Summary
В режиме реального времени процедура скрининга для выявления наркотиков, которые взаимодействуют с G белком закрытый внутренний выпрямитель K
Abstract
G белка закрытого внутреннего выпрямителя K + (GIRK) каналы работают, как сотовые посредников широкий спектр гормонов и нейромедиаторов и выражаются в головной мозг, сердце, скелетные мышцы и 1,2 эндокринной ткани. GIRK каналы активируются после связывания лигандов (нейромедиаторов, гормонов, лекарств и т.д.), их плазма мембраной, G-белком рецепторы (GPCR). Это связывание приводит к стимуляции G белка (G я и G о), которая впоследствии связывать и активировать канал GIRK. После открытия канала GIRK позволяет движение К + из клетки вызывает покоя мембранный потенциал, чтобы стать более отрицательным. Как следствие, GIRK канала активации нейронов уменьшается спонтанное формирование потенциала действия и ингибирует высвобождение возбуждающих нейротрансмиттеров. В сердце активации канала GIRK ингибирует активность водителя ритма, замедляя тем самым частоту сердечных сокращений.
Здесь мы описываем в режиме реального времени скрининге для выявления новых модуляторов каналов GIRK. В данном анализе нейронов AtT20 клетки, выражая GIRK каналы, которые загружаются с мембранный потенциал-чувствительные флуоресцентные красители, такие как бис-(1,3-dibutylbarbituric кислота) trimethine oxonol [DiBAC 4 (3)] или HLB 021-152 (рис. 1 ). Молекул красителя стало сильно люминесцентные следующие поступления в клетки (рис. 1). Лечениеклеток с лигандами GPCR стимулирует GIRK каналы, чтобы открыть. В результате отток K + из клетки приводит к тому, мембранный потенциал, чтобы стать более отрицательным и флуоресцентного сигнала уменьшается (рис. 1). Таким образом, препараты, которые модулируют K + истечение через канал GIRK могут быть проанализированы помощью флуоресцентных планшетов. В отличие от других ионных каналов скрининга, например атомно-абсорбционной спектрометрии 4 или радиоактивный анализ 5 канал GIRK флуоресцентного анализа позволяет быстро, в режиме реального времени и недорогая процедура отбора.
Protocol
1. Подготовка клетки
- Рост клеток гипофиза AtT20 в среде Дульбекко изменения Орла (DMEM) с добавлением 10% лошадиной сыворотки и поддерживать культуру при температуре 37 ° C во влажной атмосфере 5% CO 2.
- Поддерживать культуру пересева клеток каждые 5 до 7 дней, используя стандартную процедуру трипсинизации.
- Пальто скважин черный, прозрачное дно, 96-луночных планшетах с 50 мкл поли-L-лизин. Позвольте скважин высохнуть в течение 30 мин в инкубаторе.
- Пластина клеток в 96-луночных планшетах, содержащих 200 мкл среды при плотности 30000 клеток на лунку и хранения клеток в инкубаторе в течение 3-4 дней.
- Используйте стремление установка, состоящая из пробкой 4 литра банка связано с вакуумом на одном конце и 200 мкл кончиком пипетки на другом конце, медленно вдохнуть питательной среде из клеток монослоя.
- Промойте клетки с 200 мкл буферного раствора нормальной (132 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 1 мМ CaCl 2, 1 мМ MgCl2, 5 мМ глюкозы, 5 мМ HEPES, рН 7,4 с NaOH).
- Добавить 200 мкл буферного раствора, содержащего мембранный потенциал-чувствительного красителя (MPD) DiBAC 4 (3) или HLB 021-152 (5 мкм) в каждую лунку и инкубировать клетки в течение 40 мин при 37 ° C.
2. Подготовка испытания соединений и клеточной лечение
- Подготовка серийного разведения тестируемых соединений (акций = 10 мм в ДМСО) из соединения библиотеки (в 96-луночного формата) с помощью Versette (ThermoFisher) автоматизированные системы обработки жидкости.
- Удалите 96-луночного планшета, содержащие AtT20 клетки, из инкубатора и позволяет пластины до комнатной температуры. Аспирируйте от старого буфера и применять свежий буферный раствор содержащий MPD к клеткам.
- Использование жидкостной системы обработки применяют различные концентрации (10 нм до 10 мкм) исследуемых соединений (от 2 до 20 мкл) и контроля решений (0,1% ДМСО) (в буферном растворе containiнг ПДС) в 96-луночного планшета содержащих клетки.
- Инкубируйте клетки в течение 5 минут с тест соединения до флуоресцентных измерений.
3. Активация каналов GIRK, флуоресцентные измерения и анализа
- Вставьте 96-луночного планшета в Биотек Synergy2 люминесцентные планшетов и получить флуоресцентный сигнал на фоне возбуждения и излучения длиной волны 520 и 560 нм соответственно.
- Примените GPCR лигандами (соматостатин = 200 нм или карбахолина = 10 мкм) или контрольный раствор (буферный только) (20 мкл) в лунки (общим объемом = 220 мкл), чтобы активировать GIRK каналов с использованием системы Synergy2 инжектора. Сбор данных указывает на 10 с интервалами в течение 300 с периодом выборки на возбуждение и излучение длиной волны 520 и 560 нм соответственно.
- Получить ходе времени и пиковой амплитуды изменений с помощью флуоресцентных Биотек Gen5 программного обеспечения и экспорта данных в Excel для дальнейшего анализа. Вычислить Z 'фактора для определения достоверности анализа. Плиты используются для Z '-фактора содержит 2 строки каждой из положительных (ХВГФ лигандов) и отрицательные (буфер в одиночку) управления. Z '-фактора определяется по формуле: Z = 1 - (P + 3σ 3σ N) / | μ P - μ N |, где μ P & N μ являются средством положительного контроля и отрицательные сигналы управления, и о P & N а стандартные отклонения положительного контроля и отрицательные сигналы управления, соответственно, 6. Z '-факторов в диапазоне от 0.5 до 1.0 показывают, что качество анализа отлично 6. Плиты с Z 'фактора ниже 0,5 исключены из анализа.
- Соединений, которые модулируют флуоресцентных сигналов повторно в присутствии Ba 2 + или tertiapin-Q для подтверждения внутрь выпрямитель К + каналов специфику.
4. RРезультаты epresentative
Пример сигнала флуоресценции измеряли с помощью анализа GIRK канал показано на рисунке 2. Добавление соматостатин GPCR лиганда (200 нМ) в AtT20 клеток привела к быстрому, зависящих от времени снижение HLB 021-152 флуоресцентного сигнала (рис. 2). В отличие от того контрольного раствора производится небольшой мгновенный рост флуоресценции, что со временем вернулись к исходным (рис. 2). Сравнение пик люминесцентные значения в 96-луночных вводят контроль и соматостатин решения дали Z '-факторов в диапазоне от 0,5 до 0,7. Для дальнейшего количественного контроля рекорд был вычтен из соматостатина записи и, как следствие соматостатин-чувствительный сигнал анализируется (рис. 2).
Анализ представляет собой метод для быстрого выявления препаратов, которые модулируют GIRK каналов. Например, препараты, которые подавляют GIRK чаnnel должны уменьшить GPCR лиганд-опосредованного уменьшением флуоресценции, предотвращая отток К + из клеток. Как показано на рисунке 3, обработки клеток с tertiapin-Q, токсин, который блокирует GIRK каналы 7, производится торможение соматостатин-опосредованной флуоресцентные изменения. При длительном приеме, антиаритмического препарата, который блокирует GIRK каналов в сердце 8, также ингибирует флуоресцентные изменения (рис. 4). Анализ также может быть полезным для выявления возбудителей канала GIRK. Тем не менее, применение этанола (100 и 200 мм), активатор GIRK канала 2,3, не вызывает значительных изменений в флуоресцентного сигнала по сравнению с контрольным раствором (р> 0,5).
Рисунок 1. Экспериментальный дизайн GIRK канала флуоресцентного анализа. AtT20 клетки инкубировали в буфере, содержащем мембранэлектронной потенциально чувствительны флуоресцентного красителя (D). Молекул красителя входят в клетки и стал флуоресцентный при связывании с внутриклеточными белками (верхняя панель). Связывание соматостатина (сом) его GPCR стимулирует G белка тормозные (G я), вызывающий активацию GIRK канал (нижняя панель). Последующий отток К + из клеток приводит к тому, мембранный потенциал, чтобы стать более отрицательным и молекул красителя, чтобы выйти из клетки. В результате флуоресцентный сигнал уменьшается (нижняя панель).
Рисунок 2. Представителю HLB 021-152 флуоресцентного сигнала измеряется с течением времени в AtT20 клеток при добавлении соматостатина или контрольного раствора. Отношение интенсивности флуоресценции (F / O) рассчитывается путем деления сигнала в присутствии (F) соматостатина (или контрольный раствор) по базовым измеряемого сигнала до (F O) объявлениеусловием соматостатина (или контрольный раствор). Каждая точка представляет среднее ± SE, полученные в 5-6 скважин. Соматостатина или контрольный раствор был добавлен в нулевой момент времени (↓). Добавление контроль решение вызвало небольшое кратковременное повышение флуоресцентного сигнала. Это стало результатом изменения температуры вызвано введением раствора.
Рисунок 3. Лечение AtT20 клеток tertiapin-Q (500 нМ) ингибирует соматостатин-опосредованного снижения флуоресцентного сигнала путем связывания и блокировки GIRK каналов. Каждая точка представляет среднее ± SE, полученные в 4-6 скважин. Соматостатина был добавлен в нулевой момент времени (↓).
Рисунок 4. Лечение AtT20 клеток пропафенон (20 мкм) также ингибирует соматостатин-опосредованной снижениемфлуоресцентного сигнала. Каждая точка представляет среднее ± SE, полученные в 5-6 скважин. Соматостатина был добавлен в нулевой момент времени (↓).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В то время как мембранный потенциал-чувствительные флуоресцентные красители были использованы для идентификации препаратов, которые модулируют ионных каналов 9,10, это первый доклад их применения для нейронов GIRK канал лекарственных препаратов. GIRK канала флуоресцентного анализа, представленные здесь обеспечивает быстрое, надежное и в режиме реального времени метод для скрининга лигандов закрытого К + каналов. Анализ может быть модифицирована для использования с широким спектром клеток, включая клетки увековечены линий (HEK293, углеводов и т.д.), выражающая экзогенного рекомбинантного GIRK канала 11 или клональных клеточных линий (AtT20, PC-12), выражающая эндогенных канала. Кроме того, анализ может быть адаптирована для скрининга лекарств в эмбриональных стволовых клеток и первичных клеточных культурах. Как использовать с AtT20 клетки, анализ также предоставляет дополнительные блага, позволяющих изучать несколько лигандов ХВГФ (соматостатин и карбахолина) на канале GIRK. Как и в любой флуоресцентный анализ, контрольные эксперименты должны проводиться в электроннойliminate артефактов благодаря соединению авто-и флуоресценции для выявления ошибок в результате прямого взаимодействия соединений с молекулами красителя. Альтернативные подходы, такие как таллий анализа приток 11 и автоматизированных патч зажим процедуры 12 также должны быть рассмотрены.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана США Public Health Service награды NS-071 530.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Cellgro | 10-013 | |
| Horse serum | Invitrogen | 16050-114 | |
| 96-well plates | Corning | 3603 | |
| Poly-l-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| Somatostatin | Sigma-Aldrich | S9129 | |
| Carbachol | Sigma-Aldrich | C4382 | |
| HLB 021-152 | AnaSpec | 89300 | |
| Versette automated liquid handler | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 650-01 | |
| Synergy2 fluorescent plate reader | BioTek | ||
| Gen5 analysis software | BioTek | ||
| Table 1. Table of specific reagents and equipment. | |||
References
- Hibino, H. Inward rectifying potassium channels: their structure, function and physiological roles. Physiol. Rev. 90, 291-366 (2010).
- Lusscher, C., Slesinger, P. A. Emerging roles for G protein-gated inwardly rectifying potassium (GIRK) channels in health and disease. Nat. Rev. Neurosci. 11, 301-315 (2010).
- Kobayashi, T., Ikeda, K. G protein-activated inwardly rectifying potassium channels as potential therapeutic targets. Cur. Pharm. Des. 12, 4513-4523 (2006).
- Terstappen, G. C. Functional analysis of native and recombinant ion channels using a high-capacity nonradioactive rubidium efflux assay. Anal. Biochem. 272, 149-155 (1999).
- Cheng, C. S. A high-throughput HERG potassium channel function assay: an old assay with a new look. Drug Dev. Ind. Pharm. 28, 177-191 (2002).
- Zhang, J. -H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).
- Jin, W., Lu, Z. A novel high-affinity inhibitor for inward-rectifier K+ channels. Biochem. 37, 13291-13299 (1998).
- Inomata, N. Anti-arrhythmic agents act differently on the activation phase of the Ach-response in guinea pig atrial myocytes. Br. J. Pharmacol. 108, 111-116 (1993).
- Tang, W. Development and evaluation of high throughput functional assay methods for HERG potassium channel. J. Biomol. Screen. 6, 325-331 (2001).
- Wolff, C., Fuks, B., Chatelain, P. Comparative study of membrane potential-sensitive fluorescent probes and their use in ion channel screening assays. J. Biomol. Screen. 8, 533-513 (2003).
- Niswender, C. M., Johnson, K. A., Luo, Q., Avala, J. E., Kim, C., Conn, P. J., Weaver, C. D. A novel assay of Gi/o-linked G protein-coupled receptor coupling to potassium channels provides new insights into the pharmacology of group III metabotropic glutamate receptors. Mol. Pharm. 73, 1213-1224 (2008).
- Bridal, T. R., Marquilis, M., Wang, X., Donio, M., Sorota, S. Comparison of human Ether-á-go-go related gene screening assays based on IonWorks Quattro and thallium flux. Assay Drug Dev. Technol. 8, 755-765 (2010).
