Summary
Een real-time screening procedure voor het identificeren van geneesmiddelen die een interactie met G-eiwit-gated naar binnen gelijkrichter K
Abstract
G-eiwit-gated naar binnen gelijkrichter K + (GIRK) kanalen functioneren als cellulaire mediatoren van een breed scala van hormonen en neurotransmitters en worden uitgedrukt in de hersenen, het hart, de skeletspieren en endocriene weefsel 1,2. GIRK kanalen worden geactiveerd na de binding van liganden (neurotransmitters, hormonen, drugs, enz.) om hun plasma-membraan-gebonden, G-eiwit-gekoppelde receptoren (GPCR's). Deze binding veroorzaakt de stimulatie van G-eiwitten (G i G en o), dat vervolgens binden en activeren GIRK kanaal. Eenmaal geopend de GIRK kanaal maakt het mogelijk de beweging van K + uit de cel, waardoor de rust membraanpotentiaal om meer negatief. Bijgevolg GIRK kanaal activering in neuronen afneemt spontane vorming van actiepotentiaal en remt de afgifte van neurotransmittoren. In het hart, de activering van de GIRK kanaal remt pacemaker-activiteit waardoor het vertragen van de hartslag.
We beschrijven hier een real-time screening test voor het identificeren van nieuwe modulatoren van GIRK kanalen. In deze assay worden neuronale AtT20 cellen tot expressie GIRK kanalen geladen membraan potentiaal gevoelige fluorescerende kleurstoffen zoals bis-(1,3-dibutylbarbituric zuur) trimethine-oxonol [DiBAC 4 (3)] of HLB 021-152 (figuur 1 ). De kleurstofmoleculen wordt sterk fluorescerend volgende opname in de cellen (Figuur 1). Behandelingvan de cellen met GPCR liganden stimuleert GIRK kanalen te openen. De resulterende K + efflux de cel veroorzaakt het membraan mogelijk om meer negatieve en het fluorescentiesignaal dalen (figuur 1). Zo kunnen medicijnen die K + efflux moduleren door het GIRK kanaal worden getest met behulp van een fluorescerende plaat lezer. In tegenstelling tot andere ionkanaal screeningstesten, zoals atomaire absorptiespectrometrie 4 of radiotracer analyse 5, de GIRK kanaal fluorescentie biedt een snelle, real-time en goedkope screening procedure.
Protocol
1. Voorbereiding van de Cellen
- Groei hypofyse AtT20 cellen in Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) aangevuld met 10% paardenserum en handhaven culturen 37 ° C in een vochtige atmosfeer van 5% CO2.
- Handhaving van de cultuur door een subcultuur van de cellen om de 5 tot 7 dagen met een standaard behandeling met trypsine procedure.
- Smeer de putjes zwart, duidelijke bottom 96-wells platen met 50 ul van poly-L-lysine. Laat de putten drogen gedurende 30 min in de incubator.
- Plaat de cellen in de 96-well platen met 200 pi media dichtheid van 30.000 cellen per putje en slaan de cellen in de incubator gedurende 3-4 dagen.
- Gebruik een streven installatie bestaande uit een gesloten 4 liter beker verbonden met een vacuum aan een uiteinde en 200 ul pipet op het andere uiteinde aan het kweekmedium langzaam zuigen van de celmonolaag.
- Was de cellen met 200 pi normaalzoutoplossing bufferoplossing (132 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 5 mM glucose, 5 mM HEPES, pH 7,4 met NaOH).
- Voeg 200 ul van een bufferoplossing met de membraanpotentiaal-gevoelige kleurstof (MPD) DiBAC 4 (3) of HLB 021-152 (5 pM) aan elk putje en incuberen van de cellen gedurende 40 min bij 37 ° C.
2. Voorbereiding van testverbindingen en Cell behandeling
- Bereid een seriële verdunning van proefverbindingen (voorraad = 10 mM in DMSO) van een verbinding bibliotheek (in 96-well formaat) met een Versette (ThermoFisher) geautomatiseerde vloeistof handlingsysteem.
- Verwijder de 96-wells plaat, die de AtT20 cellen, uit het incubator en laat de plaat op kamertemperatuur. Zuig de oude buffer en toegepast verse buffer oplossing met de MPD van de cellen.
- De vloeistof behandeling toe te passen verschillende concentraties (10 nM tot 10 uM) van de proefverbindingen (2 tot 20 pi) en controle-oplossingen (0,1% DMSO) (in bufferoplossing containing van de MPD) van de 96-wells plaat met de cellen.
- Incubeer de cellen gedurende 5 min met proefverbindingen voor de fluorescerende metingen.
3. Activering van GIRK kanalen, TL Metingen en Analyse
- Plaats de 96-wells plaat in een Biotek Synergy2 fluorescerende plaat lezer en het verkrijgen van de fluorescerende achtergrond signaal op excitatie en emissie golflengtes van 520 en 560 nm, respectievelijk.
- Breng de GPCR liganden (somatostatine = 200 nM of carbachol = 10 uM) of controle-oplossing (buffer alleen) (20 pi) aan de gootjes (totaal volume 220 pi =) aan de GIRK kanalen met de injector Synergy2 activeren. Verzamel gegevens wijst op 10 s intervallen van meer dan 300 s bemonstering periode bij excitatie en emissie golflengtes van 520 en 560 nm, respectievelijk.
- Haal het tijdsverloop en de piek amplitude van de tl-verandering met behulp van Biotek Gen5 software en de gegevens exporteren naar Excel voor verdere analyse. Bereken de z'-factor van de betrouwbaarheid van de bepaling bepalen. Platen voor z'-factor bepaling bevatte 2 rijen van elk van positieve (GPCR-ligand) en negatieve (buffer alleen) controles. De z'-factor is gedefinieerd als: Z '= 1 - (3σ P + 3σ N) / | μ P - μ N |, waar μ P & μ N zijn de middelen van de positieve en negatieve signalen, en a P & σ N zijn de standaarddeviaties van de positieve en negatieve signalen, respectievelijk 6. Z'-elementen in het bereik van 0,5 tot 1,0 te geven dat de kwaliteit van de test is uitstekend 6. Platen met z'-factoren lager dan 0,5 zijn uitgesloten van de analyse.
- Verbindingen die het fluorescentiesignaal moduleren worden getest in de aanwezigheid van Ba2 + en tertiapin-Q naar binnen gelijkrichter K + kanaal specificiteit te bevestigen.
4. Representative resultaten
Een voorbeeld van de fluorescentiepiek gemeten met de GIRK kanaal assay in figuur 2. Toevoeging van de GPCR ligand somatostatine (200 nM) de AtT20 cellen veroorzaakten een snelle, tijdsafhankelijke afname van de HLB 021-152 fluorescentiesignaal (figuur 2). Daarentegen Bovendien controleoplossing tot een kleine momentane stijging van de fluorescentie met de tijd weer de uitgangssituatie (figuur 2). Vergelijking van piek fluorescerende waarden in 96-well platen geïnjecteerd met controle en somatostatine oplossingen een z'-elementen in het bereik van 0,5 gaf 0,7. Voor verdere kwantificering werd controleplan afgetrokken somatostatine plaat en de resulterende somatostatine-gevoelige signaal geanalyseerd (Figuur 2).
De test verschaft een werkwijze voor het identificeren van geneesmiddelen die snel GIRK kanalen moduleren. Bijvoorbeeld, geneesmiddelen die de GIRK cha remmennnel moet verminderen GPCR-ligand-gemedieerde afname van de fluorescentie door het voorkomen van K + efflux uit de cellen. Zoals getoond in figuur 3, de cellen behandeld met tertiapin-Q, een toxine die blokken GIRK kanalen 7 een remming van de somatostatine-gemedieerde fluorescerende verandering geproduceerd. Propafenon een anti-aritmische geneesmiddelen die blokken GIRK kanalen in het hart 8 ook de fluorescerende verandering (figuur 4) onderdrukt. De test kan ook nuttig voor het identificeren van de activatoren GIRK kanaal. De toepassing van ethanol (100 en 200 mM) een activator van het kanaal GIRK 2,3 veroorzaakt geen significante verandering in het fluorescentiesignaal vergeleken met (p> 0,5) gebruikt.
Figuur 1. Experimentele ontwerp van de GIRK kanaal fluorescentie. AtT20 cellen geïncubeerd in een buffer met een membraame potentiaal gevoelige fluorescerende kleurstof (D). De kleurstofmoleculen gaan de cellen en worden fluorescerend bij binding aan intracellulaire proteïnes (boven). Binding van somatostatine (Som) zijn GPCR stimuleert G remmende eiwit (G i), waardoor de activatie van de GIRK kanaal (onder). De daaropvolgende uitstroom van K + uit de cellen leidt het membraan mogelijk om meer negatief de kleurstofmoleculen de cellen af te sluiten. Als gevolg hiervan fluorescentiesignaal afneemt (onder).
Figuur 2. Vertegenwoordiger van HLB 021-152 fluorescerende signaal gemeten over de tijd in de AtT20 cellen tijdens toevoeging van somatostatine of controle oplossing. De verhouding van de fluorescentie-intensiteit (F / V O) werd berekend door het signaal in de aanwezigheid (F) van somatostatine (of controle-oplossing) van de basislijn gemeten signaal vóór (F O) addition van somatostatine (of controle oplossing). Elk punt staat voor het gemiddelde ± SE verkregen in 5-6 putjes. Somatostatine of controle oplossing werd toegevoegd op tijdstip nul (↓). Toevoeging van de controle-oplossing veroorzaakt slechts een kleine toename van het fluorescentiesignaal. Dit resultaat van een temperatuursverandering door injectie van de oplossing.
Figuur 3. Behandeling van de cellen met AtT20 tertiapin-Q (500 nM) remt de somatostatine-gemedieerde afname in het fluorescentiesignaal door binding en blokkeren GIRK kanalen. Elk punt staat voor het gemiddelde ± SE verkregen in 4-6 putjes. Somatostatine werd toegevoegd op tijdstip nul (↓).
Figuur 4. Behandeling van de cellen met AtT20 propafenon (20 uM) remt eveneens de somatostatine-gemedieerde afnamehet fluorescentiesignaal. Elk punt staat voor het gemiddelde ± SE verkregen in 5-6 putjes. Somatostatine werd toegevoegd op tijdstip nul (↓).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Terwijl de membraanpotentiaal-gevoelige fluorescente kleurstoffen zijn gebruikt om medicijnen die ionkanalen moduleren 9,10 te identificeren, dit is het eerste verslag van hun aanvraag voor neuronale GIRK kanaal drug discovery. De GIRK kanaal fluorescentie hier gepresenteerde biedt een snelle, betrouwbare en real-time methode voor de screening van ligand-gated K + kanalen. De test kan worden aangepast voor gebruik met een groot aantal cellen inclusief geïmmortaliseerde cellijnen (HEK293, CHO, enz.) die een exogeen recombinant GIRK kanaal 11 of klonale cellijnen (AtT20, PC-12) die een endogeen kanaal. Bovendien kan de test worden aangepast voor het screenen van geneesmiddelen in embryonale stamcellen en primaire celculturen. Zoals gebruikt bij de AtT20 cellen de test biedt ook het extra voordeel dat het onderzoek van meerdere GPCR liganden (somatostatine en carbachol) op de GIRK kanaal. Zoals bij elke fluorescentie moet controle-experimenten uitgevoerd om eliminate artefacten door automatische fluorescentie samengestelde en fouten door directe interactie van de verbindingen met de kleurstof moleculen te identificeren. Alternatieve benaderingen zoals het thallium instroom test 11 en geautomatiseerd patch-clamp procedure 12 moet ook worden overwogen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de US Public Health Service Award NS-071530.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Cellgro | 10-013 | |
| Horse serum | Invitrogen | 16050-114 | |
| 96-well plates | Corning | 3603 | |
| Poly-l-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| Somatostatin | Sigma-Aldrich | S9129 | |
| Carbachol | Sigma-Aldrich | C4382 | |
| HLB 021-152 | AnaSpec | 89300 | |
| Versette automated liquid handler | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 650-01 | |
| Synergy2 fluorescent plate reader | BioTek | ||
| Gen5 analysis software | BioTek | ||
| Table 1. Table of specific reagents and equipment. | |||
References
- Hibino, H. Inward rectifying potassium channels: their structure, function and physiological roles. Physiol. Rev. 90, 291-366 (2010).
- Lusscher, C., Slesinger, P. A. Emerging roles for G protein-gated inwardly rectifying potassium (GIRK) channels in health and disease. Nat. Rev. Neurosci. 11, 301-315 (2010).
- Kobayashi, T., Ikeda, K. G protein-activated inwardly rectifying potassium channels as potential therapeutic targets. Cur. Pharm. Des. 12, 4513-4523 (2006).
- Terstappen, G. C. Functional analysis of native and recombinant ion channels using a high-capacity nonradioactive rubidium efflux assay. Anal. Biochem. 272, 149-155 (1999).
- Cheng, C. S. A high-throughput HERG potassium channel function assay: an old assay with a new look. Drug Dev. Ind. Pharm. 28, 177-191 (2002).
- Zhang, J. -H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).
- Jin, W., Lu, Z. A novel high-affinity inhibitor for inward-rectifier K+ channels. Biochem. 37, 13291-13299 (1998).
- Inomata, N. Anti-arrhythmic agents act differently on the activation phase of the Ach-response in guinea pig atrial myocytes. Br. J. Pharmacol. 108, 111-116 (1993).
- Tang, W. Development and evaluation of high throughput functional assay methods for HERG potassium channel. J. Biomol. Screen. 6, 325-331 (2001).
- Wolff, C., Fuks, B., Chatelain, P. Comparative study of membrane potential-sensitive fluorescent probes and their use in ion channel screening assays. J. Biomol. Screen. 8, 533-513 (2003).
- Niswender, C. M., Johnson, K. A., Luo, Q., Avala, J. E., Kim, C., Conn, P. J., Weaver, C. D. A novel assay of Gi/o-linked G protein-coupled receptor coupling to potassium channels provides new insights into the pharmacology of group III metabotropic glutamate receptors. Mol. Pharm. 73, 1213-1224 (2008).
- Bridal, T. R., Marquilis, M., Wang, X., Donio, M., Sorota, S. Comparison of human Ether-á-go-go related gene screening assays based on IonWorks Quattro and thallium flux. Assay Drug Dev. Technol. 8, 755-765 (2010).
