Summary
Multiphoton mikroskopi av hela mus organ är möjlig genom optiskt rensa organet före avbildning, men inte alla protokoll bevara fluorescenssignalen av fluorescerande proteiner. Använda en optisk clearing metod med etanol-baserad uttorkning och bensylalkohol: bensylbensoat clearing visar vi högupplösta multiphoton bilder av hela mushjärna uttrycker YFP.
Abstract
Multiphoton mikroskopi av inneboende fluorescens och andra harmoniska generationen (SHG) av hela mus organ möjliggörs genom optiskt rensa organet före avbildning. 1,2 För organ som innehåller fluorescerande proteiner såsom GFP och YFP, optiska clearing protokoll som använder metanol uttorkning och tydlig med användande av bensylalkohol: bensylbensoat (BABB) medan oskyddad från ljus 3 inte bevarar inte den fluorescerande signalen. Protokollet presenteras här är ett nytt sätt för att utföra hela organ optisk clearing på mushjärna samtidigt som fluorescenssignalen av YFP uttryckt i nervceller. Ändra de optiska clearing-protokollet så att orgeln är uttorkad med en etanol graderad serie har visat sig minska skadorna på de fluorescerande proteiner och bevara sin fluorescerande signal för multiphoton avbildning. 4 Använda en optimerad metod för optisk clearing med etanol-baserad uttorkning och clearing av BABBmedan skyddad från ljus, visar vi högupplösta multiphoton bilder av gula fluorescerande protein (YFP) uttryck i nervceller i en mushjärna mer än 2 mm under vävnadsytan.
Protocol
1. Djurens Perfusion 5 och hela Mouse Brain Clearing
- Hela längden av förfarandet kan variera beroende på hur lång tid som används per dehydratiseringssteg, men totalt hela processen kan utföras i två dagar.
- Väg YFP möss och sedan djupt söva med en intraperitoneal injektion av ketamin / xylazin (100 mg / kg: 10 mg / kg).
- Bekräfta en kirurgisk plan av djup anestesi innan du fortsätter till operation. Kontrollera djuret var 5 minut för att se om den reagerar på en fast tå eller svans nypa. Om djuret reagerar, är en extra dos (1/3 av den ursprungliga dosen) av ketamin / xylazin krävs.
- När djupt sövda, hindra musen genom att hålla fast varje lem till en kirurgisk säng med lab tejp så att musen är i ryggläge (dorsala recumbancy), utsätta sitt bröst för operation. Den kirurgiska Bädden består vanligtvis av en metall eller plastnät och placerades i en vask eller ovanpå en läppförsedd-pan, så att blod och fixeringsmedelAvfall kan lätt uppsamlas.
- Till att börja med gör ett snitt under xyphoid processen. Skär längs basen av bröstkorgen med sax och pincett och dra tillbaka huden när snittet görs. Gör två snitt längs vardera sidan av musen bröstbenet (genom revbenen) för att skapa en flik av vävnad som hålls bort från brösthålan med en hemostat för att lämna hjärtat exponeras.
- Sätt i en 23 g nål i den vänstra ventrikeln av hjärtat och göra ett litet snitt i muskeln väggen höger förmak för att tillåta blod att fly. Se Jove artikel 2497 för en video av detta förfarande. 5
- Omedelbart efter det högra förmaket skärs, börjar en perfusion med 4 ° C fosfatbuffrad saltlösning, PBS, (pH 7,2) tills blod inte längre observeras dränering från höger förmak i hjärtat (30 - 40 ml med en hastighet av ca 5 ml / min).
- När allt blod har tömts (vätska lämnar höger förmak är klar), växla perfusionsmediet till en kyld 4%PFA-lösning. Perfundera tills musens kropp blir märkbart stel och kallt vid beröring (ca 30 till 40 ml vid en hastighet av ca 5 ml / min). (Koncentrerad 16% PFA späds enligt tillverkarens anvisningar och NaOH tillsätts tills pH 7,2 uppnåtts. Använd handskar och skyddsrock och hantera och blanda kemikalier i ett dragskåp.)
- Efter perfusion bort musen från den kirurgiska sängen och halshugga att börja excision av hjärnan.
- Använd pincett och iris sax, ta bort skallen i små delar med början från baksidan av skallen och framåt. Gör små snitt var 2 till 4 mm med saxen över skallen när du använder pincett för att försiktigt dra benet bort från hjärnan i små delar. Gör detta tills hela övre ytan av hjärnan exponeras.
- Excise hjärnan från skallen med en 5 mm bred, platt spatel och placera i en glasflaska. Sänk i 4% PFA under 6 h vid 4 ° C för efter fixering.
- Efter inläggetfixering, tvätta hjärnan två gånger i rumstemperatur PBS genom att hälla PFA ur glasflaska och ersätta den med PBS. Snurra hjärnan i PBS-lösning innan du häller ut och ersätta med PBS för en andra tvätt.
- Dehydratisera hjärnan vid rumstemperatur med en graderad serie av etanol inkubationer (en gång i 50%, 70%, 95%, och två gånger i 100%) vid 2 h per inkubation, och sedan 12 h för den andra 100% etanol inkubation, till extrahera vattnet från den fasta vävnaden. För varje inkubation, häll ut den föregående etanollösningen från glasflaska och ersätta den med den efterföljande lösningen tills hjärnan är helt nedsänkt.
- Efter den andra inkubationen i 100% etanol, häll ut lösningen och ersätta med lika delar etanol och clearing innehållande bensylalkohol och bensylbensoat (1:2 volym: volym-förhållande). Efter 2 h inkubation dekanterades lösningen och ersätta med en 100% lösning av bensylalkohol och bensylbensoat (1:2 volym: volym-förhållande). Den refractive index för clearing lösningen är n = 1,54.
- Väl i Babb, kommer hjärnan att bli märkbart transparent inom 4 till 5 timmar. För bästa clearing resultat, lämna hjärnan att rensa i 6 dagar i rumstemperatur medan skyddad från starkt ljus.
2. Mikroskop Setup
- När hjärnan rensas och redo för avbildning, fast den på botten av en petriskål med cyanoakrylat. Låt limmet torka innan du fortsätter.
- Efter torkning, dränka hjärnan i Babb och placera petriskål under mikroskop målet för avbildning.
- Vi använder en multiphoton mikroskop som innehåller en Mai Tai titan safir laser justerbar mellan 710 nm till 990 nm excitationsvåglängd. Excitationsvåglängden vi använder för att generera YFP signaler är 886 nm. Lasereffekten varierar från 30 till 100 mW beroende på avbildning djup.
- Fånga den reflekterade fluorescerande signal med hjälp av en Nikon 5X mål (NA, 0,5) som gör det möjligt för storafält-of-view avbildning (2 x 2 mm).
- Filtrera den reflekterade fluorescerande signal med hjälp av en 535/50 bandpassfilter och samla den med en GaAsP PMT (H7422PA-40, Hamamatsu, Bridgewater, New Jersey).
- Process bilder med ScanImage programvara 6 med en upplösning på 2048 x 2048 bildpunkter med en svephastighet av 2 ms per linje för att generera högupplösta, YFP bilder.
- När avbildning är klar, ta bort hjärnan från petriskålen med pincett och förvara i Babb skyddade från ljus för framtida avbildning. För limmade prover bort vävnaden genom att köra ett rakblad mellan limmet och petriskål vid en vinkel som inte är större än 30 grader. Vi har lagrat prover i Babb upp till 1 år utan synliga nedbrytning.
3. Representativa resultat
De representativa bilder och videor som visas här visar högupplösta multiphoton avbildande förmåga som möjliggjorts genom optisk clearing. Hel hjärnavbildning kanför YFP-märkta neuroner i de olika skikten av hippocampus och cortex vara klart synlig så djupt som 2 mm under vävnadsytan. Figur 1 visar en representativ bild av en koronal vy motsvarande de anatomiska särdrag hippocampus vid 2,92 mm kaudalt till bregma 7. Djupet av avbildning i provet var 1,94 mm. En del av denna skillnad berodde på avlägsnandet av lillhjärnan vid den kaudala änden av hjärnan och resten var på grund av krympning från dehydratiseringsprocessen. En annan bild från stapeln visar skiktet V / VI pyramidala neuroner i neocortex uttrycker YFP 2 mm under vävnadsytan (figur 2). Alla bilder har förvärvats med hjälp av Nikons 5X mål och förstoring gjordes med hjälp av digital zoom funktionen för bildtagning i ScanImage programvara.
Genom att zooma in på neocortex, de enskilda axoner och neuron organ cell pyramidala nervceller i lager V i neocortex är tydligaly särskiljas upp till 1,02 mm under vävnadsytan (figur 3). Använda bildstapel från figur 3, var en 3D-rekonstruktion av neuron regionen med användning ImageJ programvara 8 (figur 4).
Den högupplösta kapacitet MPM gör också att vi kan presentera bilder av hela, enskilda nervceller. Här visar vi en rekonstruktion av ett lager V pyramidal neuron i hjärnbarken där enskilda dendritiska processer syns tydligt (Figur 5).
Figur 1 representativ bild från en 1,2 mm bildstapel (0,8 - 2 mm under vävnadsytan). Av hel mushjärna visar neocortex och de olika skikten av hippocampus. Funktioner i hippocampus är synliga 1,1 mm under vävnadsytan och har märkts med följandening kod:. GD = dentate gyrus, GrDG = granulärt skikt av GD, Lmol = lacunosum moleculare lager, Mol = molekylär lager GD OR = Oriens lager, PoDG = polymorfen lager GD, Py = pyramidal cellager, Rad = stratum radiatum 7 Bilden är 1,8 x 1,8 mm i storlek, skala bar = 200 nm. Den rostrala änden av hjärnan fästes till en petriskål med den kaudala änden uppåt mot målet. Detta underlättade avbildning i koronala planet.
Figur 2 Representant ramen från 1,2 mm bildstapel (0,8 - 2 mm under vävnadsytan). Av hela mushjärna belyser neocortex. Pyramidala celler och processer som uttrycker YFP i skikt V / VI i hjärnbarken är synliga 2 mm under vävnadsytan. Graden av märkning stämmer överens med tidigare rapporter från glesa märkning i hjärnbarken. 9 Inset (höger) förstoras från b oxed område på vänster. Bilden är 1,8 x 1,8 mm i storlek, skala bar = 200 nm (50 nm infälld).
Figur 3. Representativa ram tagen 774 um under vävnadsytan från bilden stapeln av lager V pyramidala neuroner i hjärnbarken i hjärnan. Stack går från 700 ^ m till 1.020 | im under vävnadsytan. En 8x digital zoom användes för att fånga detaljer som fina processer. Bilden är 225 x 225 nm i storlek, skala bar = 20 pm.
Figur 4. Representativ bild av 3D-rekonstruktion (225 x 225 x 320 um) av bilden stacken i Figur 3. Bilden är 225 x 225 nm i storlek, skala bar = 28 pm.
Figur 5. Högupplöst rekonstruerad bild av ett lager V pyramidal neuron i neocortex med en 10x digital zoom. Neuron mäter 485 nm i längd, skala bar = 25 pm. Synfältet för varje bild kakel är 180 um x 180 um. Varje platta är vid ett annat djup (z-nivå). De kortikala apikala dendriter inte i allmänhet uttrycka YFP samt soma. Att ha båda i samma synfält, som visas här, var kraften sänktes för att minimera mättnad av soma, vilket gör den fina dimmer processen utseende. Vår fokus här var på att visa fält-of-view istället fina detaljer. Att avslöja finare detaljer, använd en digital zoom, fokus på ett område utan soma och öka lasereffekten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Medan vanliga organiska färgämnen är kompatibla med en rad olika organiska lösningsmedel och därför inte utgör en särskild utmaning för att rensa protokoll, fluorescerande proteiner är ofta mindre toleranta mot förändringar i lösningsmedel. 4 Målet för föreliggande arbete var att övervinna en allvarlig begränsning av tidigare optiska clearing protokoll där fluorescens XFPs förlorades eller allvarligt skadad. De bilder som presenteras här visar att fluorescens från YFP bevarades. Den optiska Skrapningstekniken beskrivs här möjliggör högupplöst avbildning av YFP-märkta nervceller i hela mushjärna upp till 2 mm under vävnadsytan. Användning av etanol uttorkning, såsom demonstrerats tidigare, kommer också att bevara grönt och rött fluorescerande protein signaler. 4 Bilderna visas här visa hur denna optiska Skrapningstekniken kan tillämpas för att studera hela organ regioner, såsom hippocampus eller neocortex som uttrycker fluorescerande proteiner. Den högaUpplösning förmåga multiphoton mikroskopi ger också tydliga förstoring av specifika celler eller områden av intresse inom organet regionen. De viktigaste punkterna för att bevara proteinfluorescens är att undvika alltför fixering, för att ta hand om att fixativ och alla lösningar hålls vid nära neutralt pH, för att använda etanol istället för metanol för uttorkning, och lagra proverna i mörker.
Även om vi visar här användningen av optisk clearing för avbildning av mushjäma, är tekniken generellt tillämpbar på de flesta organ. I denna studie har vi visat högupplösta bilder av hela regioner mushjärna (neocortex och hippocampus) och specifika nervceller i lager V i hjärnbarken (Den Thy1-YFPH mus linje etiketter pyramidala celler i hippocampus och glest i hjärnbarken, 9 andra regioner mörk.). Använda bilden bunt Layer V pyramidala nervceller har en 3D rekonstruerad volym nervceller skapas. Den lätthet med which dessa bilder fångades djupt inne i musen hjärnan med hög upplösning efter optisk clearing gör detta ett kraftfullt verktyg för att studera neuroanatomi. Dock under grå rensar mycket bra, bildbehandling djup i hjärnan slutligen begränsas av ofullständig rensning av täta vita substans skrifter nära centrum i hjärnan. Detta är inte ett problem i andra organ.
En nackdel med att använda BABB för clearing är att det inte är förenligt med konventionella avbländande mål. Den höga brytningsindex av lösningsmedlet som möjliggör clearing resultat i optiska aberrationer, och lösningsmedlet kan lösa det kitt som håller linserna på plats i målet. Vi använde därför ett makroobjektiv, Nikon AZ PlanFluor 5X 0.5NA WD 15 mm, som kombinerar en ~ 2-mm field-of-view med en lateral upplösning på ~ 400 nm (1 / e radie) och axiell upplösning ~ 4,9 im (1 / e radie). Linsen har också en korrigering krage för att kompensera för sfäriska aberrationer. Men det här objektivethar en 22 mm rygg öppning och kan därför inte lätt anpassas till vanliga kommersiella system. Man kunde bearbeta en egen tråd adapter för att göra det möjligt att montera linsen på en vanlig mikroskop, men försiktighet bör iakttas för att säkerställa att excitationsstrålen profilen fyller ryggen bländare så mycket som möjligt för att maximalt utnyttja den tillgängliga numeriska apertur. Medan denna lins kunde fokusera genom en relativt stor djup (~ 2 mm) utan nedsänkning i BABB lösningen ger sina 0,5 NA inte tillräcklig upplösning för att avbilda Dendritutskotten. En lins med en högre NA minst 0,6 och ~ 40X förstoring kan lösa Dendritutskotten. Dock måste det ha tillräcklig bearbetning avstånd för att undvika nedsänkning i BABB lösningen. Bibehålla detta avstånd kommer sannolikt att begränsa djupet av z-stapeln bilden till väl under den 2-mm djup tillgängliga via clearing.
Det bör noteras att fixering och clearing kan öka signalen från slutetogenous källor fluorescens. Detta är bäst undvikas genom att välja längre våglängd excitering (> 800 nm) och noggrant urval av utsläpp filter för att väl passa det fluorescensspektrum av indikatorfärgämnet.
Nyligen har en ny urea-bas clearing agent kallas SCALE visat att bevara signalen från fluorescerande proteiner 10, men tar det 2 veckor - 6 månader att rensa ett prov, jämfört med några timmar för BABB. SCALE lämnar också vävnaden mycket bräcklig, med stora mängder vävnad expansion och användning av urea, som denaturerar många proteiner, kommer sannolikt att vara problematisk för uppföljande studier med immunohistokemi. Däremot har även clearing process kan resultera i viss enhetlig vävnad krympning (~ 20%), rensa med BABB visats vara kompatibel med standard histologisk bearbetning 1,2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Djurförsök utfördes i enlighet med de riktlinjer och regler som anges av Yale University institutionella Animal Care & Use kommitté.
Acknowledgments
Vi vill tacka Jacob Solis för hans hjälp i videoredigering.
Detta arbete har finansierats delvis av en NSF KARRIÄR Award DBI-0953902 till MJ Levene.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich, Inc. | D8537 | 500 ml, pH 7.2 |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | 10 x 10 ml, 16% paraformaldehyde |
| Ethyl alcohol | American Bioanalytical | AB00515-00500 | 500 ml, 200 proof |
| Ethyl alcohol | Pharmco Products, Inc. | 111000190 | 1 gal., 190 proof |
| Benzyl alcohol | Sigma-Aldrich, Inc. | 402834 | 500 ml, 99+% |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich, Inc. | B6630-IL | 500 ml, ≥ 99% |
| 5X/0.5 NA objective | Nikon | AZ Plan Flour 5X | 15 WD |
References
- Parra, S. G., Chia, T. H., Zinter, J. P., Levene, M. J. Multiphoton microscopy of cleared mouse organs. J. Biomed. Opt. 15, 036017 (2010).
- Vesuna, S., Torres, R., Levene, M. J. Multiphoton fluorescence, second harmonic generation, and fluorescence lifetime imaging of whole cleared mouse organs. J. Biomed. Opt. 16, 106009 (2011).
- Zucker, R. M. Whole insect and mammalian embryo imaging with confocal microscopy: Morphology and apoptosis. Cytometry. A69, 1143-1152 (2006).
- Sakhalkar, H. S. Functional imaging in bulk tissue specimens using optical emission tomography: Fluorescence preservation during optical clearing. Phys. Med. Biol. 52, 2035-2054 (2007).
- Dazai, J., Spring, S., Cahill, L. S., Henkelman, R. M. Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging. J. Vis. Exp. (48), e2497 (2011).
- Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes. Biomed. Eng. Online. 2, (2003).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , 2nd Ed, Elsevier Science. San Diego, CA, USA. (2001).
- Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).
- Feng, G., Mellor, R. H., Bernstein, M., Keller-Peck, C., Nguyen, Q. T., Wallace, M., Nerbonne, J. M., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Imaging Neuronal Subsets in Transgenic Mice Expressing Multiple Spectral Variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Hama, H. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat. Neuro. 14, 1481-1488 (2011).
