Summary
En real-tid screening procedure til identifikation af lægemidler, der interagerer med G-protein-gated indad ensretter K
Abstract
G-protein-medierede aktiv ensretter K + (GIRK) kanaler fungerer som cellulære mediatorer af en lang række hormoner og neurotransmittere og udtrykkes i hjerne, hjerte, skeletmuskulatur og endokrine væv 1,2. GIRK kanaler bliver aktiveret, efter at bindingen af ligander (neurotransmittere, hormoner, lægemidler, etc.) til deres plasma membranbundet, G-proteinkoblede receptorer (GPCR'er). Denne binding forårsager stimulering af G-proteiner (G I og G o), som efterfølgende binde til og aktivere GIRK kanal. Efter åbning af GIRK kanalen tillader bevægelse af K + ud af cellen forårsager hvilende membranpotentiale at blive mere negativ. Som følge heraf aftager GIRK kanalaktivering i neuroner spontan virkningspotentialet dannelse og inhiberer frigivelsen af excitatoriske neurotransmittere. I hjertet, hæmmer aktivering af GIRK kanalen pacemakeren aktivitet og dermed bremse puls.
Her beskriver vi en real-time screeningsassay til identifikation af nye modulatorer af GIRK kanaler. I dette assay neuronale AtT20 celler, der udtrykker GIRK kanaler, fyldt med membranpotentialet-sensitive fluorescerende farvestoffer, såsom bis-(1,3-dibutylbarbituric syre) trimethine oxonol [DiBAC 4 (3)] eller HLB 021-152 (figur 1 ). Farvestofmolekylerne bliver stærkt fluorescerende følgende optagelse i cellerne (figur 1). Behandlingaf cellerne med GPCR-ligander stimulerer GIRK kanaler åbnes. Den resulterende K +-efflux ud af cellen får membranen kan blive mere negativ og det fluorescerende signal at falde (figur 1). Således kan lægemidler, som modulerer K +-efflux gennem GIRK kanalen kan analyseres under anvendelse af en fluorescerende pladelæser. I modsætning til andre ion-kanal screening assays, såsom Atomabsorptionsspektrometri 4 eller radiotracer analyse 5, giver GIRK kanalen fluorescenstest en hurtig, real-time og billig screening procedure.
Protocol
1. Fremstillinq af celler
- Vokser hypofyse AtT20 celler i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) suppleret med 10% hesteserum og opretholde kulturer ved 37 ° C i en befugtet atmosfære af 5% CO2.
- Fastholde den ved subkultivering cellerne hver 5 til 7 dage under anvendelse af en standard trypsinisering procedure.
- Coate brøndene i sorte, klarbundede, 96-brønds plader med 50 ul af poly-L-lysin. Tillader brøndene tørre i 30 minutter i inkubatoren.
- Pladen cellerne i 96-brønds plader indeholdende 200 ul medium ved tæthed på 30.000 celler per brønd og lagre cellerne i inkubatoren i 3-4 dage.
- Anvender en aspiration opsætning, der består af en tilproppet 4 liters forbundet til et vakuum på den ene ende og en 200 ul pipettespids ved den anden ende til langsomt aspirere dyrkningsmediet fra cellemonolaget.
- Vask cellerne med 200 pi af normal pufferopløsning (132 mM NaCI, 5 mM KCI, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 5 mM dextrose, 5 mM HEPES, pH 7,4 med NaOH).
- Tilsæt 200 pi pufferopløsning indeholdende membranpotentialet-følsomt farvestof (MPD) DiBAC 4 (3) eller HLB 021-152 (5 uM) til hver brønd og inkubere cellerne i 40 minutter ved 37 ° C.
2. Fremstilling af testforbindelser og cellebehandling
- Fremstilling af en seriel fortynding af testforbindelser (stamopløsning = 10 mM i DMSO) ud fra en forbindelse bibliotek (i 96-brønds format) under anvendelse af en Versette (ThermoFisher) automatiseret væskehåndteringssystem.
- Fjernelse af 96-brønds plade, der indeholder AtT20 celler fra inkubatoren og tillade pladen at vende tilbage til stuetemperatur. Aspirer ud gamle puffer og anvende frisk pufferopløsning indeholdende MPD til cellerne.
- Ved hjælp af væskehåndteringssystem anvende forskellige koncentrationer (10 nM til 10 uM) af testforbindelserne (2 til 20 uL) og kontrol opløsninger (0,1% DMSO) (i bufferopløsning containing MPD) til 96-brønds plade indeholdende cellerne.
- Inkubér cellerne i 5 minutter med testforbindelser før de fluorescerende målinger.
3. Aktivering af GIRK kanaler, Fluorescerende Måling og analyse
- Sæt 96-brønds plade i en Biotek Synergy2 fluorescerende pladelæser og opnå fluorescerende baggrund signal ved excitations-og emissionsbølgelængderne for 520 og 560 nm.
- Anvendelse af GPCR-ligander (somatostatin = 200 nM eller carbachol = 10 pM) eller kontrolopløsning (puffer alene) (20 ul) til brøndene (totalt volumen = 220 uL) til at aktivere GIRK kanalerne med Synergy2 injektorsystemet. Samle datapunkter på 10 s intervaller i løbet af en 300 s prøveudtagningsperiode ved excitations-og emissionsbølgelængderne for 520 og 560 nm.
- Hent den tidsforløb og spidsamplituden af fluorescerende ændringen hjælp Biotek Gen5 software og eksportere data til Excel til yderligere analyse. Beregne Z'-faktor til bestemmelse af pålideligheden af analysen. Pladerne anvendes til Z'-faktor bestemmelse indeholdt 2 rækker hver af positiv (GPCR-ligand) og negative (puffer alene) kontroller. Den Z'-faktoren er defineret som: Z '= 1 - (3σ P + 3σ N) / | μ P - μ N |, hvor μ P & μ N er midlerne til den positive kontrol og negativ kontrol signaler, og o P & σ n er standardafvigelser af positiv kontrol og negativ kontrol signaler, henholdsvis 6. Z'-faktorer i området fra 0,5 til 1,0 angiver, at kvaliteten af assayet er fremragende 6. Plader med Z'-faktorer under 0,5 er udelukket fra analysen.
- Forbindelser, som modulerer det fluorescerende signal gentestes i nærvær af Ba2 + eller tertiapin-Q for at bekræfte indad ensretter K +-kanal specificitet.
4. Representative Resultater
Et eksempel på fluorescenssignalet målt under anvendelse af GIRK kanalen assayet er vist i figur 2. Tilsætning af GPCR-ligand somatostatin (200 nM) til AtT20 cellerne forårsaget af en hurtig, tidsafhængig reduktion af HLB 021-152 fluorescenssignal (fig. 2). I modsætning hertil producerede tilsætning af kontrol opløsning lille øjeblikkelig stigning i fluorescens, som med tiden returneret til basislinien (figur 2). Sammenligning af peak fluorescerende værdier i 96-brønds plader injiceret med kontrol-og somatostatin opløsninger gav en Z'-faktorer i området fra 0,5 til 0,7. For yderligere kvantificering blev kontrolindgang subtraheres fra somatostatin record, og den resulterende somatostatin-følsomme signal analyseret (figur 2).
Assay tilvejebringer en fremgangsmåde til hurtigt at identificere lægemidler, som modulerer GIRK kanaler. For eksempel, at lægemidler hæmmer GIRK Channel bør reducere GPCR-ligand-medieret reduktion i fluorescens ved at forhindre K +-efflux fra cellerne. Som vist i figur 3, behandling af cellerne med tertiapin-Q, et toksin, der blokerer GIRK kanaler 7, der produceres en inhibering af somatostatin-medieret fluorescerende ændring. Propafenon, et anti-arytmisk lægemiddel, der blokerer GIRK kanaler i hjertet 8, inhiberede også fluorescerende ændring (figur 4). Assayet kan også være nyttige til identifikation aktivatorer af GIRK kanal. Men anvendelsen af ethanol (100 & 200 mM), forårsagede en aktivator af GIRK kanalen 2,3, ingen signifikant ændring i det fluorescerende signal, når sammenlignet med kontrol-opløsning (p> 0,5).
Figur 1. Eksperimentel udformning GIRK kanalen fluorescerende assay. AtT20 celler inkuberes i en buffer indeholdende en membrane potentielle-sensitive fluorescerende farvestof (D). Farvestofmolekylerne ind i cellerne og bliver fluorescerende ved binding til intracellulære proteiner (øverste panel). Binding af somatostatin (As) til dets GPCR stimulerer G-inhiberende protein (Gi) forårsager aktivering af GIRK kanalen (nederste panel). Den efterfølgende udstrømning af K + ud af cellerne får membranen kan blive mere negativ, og de farvestofmolekyler at forlade cellerne. Som et resultat det fluorescerende signal aftager (nederste panel).
Figur 2 Repræsentative HLB 021-152 fluorescerende signal målt over tid i AtT20 cellerne under tilsætning af somatostatin eller kontrolopløsning. Forholdet mellem fluorescensintensiteten (F / Fo) blev beregnet ved at dividere signalet i nærvær (F) af somatostatin (eller kontrol-opløsning) ved basislinie signal målt før (Fo) addition af somatostatin (eller kontrol-opløsning). Hvert punkt repræsenterer middelværdien ± SE opnået i 5-6 brønde. Somatostatin eller kontrol-opløsning blev tilsat til tiden nul (↓). Tilsætning af kontrolopløsningen forårsagede en lille transient stigning i fluorescenssignalet. Dette resulterede i en temperaturændring er forårsaget af injektion af opløsningen.
Figur 3. Behandling af AtT20 celler med tertiapin-Q (500 nM) inhiberer somatostatin-medieret reduktion i fluorescerende signal ved at binde til og blokere GIRK kanaler. Hvert punkt repræsenterer middelværdien ± SE opnået i 4-6 brønde. Somatostatin blev tilsat til tiden nul (↓).
Figur 4. Behandling af AtT20 celler med propafenon (20 uM) også inhiberer somatostatin-medieret reduktion idet fluorescerende signal. Hvert punkt repræsenterer middelværdien ± SE opnået i 5-6 brønde. Somatostatin blev tilsat til tiden nul (↓).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mens membran potentiale-følsomme fluorescerende farvestoffer er blevet brugt til at identificere stoffer, som modulerer ionkanaler 9,10, dette er den første rapport af deres ansøgning om neuronal GIRK kanal drug discovery. Den GIRK kanal fluorescenstest præsenteret her tilvejebringer en hurtig, pålidelig og real-time fremgangsmåde til screening af ligand-gatede K +-kanaler. Assayet kan modificeres til anvendelse med en lang række celler, herunder immortaliserede cellelinjer (HEK293, CHO, etc.), der udtrykker et exogent rekombinant GIRK kanal 11 eller klonale cellelinier (AtT20, PC-12), der udtrykker en endogen kanal. Desuden kan assayet være indrettet til screening af lægemidler i embryonale stamceller og primære cellekulturer. Som anvendt med AtT20 celler assayet også den ekstra fordel at tillade undersøgelsen af multiple GPCR-ligander (somatostatin og carbachol) på GIRK kanalen. Som med enhver fluorescenstest skal kontroleksperimenter udføres for at eliminate artefakter som følge af sammensatte autofluorescens og til at identificere fejl som følge af direkte interaktioner af forbindelserne med farvestofmolekyler. Alternative tilgange såsom thallium tilstrømningen analysen 11 og automatiserede patch clamp procedure 12 bør også overvejes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af US Public Health Service pris NS-071.530.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Cellgro | 10-013 | |
| Horse serum | Invitrogen | 16050-114 | |
| 96-well plates | Corning | 3603 | |
| Poly-l-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| Somatostatin | Sigma-Aldrich | S9129 | |
| Carbachol | Sigma-Aldrich | C4382 | |
| HLB 021-152 | AnaSpec | 89300 | |
| Versette automated liquid handler | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 650-01 | |
| Synergy2 fluorescent plate reader | BioTek | ||
| Gen5 analysis software | BioTek | ||
| Table 1. Table of specific reagents and equipment. | |||
References
- Hibino, H. Inward rectifying potassium channels: their structure, function and physiological roles. Physiol. Rev. 90, 291-366 (2010).
- Lusscher, C., Slesinger, P. A. Emerging roles for G protein-gated inwardly rectifying potassium (GIRK) channels in health and disease. Nat. Rev. Neurosci. 11, 301-315 (2010).
- Kobayashi, T., Ikeda, K. G protein-activated inwardly rectifying potassium channels as potential therapeutic targets. Cur. Pharm. Des. 12, 4513-4523 (2006).
- Terstappen, G. C. Functional analysis of native and recombinant ion channels using a high-capacity nonradioactive rubidium efflux assay. Anal. Biochem. 272, 149-155 (1999).
- Cheng, C. S. A high-throughput HERG potassium channel function assay: an old assay with a new look. Drug Dev. Ind. Pharm. 28, 177-191 (2002).
- Zhang, J. -H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).
- Jin, W., Lu, Z. A novel high-affinity inhibitor for inward-rectifier K+ channels. Biochem. 37, 13291-13299 (1998).
- Inomata, N. Anti-arrhythmic agents act differently on the activation phase of the Ach-response in guinea pig atrial myocytes. Br. J. Pharmacol. 108, 111-116 (1993).
- Tang, W. Development and evaluation of high throughput functional assay methods for HERG potassium channel. J. Biomol. Screen. 6, 325-331 (2001).
- Wolff, C., Fuks, B., Chatelain, P. Comparative study of membrane potential-sensitive fluorescent probes and their use in ion channel screening assays. J. Biomol. Screen. 8, 533-513 (2003).
- Niswender, C. M., Johnson, K. A., Luo, Q., Avala, J. E., Kim, C., Conn, P. J., Weaver, C. D. A novel assay of Gi/o-linked G protein-coupled receptor coupling to potassium channels provides new insights into the pharmacology of group III metabotropic glutamate receptors. Mol. Pharm. 73, 1213-1224 (2008).
- Bridal, T. R., Marquilis, M., Wang, X., Donio, M., Sorota, S. Comparison of human Ether-á-go-go related gene screening assays based on IonWorks Quattro and thallium flux. Assay Drug Dev. Technol. 8, 755-765 (2010).
