biomedical Engineering, Yale University, 2Department of Biomedical Engineering, Louisiana Tech University
* These authors contributed equally

Summary

Microscopio multifotone di organi topo intero è possibile otticamente deselezionando l'organo prima di imaging, ma non tutti i protocolli di preservare il segnale fluorescente di proteine ​​fluorescenti. L'utilizzo di un metodo ottico di compensazione con etanolo a base di disidratazione e alcol benzilico: benzil benzoato di compensazione, mostriamo immagini ad alta risoluzione multiphoton di cervello di topo che esprime tutta la YFP.

Abstract

Microscopio multifotone di fluorescenza intrinseca generazione e seconda armonica (SHG) di organi topo intero è reso possibile dal otticamente deselezionando l'organo prima di imaging. 1,2 Tuttavia, per gli organi che contengono proteine ​​fluorescenti come la GFP e YFP, protocolli di compensazione ottica che utilizzano metanolo disidratazione e chiaro con alcool benzilico: benzil benzoato (BABB), mentre non protetto dalla luce 3 non preservare il segnale fluorescente. Il protocollo qui presentato è un nuovo modo in cui effettuare la compensazione intero organo ottico sul cervello di topo preservando il segnale di fluorescenza di YFP espresso nei neuroni. La modifica del protocollo ottico di compensazione in modo tale che l'organo è disidratato utilizzando una serie graduata di etanolo è stato trovato per ridurre i danni alle proteine ​​fluorescenti e preservare il loro segnale fluorescente per l'imaging multifotone. 4 Utilizzo di un metodo ottimizzato dei sistemi di compensazione ottica con etanolo a base di disidratazione e compensazione da BABBmentre al riparo dalla luce, si mostrano immagini ad alta risoluzione multiphoton di giallo proteina fluorescente (YFP) espressione nei neuroni di un cervello di topo superiore a 2 mm sotto la superficie del tessuto.

Protocol

1. Animal perfusione 5 e tutto Clearing cervello di topo

  1. L'intera lunghezza della procedura può variare a seconda della lunghezza del tempo utilizzato per fase di disidratazione, ma in totale l'intero processo può essere condotto in due giorni.
  2. Pesare topi YFP quindi profondamente anestetizzare con una iniezione intraperitoneale di ketamina / xilazina (100 mg / kg: 10 mg / kg).
  3. Conferma un piano chirurgico di anestesia profonda prima di procedere alla chirurgia. Controllare l'animale ogni 5 minuti per vedere se reagisce a un dito del piede ditta o pizzico coda. Se l'animale reagisce, una dose supplementare (1/3 della dose originale) di ketamina / xilazina è necessaria.
  4. Una volta anestetizzato profondamente, trattenere il mouse aderendo ogni arto in un letto con del nastro chirurgico di laboratorio in modo che il mouse si trova in una posizione supina (recumbancy dorsale), esponendo il petto per un intervento chirurgico. Letto chirurgico è generalmente costituito da un metallo o rete di plastica e posta in un lavandino o su un pan-lipped modo che il sangue e fissativorifiuti possono essere facilmente raccolti.
  5. Per iniziare, fare un'incisione al di sotto del processo xifoideo. Tagliare lungo la base della gabbia toracica con le forbici e pinzette e tirare indietro la pelle, come il taglio è fatto. Fare due tagli lungo entrambi i lati dello sterno topo (attraverso le nervature) per creare un lembo di tessuto che si svolge dalla cavità toracica utilizzando una pinza emostatica lasciare esposto il cuore.
  6. Inserire un ago di 23 g nel ventricolo sinistro del cuore e fare una piccola incisione nella parete muscolare dell'atrio destro per permettere al sangue di scappare. Si prega di fare riferimento a Giove 2497 per un video di questa procedura 5.
  7. Subito dopo l'atrio destro è tagliato, iniziare una perfusione con 4 ° C tampone fosfato salino, PBS, (pH 7,2) fino a quando il sangue non viene più osservato drenante dall'atrio destro del cuore (30 - 40 ml ad una velocità di circa 5 ml / min).
  8. Una volta che tutto il sangue sia stato scaricato (fluido in uscita l'atrio destro è chiaro), cambia il supporto di perfusione ad una refrigerata 4%PFA soluzione. Perfondere fino corpo del mouse diventa notevolmente rigida e fredda al tatto (circa 30 - 40 ml ad una velocità di circa 5 ml / min). (Soluzione concentrata 16% PFA viene diluito secondo le istruzioni del produttore e NaOH si aggiunge fino a pH 7.2 è raggiunto. Indossare guanti e un camice da laboratorio e maneggiare e mescolare sostanze chimiche all'interno di una cappa aspirante.)
  9. Dopo la perfusione, togliere il mouse dal letto chirurgico e decapitare per iniziare l'asportazione del cervello.
  10. Con pinze e forbici iris, rimuovere il cranio in piccole sezioni a partire dalla parte posteriore del cranio e andare avanti. Fai piccoli tagli ogni 2 - 4 mm con le forbici in tutto il cranio durante l'utilizzo della pinza per tirare con attenzione l'osso dal cervello in piccole sezioni. Farlo finché l'intera superficie superiore del cervello è esposto.
  11. Accise il cervello dal cranio con un 5 mm di larghezza, spatola piatta e posto in un flaconcino di vetro. Immergere nel 4% PFA per 6 ore a 4 ° C per il fissaggio post.
  12. Dopo il messaggiofissaggio, lavare il cervello due volte in PBS temperatura ambiente versando la PFA dalla fiala di vetro e sostituendolo con PBS. Agitare il cervello in soluzione PBS prima di versare e la sua sostituzione con PBS per un secondo lavaggio.
  13. Disidratare il cervello a temperatura ambiente da una serie graduata di etanolo incubazioni (una volta in 50%, 70%, 95%, e due volte in 100%) a 2 ore per incubazione, e poi 12 ore per la seconda incubazione etanolo 100%, a estrarre l'acqua dal tessuto fissato. Per ciascuna incubazione, versare la soluzione precedente etanolo dall'ampolla e sostituirlo con la soluzione successiva finché il cervello è completamente sommerso.
  14. Dopo la seconda incubazione in 100% etanolo, versare la soluzione e sostituire con parti uguali di etanolo e la soluzione di compensazione contenente alcool benzilico e benzil benzoato (1:2 vol: rapporto vol). Dopo 2 ore di incubazione, far decantare la soluzione e sostituire con una soluzione 100% di alcool benzilico e benzile benzoato (1:2 vol: vol rapporto). Il Refraindice ctive della soluzione di compensazione è n = 1.54.
  15. Una volta in BABB, il cervello diventa notevolmente trasparente, entro 4 - 5 ore. Per ottenere i migliori risultati di compensazione, lasciare il cervello per eliminare per 6 giorni a temperatura ambiente, mentre al riparo dalla luce.

2. Microscopio di installazione

  1. Una volta che il cervello è azzerato e pronto per l'imaging, applicarla sul fondo di una piastra di Petri con cianoacrilato. Lasciare che la colla si asciughi prima di procedere.
  2. Dopo l'asciugatura, immergere il cervello in BABB e posizionare la piastra di Petri nell'ambito dell'obiettivo microscopio per l'imaging.
  3. Usiamo un microscopio multifotone che incorpora un Mai Tai laser titanio zaffiro regolabile tra un nm 710-990 nm di eccitazione. La lunghezza d'onda di eccitazione che utilizziamo per generare segnali YFP è 886 nm. Potenza laser varia da 30 - 100 mW a seconda della profondità delle immagini.
  4. Catturare il segnale riflesso fluorescenza utilizzando un obiettivo 5X Nikon (NA, 0,5) che permette grandecampo di vista di imaging (2 x 2 mm).
  5. Filtrare il segnale riflesso fluorescente utilizzando un filtro 535/50 passa-banda e raccoglierlo con un PMT GaAsP (H7422PA-40, Hamamatsu, Bridgewater, New Jersey).
  6. Le immagini del processo utilizzando il software scanimage 6 ad una risoluzione di 2048 x 2048 pixel con una velocità di scansione di 2 ms per linea per generare ad alta risoluzione, immagini YFP.
  7. Una volta che l'imaging, rimuovere il cervello dalla scatola di Petri con pinze e conservare in BABB schermati dalla luce per l'imaging futuro. Per campioni incollati, rimuovere il tessuto eseguendo una lama di rasoio tra la colla e la piastra di Petri con un angolo non superiore a 30 gradi. Abbiamo conservato i campioni in BABB fino a 1 anno senza degrado visibile.

3. Risultati rappresentativi

Le immagini rappresentative ei video qui riportati dimostrano l'alta risoluzione multifotone capacità di imaging resa possibile dalla compensazione ottica. Brain imaging intera consenteper YFP-etichettato neuroni nei diversi strati della ippocampo e la corteccia di essere chiaramente visibile come profondo come 2 mm sotto la superficie del tessuto. Figura 1 mostra un'immagine rappresentativa di una vista coronale corrispondente alle caratteristiche anatomiche dell'ippocampo a 2,92 millimetri caudale al bregma 7. La profondità di imaging nel campione era 1,94 millimetri. Parte di questa differenza è dovuta alla rimozione del cervelletto alla fine caudale del cervello e l'equilibrio era dovute al ritiro dal processo di disidratazione. Un'altra immagine della pila mostra strato V / VI neuroni piramidali della neocorteccia esprimere YFP 2 millimetri sotto la superficie del tessuto (Figura 2). Tutte le immagini sono state acquisite con l'obiettivo Nikon 5X e l'ingrandimento è stato fatto utilizzando la funzione di zoom digitale per l'acquisizione delle immagini nel software scanimage.

Con ingrandimento di neocorteccia, gli assoni individuali e corpi cellulari dei neuroni piramidali neurone nello strato V della neocorteccia sono chiarely distinguibili fino a 1.02 mm sotto la superficie del tessuto (Figura 3). Utilizzando lo stack immagine da figura 3, una ricostruzione 3D della regione neurone è stata effettuata utilizzando il software ImageJ 8 (figura 4).

La capacità ad alta risoluzione di MPM ci permette anche di presentare immagini di intere, singoli neuroni. Qui mostriamo una ricostruzione di un neurone piramidale strato V della neocorteccia in cui i singoli processi dendritiche sono chiaramente visibili (Figura 5).

Figura 1
Figura 1 immagine rappresentativa di una serie di immagini 1,2 millimetri (0,8 - 2 mm sotto la superficie del tessuto). Cervello di topo intero neocorteccia e mostra i diversi strati nell'ippocampo. Caratteristiche dell'ippocampo sono visibili 1,1 millimetri sotto la superficie del tessuto e sono stati denominati usando il followING codice:. DG = giro dentato, GrDG strato granulare = della DG, Lmol = lacunosum moleculare strato, Mol = strato molecolare DG, o = strato Oriens, PoDG = polimorfo livello DG, Py = strato di cellule piramidali, Rad = strato radiatum 7 L'immagine è 1,8 x 1,8 mm di dimensioni, scala bar = 200 micron. L'estremità rostrale del cervello è stato fissato ad una piastra di Petri con l'estremità caudale rivolto verso l'obiettivo. Questo facilitato immagini sul piano coronale.

Figura 2
Figura 2 cornice rappresentativa dalla pila 1,2 millimetri immagine (0,8 - 2 mm sotto la superficie del tessuto). Del cervello di topo che evidenzi la neocorteccia. Cellule piramidali e processi che esprimono YFP nello strato V / VI della corteccia sono visibili 2 mm sotto la superficie del tessuto. Il grado di etichettatura è in linea con le precedenti relazioni delle etichette sparse nella neocorteccia. 9 Inset (a destra) viene ingrandita da b zona oxed a sinistra. L'immagine è 1,8 x 1,8 mm di grandezza, barra di scala = 200 micron (50 micron riquadro).

Figura 3
Figura 3. Cornice rappresentativa presa 774 micron sotto la superficie del tessuto dalla pila immagine di strato neuroni piramidali V nella neocorteccia del cervello. Pila va da 700 micron a 1020 micron sotto la superficie del tessuto. Uno zoom digitale 8X è stata utilizzata per catturare dettagli come i processi sottili. Immagine è di 225 x 225 micron di dimensione, scala bar = 20 micron.

Figura 4
Figura 4. Immagine rappresentativa di ricostruzione 3D (225 x 225 x 320 um) della pila di immagini in Figura 3. Immagine è di 225 x 225 micron di dimensione, scala bar = 28 micron.

s "> Figura 5
Figura 5. Ad alta risoluzione immagine ricostruita di un neurone piramidale strato V della neocorteccia utilizzando uno zoom digitale 10x. Neuron misura 485 micron di lunghezza, barra della scala = 25 micron. Il campo di vista per ogni piastrella immagine è 180 um x 180 micron. Ogni piastrella è a una diversa profondità (z-livello). I dendriti apicali corticali non, in generale, espressa YFP e il soma. Per avere entrambi nello stesso campo di vista, come illustrato di seguito, il potere è stato abbassato per ridurre al minimo la saturazione del soma, il che fa la multa dimmer aspetto del processo. La nostra enfasi qui era di dimostrare campo di vista, piuttosto che piccoli dettagli. Per rivelare i dettagli più fini, utilizzare uno zoom digitale, concentrarsi su una regione senza soma, e di aumentare la potenza del laser.

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Discussion

Mentre standard di coloranti organici sono compatibili con una gamma di solventi organici, e quindi non pongono una sfida particolare per la compensazione protocolli, proteine ​​fluorescenti sono spesso meno tollerante di cambiamenti nel solvente. 4 Lo scopo del presente lavoro era di superare una grave limitazione precedenti protocolli di compensazione ottica in cui è stato perso di fluorescenza di XFP o gravemente degradato. Le immagini che vengono qui presentati dimostrano che la fluorescenza di YFP è stata preservata. La tecnica di compensazione ottica descritta qui consente imaging ad alta risoluzione di neuroni YFP-marcati in topo cervello intero fino a 2 mm sotto la superficie del tessuto. Utilizzando disidratazione etanolo, come dimostrato in precedenza, anche conservare verde e rosso segnali proteina fluorescente. 4 Le immagini mostrate qui dimostrano come questa tecnica di compensazione ottica può essere applicato per studiare regioni organo, come l'ippocampo o neocorteccia che esprimono proteine ​​fluorescenti. L'alta-Capacità di risoluzione microscopia multifotone consente inoltre di ingrandimento chiara delle cellule specifiche o aree di interesse all'interno della regione organo. I punti chiave per la conservazione fluorescenza proteine ​​sono per evitare un eccesso di fissazione, per fare in modo che il fissativo e tutte le soluzioni sono mantenuti a livelli prossimi alla pH neutro, per usare l'etanolo invece di metanolo per la disidratazione, e di conservare i campioni al buio.

Sebbene abbiamo dimostrato qui l'utilizzo di compensazione ottica per l'imaging del cervello di topo, la tecnica è generalmente applicabile alla maggior parte degli organi. In questo studio abbiamo dimostrato immagini ad alta risoluzione di intere regioni del cervello di topo (neocorteccia e l'ippocampo) e neuroni specifici nel livello V della neocorteccia (Il Thy1-YFPH linea del mouse etichette cellule piramidali dell'ippocampo e scarsamente nella neocorteccia, 9 altre regioni appaiono scure.). Utilizzando l'immagine della pila strato V neuroni piramidali, un volume 3D ricostruito dei neuroni è stato creato. La facilità con which queste immagini sono state catturate in profondità all'interno del cervello di topo in alta risoluzione dopo compensazione ottica lo rende un potente strumento per studiare neuroanatomia. Tuttavia, mentre la materia grigia cancella molto bene, la profondità di immagini nel cervello è stata alla fine limitata dalla compensazione incompleta dei densi tratti di sostanza bianca vicino al centro del cervello. Questo non è un problema in altri organi.

Uno svantaggio di utilizzare BABB di compensazione è che non è compatibile con i convenzionali obiettivi immersione. L'indice di rifrazione del solvente che permette risultati compensazione delle aberrazioni ottiche, e il solvente può sciogliere la colla che tiene le lenti in atto nel obiettivo. Abbiamo quindi utilizzato un obiettivo macro, la Nikon AZ PlanFluor 5X 0.5NA WD 15 mm, che combina un ~ 2 mm campo di vista con una risoluzione laterale di ~ 400 nm (1 / e raggio) e la risoluzione assiale di ~ 4.9 um (1 / raggio e). La lente ha anche un collare di correzione per compensare le aberrazioni sferiche. Tuttavia, questo obiettivoha un 22 mm di apertura posteriore e quindi non può essere facilmente adattato a sistemi standard commerciali. Una macchina potrebbe un adattatore personalizzato filo per consentire il montaggio della lente su un microscopio standard, ma si deve prestare attenzione a garantire che il profilo di fascio di eccitazione riempie l'apertura posteriore il più possibile per sfruttare al massimo l'apertura numerica disponibili. Anche se questo obiettivo è stato in grado di mettere a fuoco attraverso una profondità relativamente grande (circa 2 mm) senza immersione nella soluzione BABB, la sua 0.5 NA non prevede una risoluzione adeguata per spine dendritiche di imaging. Un obiettivo con una NA superiore di almeno 0,6 e ingrandimento 40X ~ è in grado di risolvere spine dendritiche. Tuttavia, si deve avere sufficiente distanza di lavoro per evitare l'immersione nella soluzione BABB. Mantenendo questa distanza sarà probabilmente limitare la profondità di z-pila di immagini ben al di sotto del 2-mm profondità disponibili tramite compensazione.

Va notato che la fissazione e la compensazione può aumentare il segnale di finefonti ogenous di fluorescenza. Questo è meglio evitare scegliendo più lunghezze d'onda di eccitazione (> 800 nm) e la selezione dei filtri di emissione per abbinare bene lo spettro di fluorescenza del colorante indicatore.

Recentemente, un nuovo urea-base agente di compensazione denominata SCALE è stato dimostrato per preservare il segnale da proteine ​​fluorescenti 10, tuttavia, ci vogliono 2 settimane - 6 mesi per cancellare un campione, rispetto a qualche ora per BABB. SCALA lascia anche il tessuto molto fragile, con grandi quantità di espansione del tessuto, e l'utilizzo di urea, che denatura molte proteine, è probabile che sia un problema per gli studi di follow-up con immunoistochimica. Al contrario, sebbene processo di compensazione può provocare un certo restringimento del tessuto uniforme (~ 20%), con compensazione BABB ha dimostrato di essere compatibile con lo standard 1,2 trasformazione istologica.

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Disclosures

Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le linee guida e regolamenti stabiliti dalla cura degli animali Istituzionale della Yale University e Comitato di Utilizzo.

Acknowledgments

Vorremmo ringraziare Giacobbe Solis per la sua assistenza nel montaggio video.

Questo lavoro è stato finanziato in parte da un premio alla carriera NSF DBI-0953902 a MJ Levene.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phosphate Buffered Saline Sigma-Aldrich, Inc. D8537 500 ml, pH 7.2
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710 10 x 10 ml, 16% paraformaldehyde
Ethyl alcohol American Bioanalytical AB00515-00500 500 ml, 200 proof
Ethyl alcohol Pharmco Products, Inc. 111000190 1 gal., 190 proof
Benzyl alcohol Sigma-Aldrich, Inc. 402834 500 ml, 99+%
Benzyl benzoate Sigma-Aldrich, Inc. B6630-IL 500 ml, ≥ 99%
5X/0.5 NA objective Nikon AZ Plan Flour 5X 15 WD

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References

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Neuroscienze Numero 67 Ingegneria Biomedica Biologia molecolare microscopia multiphoton mouse cervello radura YFP fluroescence
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Parra, S. G., Vesuna, S. S., Murray, T. A., Levene, M. J. Multiphoton Microscopy of Cleared Mouse Brain Expressing YFP. J. Vis. Exp. (67), e3848, doi:10.3791/3848 (2012).

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