Um ensaio de rastreio fluorescente para identificação Moduladores de Canais GIRK
Summary
Um procedimento de triagem em tempo real para identificação de drogas que interagem com a proteína G-gate dentro retificador K<sup> +</sup> (GIRK) canais é descrito. O ensaio utiliza potencial de membrana sensíveis corantes fluorescentes para medir GIRK actividade do canal. Esta técnica é adaptável para utilização num certo número de linhas celulares.
Abstract
Proteína G-gated para dentro do rectificador K + (GIRK) canais de funcionar como mediadores celulares de uma vasta gama de hormonas e neurotransmissores e são expressos no cérebro, coração, músculo esquelético e 1,2 tecido endócrino. Canais GIRK tornar-se activado após a ligação de ligandos (neurotransmissores, hormonas, fármacos, etc) para a sua plasma ligada à membrana, acoplados à proteína G (GPCRs receptores). Esta ligação faz com que a estimulação de proteínas G (G i e G o) que, subsequentemente, se ligar e activar o canal GIRK. Uma vez aberto o canal GIRK permite a circulação de K + para fora da célula fazendo com que a membrana em repouso potencial para se tornar mais negativo. Como conseqüência, GIRK ativação de canais em neurônios diminui a formação de potencial espontâneo de ação e inibe a liberação de neurotransmissores excitatórios. No coração, a activação do canal de GIRK inibe a actividade pacemaker assim abrandar o ritmo cardíaco.
<pclass = "" jove_content canais> GIRK representar novos alvos para o desenvolvimento de novos agentes terapêuticos para tratamento da dor neuropática, a toxicodependência, arritmias cardíacas e outros distúrbios 3. No entanto, a farmacologia destes canais permanece largamente inexplorado. Embora um número de drogas, incluindo agentes anti-arrítmicos, fármacos antipsicóticos e antidepressivos bloquear o canal GIRK, esta inibição não é seletivo e ocorre em concentrações relativamente elevadas de drogas 3.Aqui, descrevemos um teste de triagem em tempo real para identificar novos moduladores de canais GIRK. Neste ensaio, as células neuronais AtT20, expressando canais GIRK, são carregados com potencial de membrana sensíveis corantes fluorescentes, tais como bis-(1,3-dibutylbarbituric ácido) trimethine oxonol [DiBAC 4 (3)] ou HLB 021-152 (Figura 1 ). As moléculas de corante se fortemente fluorescente absorção seguinte para dentro das células (Figura 1). Tratamentodas células com ligandos GPCR estimula os canais GIRK para abrir. A resultante de K + de efluxo para fora da célula faz com que o potencial de membrana a tornar-se mais negativa e do sinal fluorescente para diminuir (Figura 1). Assim, as drogas que modulam a K + efluxo através do canal GIRK pode ser ensaiada utilizando um leitor de placa fluorescente. Ao contrário de outros íons ensaios canal de rastreio, espectrometria de absorção atômica, tais 4 ou análise radiotraçador 5, o canal fluorescente GIRK ensaio fornece um procedimento de triagem rápida, em tempo real e barato.
Protocol
Discussion
Enquanto potencial de membrana sensíveis corantes fluorescentes foram usados para identificar drogas que modulam canais iônicos 9,10, este é o primeiro relato de sua aplicação para neuronal GIRK droga Discovery Channel. O ensaio GIRK canal fluorescente apresentado aqui fornece um método rápido, confiável e em tempo real para o rastreamento de ligante fechadas canais de K +. O ensaio pode ser modificadas para utilização com uma vasta gama de células incluindo linhas de células imor…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelos EUA prémio Serviço Público de Saúde NS-071530.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| DMEM | CellGro | 10-013 |
| Horse serum | Invitrogen | 16050-114 |
| 96-well plates | Corning | 3603 |
| Poly-l-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 |
| Somatostatin | Sigma-Aldrich | S9129 |
| Carbachol | Sigma-Aldrich | C4382 |
| HLB 021-152 | AnaSpec | 89300 |
| Versette automated liquid handler | ThermoFisher | 650-01 |
| Synergy2 fluorescent plate reader | Biotek | |
| Gen5 analysis software | Biotek |
Table 1. Table of specific reagents and equipment.
References
- Hibino, H. Inward rectifying potassium channels: their structure, function and physiological roles. Physiol. Rev. 90, 291-366 (2010).
- Lusscher, C., Slesinger, P. A. Emerging roles for G protein-gated inwardly rectifying potassium (GIRK) channels in health and disease. Nat. Rev. Neurosci. 11, 301-315 (2010).
- Kobayashi, T., Ikeda, K. G protein-activated inwardly rectifying potassium channels as potential therapeutic targets. Cur. Pharm. Des. 12, 4513-4523 (2006).
- Terstappen, G. C. Functional analysis of native and recombinant ion channels using a high-capacity nonradioactive rubidium efflux assay. Anal. Biochem. 272, 149-155 (1999).
- Cheng, C. S. A high-throughput HERG potassium channel function assay: an old assay with a new look. Drug Dev. Ind. Pharm. 28, 177-191 (2002).
- Zhang, J. -. H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).
- Jin, W., Lu, Z. A novel high-affinity inhibitor for inward-rectifier K+ channels. Biochem. 37, 13291-13299 (1998).
- Inomata, N. Anti-arrhythmic agents act differently on the activation phase of the Ach-response in guinea pig atrial myocytes. Br. J. Pharmacol. 108, 111-116 (1993).
- Tang, W. Development and evaluation of high throughput functional assay methods for HERG potassium channel. J. Biomol. Screen. 6, 325-331 (2001).
- Wolff, C., Fuks, B., Chatelain, P. Comparative study of membrane potential-sensitive fluorescent probes and their use in ion channel screening assays. J. Biomol. Screen. 8, 533-513 (2003).
- Niswender, C. M., Johnson, K. A., Luo, Q., Avala, J. E., Kim, C., Conn, P. J., Weaver, C. D. A novel assay of Gi/o-linked G protein-coupled receptor coupling to potassium channels provides new insights into the pharmacology of group III metabotropic glutamate receptors. Mol. Pharm. 73, 1213-1224 (2008).
- Bridal, T. R., Marquilis, M., Wang, X., Donio, M., Sorota, S. Comparison of human Ether-á-go-go related gene screening assays based on IonWorks Quattro and thallium flux. Assay Drug Dev. Technol. 8, 755-765 (2010).
