Summary
إجراء فحص في الوقت الحقيقي لتحديد الأدوية التي تتفاعل مع بروتين G-K بوابات المعدل نحو الداخل
Abstract
G البروتين بوابات الداخل المعدل K + (GIRK) قنوات العمل كوسطاء الخلوية من مجموعة واسعة من الهرمونات والناقلات العصبية، ويتم التعبير عنها في الدماغ والعضلات والهيكل العظمي والقلب والغدد الصماء 1،2 الأنسجة. قنوات GIRK أصبح تفعيلها بعد ملزم من يغاندس (الناقلات العصبية والهرمونات، والمخدرات، ... الخ) والبلازما على غشاء محدد، G-الديناميكي بروتين المستقبلات (GPCRs). هذا الربط يؤدي إلى تحفيز بروتينات جي (G i و س G) الذي ربط في وقت لاحق إلى وتفعيل قناة GIRK. فتحت مرة واحدة في قناة GIRK يسمح لحركة K + الخروج من الخلية مما تسبب في غشاء يستريح القدرة على أن تصبح أكثر سلبية. ونتيجة لذلك، GIRK تنشيط الخلايا العصبية في قناة يقلل عفوية تشكيل إمكانات العمل ويحول دون الإفراج عن الناقلات العصبية مثير. في القلب، وتفعيل قناة GIRK يكبح نشاط جهاز تنظيم ضربات القلب وبالتالي تباطؤ في دقات القلب.
هنا، نحن تصف فحص فحص في الوقت الحقيقي لتحديد جهري جديد من القنوات GIRK. في هذا الاختبار، يتم تحميل خلايا العصبية AtT20، معربا عن قنوات GIRK، مع إمكانية الأصباغ الحساسة للغشاء فلوري مثل مكرر (1،3-dibutylbarbituric حامض) trimethine oxonol [DiBAC 4 (3)] أو HLB 021-152 (الشكل 1 ). جزيئات الصبغة تصبح امتصاص التالية فلوري بقوة في الخلايا (الشكل 1). علاجمن الخلايا مع يغاندس النوع من الاختزال يحفز قنوات GIRK لفتح. الناتج K + هروب رأس المال للخروج من الخلية يسبب غشاء المحتملة لتصبح أكثر سلبية وإشارة إلى تخفيض فلوري (الشكل 1). وبالتالي، يمكن أن يعاير العقاقير التي تعدل K + هروب رأس المال من خلال قناة GIRK باستخدام قارئ لوحة فلوري. خلافا لغيرها من المقايسات ايون فحص القناة، مثل مطياف الامتصاص الذري (4) أو تحليل المشع 5، وفحص قناة GIRK فلوري يوفر إجراء فحص سريع، في الوقت الحقيقي وغير مكلفة.
Protocol
1. إعداد خلايا
- تنمو خلايا الغدة النخامية AtT20 في المتوسط Dulbecco لتعديل النسر (DMEM) تستكمل مع سيرم الحصان 10٪ والحفاظ على الثقافات على 37 درجة مئوية في جو مرطب من 5٪ CO 2.
- الحفاظ على الثقافة التي subculturing الخلايا كل 5 إلى 7 أيام باستخدام إجراء trypsinization القياسية.
- معطف الآبار من أسفل، أسود واضح، لوحات 96-جيدا مع 50 ميكرولتر من بولي-L-يسين. السماح للآبار لتجف لمدة 30 دقيقة في الحاضنة.
- لوحة الخلايا في لوحات 96-جيدا تحتوي على 200 وسائل الاعلام ميكرولتر في كثافة من 30000 خلية لكل جيدا وتخزين الخلايا في الحاضنة لمدة 3-4 أيام.
- استخدام برنامج إعداد طموح، تتكون من جرة مقفول لتر 4 متصلة فراغ على نهاية واحدة و 200 رأس ماصة ميكرولتر في الطرف الآخر، لنضح ببطء وسيلة الثقافة من أحادي الطبقة الخلية.
- غسل الخلايا مع 200 ميكرولتر من حل العازلة العادي (كلوريد الصوديوم 132 مم، 5 مم بوكل، 1 مM CaCl 2، 1 ملم MgCl 2، 5 مم سكر العنب، HEPES 5 مم، ودرجة الحموضة 7.4 مع هيدروكسيد الصوديوم).
- إضافة 200 ميكرولتر من حل العازلة التي تحتوي على غشاء المحتملة حساسة للصبغ (MPD) DiBAC 4 (3) أو HLB 021-152 (5 ميكرومتر) على كل جيد واحتضان الخلايا لمدة 40 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
2. إعداد اختبار المركبات والعلاج بالخلايا
- يعد مسلسل تخفيف من المركبات اختبار (السهم = 10 ملم في DMSO) من مكتبة المجمع (في 96-جيدا الشكل) باستخدام (ThermoFisher) Versette النظام الآلي التعامل مع السائل.
- إزالة لوحة 96-جيدا، والتي تحتوي على خلايا AtT20، من الحاضنة، والسماح لوحة للعودة إلى درجة حرارة الغرفة. نضح قبالة العازلة القديمة وتطبيق حل جديد العازلة التي تحتوي على MPD إلى الخلايا.
- باستخدام نظام المناولة سائل تطبيق تركيزات مختلفة (10 نانومتر إلى 10 ميكرومتر) من مركبات الاختبار (2-20 ميكرولتر) وحلول التحكم (0.1٪ DMSO) (في containi حل العازلةنانوغرام في MPD) إلى لوحة تحتوي على 96-جيدا الخلايا.
- احتضان خلايا لمدة 5 دقائق مع مركبات اختبار قبل القياسات فلوري.
3. تفعيل قنوات GIRK، قياس وتحليل نيون
- إدراج لوحة 96-جيدا في قارئ Synergy2 Biotek لوحة فلوري والحصول على إشارة خلفية فلوري في موجات الإثارة وانبعاث 520 و 560 نانومتر، على التوالي.
- تطبيق يغاندس النوع من الاختزال (سوماتوستاتين = 200 نانومتر أو كرباكول ميكرومتر = 10) أو حل التحكم (العازلة وحده) (20 ميكرولتر) إلى آبار (الحجم الكلي = 220 ميكرولتر) لتنشيط قنوات GIRK باستخدام نظام حاقن Synergy2. جمع نقاط البيانات على فترات 10 ثانية على مدى فترة 300 ثانية أخذ العينات في موجات الإثارة وانبعاث 520 و 560 نانومتر، على التوالي.
- الحصول على مسار الزمن والسعة القصوى للتغيير فلوري باستخدام Biotek Gen5 البرمجيات وتصدير البيانات إلى Excel لمزيد من التحليل. حساب Z'عامل لتحديد موثوقية الفحص. الواردة لوحات تستخدم لتحديد Z'عامل 2 صفوف كل من الإيجابية (GPCR يجند) والسلبية الضوابط (العازلة وحدها). يتم تعريف Z'عامل على النحو التالي: Z '= 1 - (P + 3σ 3σ N) / | P μ - μ N |، حيث P & μ μ N هي الوسيلة للسيطرة الإيجابية والسلبية إشارات التحكم، وسيجما P & N سيجما هي الانحرافات المعيارية للسيطرة الإيجابية والسلبية إشارات التحكم، على التوالي 6. Z'-العوامل في نطاق 0،5-1،0 تشير إلى أن نوعية فحص ممتازة 6. وتستبعد لوحات مع عوامل-Z'أقل من 0.5 من التحليل.
- يتم اختبارها المركبات التي تعدل إشارة فلوري في وجود با 2 + أو tertiapin-Q للتأكد من الداخل المعدل K + قناة خصوصية.
4. Representative النتائج
ويرد مثالا للإشارة مضان تقاس باستخدام الفحص قناة GIRK في الشكل 2. تسبب إضافة السوماتوستاتين يجند النوع من الاختزال (200 نانومتر) إلى الخلايا AtT20 سريع، المعتمدة على الزمن انخفاض في إشارة 021-152 HLB فلوري (الشكل 2). في المقابل، أنتجت بالإضافة إلى ذلك من حل مراقبة ارتفاع صغير لحظية في مضان أنه مع مرور الوقت عاد إلى خط الأساس (الشكل 2). وقدم مقارنة بين القيم فلوري ذروته في 96-جيدا لوحات التحكم وحقن مع حلول السوماتوستاتين من العوامل Z'، في نطاق من 0.5 إلى 0.7. لمزيد من التحديد الكمي، وكان طرح في سجل مراقبة من السجل السوماتوستاتين وما نجم عنها من السوماتوستاتين حساسة للإشارة تحليلها (الشكل 2).
الفحص يوفر طريقة لتحديد بسرعة العقاقير التي تعدل القنوات GIRK. على سبيل المثال، الأدوية التي تمنع تشا GIRKوينبغي أن تقلل هذه العملية من يجند nnel بوساطة الانخفاضات في مضان من خلال منع هروب رأس المال K + من الخلايا. كما هو مبين في الشكل (3)، وعلاج الخلايا مع tertiapin-Q، وهو السم الذي يمنع القنوات GIRK 7، أنتجت تثبيط التغيير السوماتوستاتين بوساطة فلوري. Propafenone، وهو دواء لمكافحة عدم اتساق نبضات القلب الذي يمنع القنوات GIRK في قلب 8، منعت أيضا التغيير فلوري (الشكل 4). قد يكون من المفيد أيضا فحص للتعرف على المنشطات للقناة GIRK. ومع ذلك، تطبيق من الإيثانول (100 و 200 ملم)، وتسبب في المنشط للقناة GIRK 2،3، أي تغير ملموس في إشارة فلوري مقارنة للسيطرة على حل (P> 0.5).
الشكل 1. تصميم تجريبي لفحص قناة GIRK فلوري. يتم تحضين AtT20 الخلايا في العازلة التي تحتوي على membranه إمكانية حساسة للصبغة الفلورسنت (D). جزيئات الصبغة تدخل في الخلايا وتصبح فلوري على الربط إلى البروتينات داخل الخلايا (أعلى لوحة). ملزم من السوماتوستاتين (SOM) إلى النوع من الاختزال في يحفز البروتين المثبط جي (G ط) مما تسبب في تفعيل قناة GIRK (اللوحة السفلية). وهروب رأس المال لاحق من K + من الخلايا يتسبب في غشاء القدرة على أن تصبح أكثر سلبية وجزيئات صبغة للخروج من الخلايا. نتيجة لانخفاض إشارة فلوري (اللوحة السفلية).
الشكل 2. الممثل HLB 021-152 إشارة فلوري يقاس على مر الزمن في الخلايا AtT20 خلال إضافة السوماتوستاتين أو حل السيطرة. تم احتساب نسبة كثافة فلوري (F / F O) من خلال تقسيم إشارة في وجود (F) من السوماتوستاتين (أو حل التحكم) قبل إشارة أساسية يقاس قبل (F O) إعلانdition من السوماتوستاتين (أو حل التحكم). كل نقطة تمثل متوسط ± SE التي تم الحصول عليها في الآبار 5-6. أضيف السوماتوستاتين أو حل التحكم في وقت صفر (↓). بالإضافة إلى ذلك تسبب في حل سيطرة زيادة صغيرة عابرة في إشارة فلوري. نجم ذلك عن التغير في درجة الحرارة الناجمة عن حقن من الحل.
الشكل 3. معالجة الخلايا AtT20 مع tertiapin-Q (500 نانومتر) يحول دون نقصان السوماتوستاتين بوساطة في إشارة فلوري عن طريق الربط بين وسد قنوات GIRK. كل نقطة تمثل متوسط ± SE التي تم الحصول عليها في الآبار 4-6. وأضيف في وقت السوماتوستاتين صفر (↓).
الشكل 4. معالجة الخلايا AtT20 مع propafenone (20 ميكرون) يمنع أيضا من انخفاض السوماتوستاتين بوساطة فيإشارة فلوري. كل نقطة تمثل متوسط ± SE التي تم الحصول عليها في الآبار 5-6. وأضيف في وقت السوماتوستاتين صفر (↓).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في حين تم استخدام غشاء المحتملة التي تراعي الأصباغ الفلورية لتحديد العقاقير التي تعدل القنوات الأيونية 9،10، وهذا هو أول تقرير من طلباتهم للحصول على الخلايا العصبية GIRK اكتشاف المخدرات قناة. الفحص قناة GIRK فلوري المقدمة هنا يوفر طريقة سريعة وموثوقة وفي الوقت الحقيقي لفحص يجند بوابات قنوات + K. يمكن تعديل فحص للاستخدام مع مجموعة واسعة من الخلايا بما في ذلك خطوط الخلايا خلد (HEK293، شو، وغيرها) إبداء الخارجية المؤتلف GIRK قناة 11 أو خطوط الخلايا نسيلي (AtT20، PC-12) التعبير عن قناة الذاتية. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تكييفها لفحص الكشف عن المخدرات في الخلايا الجذعية الجنينية والثقافات الخلية الأولية. كما تستخدم مع الخلايا AtT20، وفحص كما يوفر فائدة إضافية للسماح للدراسة يغاندس النوع من الاختزال متعددة (سوماتوستاتين وكرباكول) على قناة GIRK. كما هو الحال مع أي فحص فلوري، لا بد من إجراء تجارب مراقبة إلى البريدliminate القطع الأثرية نظرا لتعقيد لصناعة السيارات في مضان وتحديد الأخطاء الناتجة من التفاعل المباشر للمركبات مع جزيئات الصبغة. وينبغي أيضا النهج البديل مثل فحص تدفق الثاليوم 11 و 12 آلية إجراء المشبك التصحيح ينبغي النظر فيها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل الصحة العامة في الولايات المتحدة جائزة الخدمة NS-071530.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Cellgro | 10-013 | |
| Horse serum | Invitrogen | 16050-114 | |
| 96-well plates | Corning | 3603 | |
| Poly-l-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| Somatostatin | Sigma-Aldrich | S9129 | |
| Carbachol | Sigma-Aldrich | C4382 | |
| HLB 021-152 | AnaSpec | 89300 | |
| Versette automated liquid handler | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 650-01 | |
| Synergy2 fluorescent plate reader | BioTek | ||
| Gen5 analysis software | BioTek | ||
| Table 1. Table of specific reagents and equipment. | |||
References
- Hibino, H. Inward rectifying potassium channels: their structure, function and physiological roles. Physiol. Rev. 90, 291-366 (2010).
- Lusscher, C., Slesinger, P. A. Emerging roles for G protein-gated inwardly rectifying potassium (GIRK) channels in health and disease. Nat. Rev. Neurosci. 11, 301-315 (2010).
- Kobayashi, T., Ikeda, K. G protein-activated inwardly rectifying potassium channels as potential therapeutic targets. Cur. Pharm. Des. 12, 4513-4523 (2006).
- Terstappen, G. C. Functional analysis of native and recombinant ion channels using a high-capacity nonradioactive rubidium efflux assay. Anal. Biochem. 272, 149-155 (1999).
- Cheng, C. S. A high-throughput HERG potassium channel function assay: an old assay with a new look. Drug Dev. Ind. Pharm. 28, 177-191 (2002).
- Zhang, J. -H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).
- Jin, W., Lu, Z. A novel high-affinity inhibitor for inward-rectifier K+ channels. Biochem. 37, 13291-13299 (1998).
- Inomata, N. Anti-arrhythmic agents act differently on the activation phase of the Ach-response in guinea pig atrial myocytes. Br. J. Pharmacol. 108, 111-116 (1993).
- Tang, W. Development and evaluation of high throughput functional assay methods for HERG potassium channel. J. Biomol. Screen. 6, 325-331 (2001).
- Wolff, C., Fuks, B., Chatelain, P. Comparative study of membrane potential-sensitive fluorescent probes and their use in ion channel screening assays. J. Biomol. Screen. 8, 533-513 (2003).
- Niswender, C. M., Johnson, K. A., Luo, Q., Avala, J. E., Kim, C., Conn, P. J., Weaver, C. D. A novel assay of Gi/o-linked G protein-coupled receptor coupling to potassium channels provides new insights into the pharmacology of group III metabotropic glutamate receptors. Mol. Pharm. 73, 1213-1224 (2008).
- Bridal, T. R., Marquilis, M., Wang, X., Donio, M., Sorota, S. Comparison of human Ether-á-go-go related gene screening assays based on IonWorks Quattro and thallium flux. Assay Drug Dev. Technol. 8, 755-765 (2010).
