Summary
בזמן אמת ההקרנה הליך לזיהוי סמים כי אינטראקציה עם חלבון G-מגודרת פנימה מיישר K
Abstract
G-חלבון סגורות פנימה מיישר K + (GIRK) ערוצים לתפקד כמתווכים הסלולר של מגוון רחב של הורמונים נוירוטרנסמיטורים באים לידי ביטוי השרירים, המוח, הלב ורקמות שלד 1,2 האנדוקרינית. ערוצי GIRK להיות מופעל בעקבות עקידת ligands (נוירוטרנסמיטורים, הורמונים, תרופות וכו ') כדי פלזמה שלהם קרום הנכנס, G חלבונים מצמידים קולטנים (GPCRs). מחייב זה גורם לגירוי של חלבונים G (G I ו-G o) אשר לאחר מכן לאגד ולהפעיל את ערוץ GIRK. פעם אחת פתחתי את ערוץ GIRK מאפשר תנועה של K + מחוץ לתא גורמת קרום מנוחה הפוטנציאל להיות שלילי יותר. כתוצאה מכך, הפעלת GIRK ערוץ בנוירונים פוחתת היווצרות ספונטנית פוטנציאל פעולה מעכב שחרור של שליחים עצביים מעוררים. בלב, הפעלת ערוץ GIRK מעכב פעילות הקוצב ובכך להאט את קצב הלב.
כאן אנו מתארים assay בזמן אמת ההקרנה לזיהוי מאפננים חדשים של ערוצי GIRK. ב assay זה, תאים עצביים AtT20, אשר הביעו את ערוצי GIRK, נטענים עם פוטנציאל רגיש צבעים קרום ניאון כגון bis-(1,3-dibutylbarbituric חומצה) trimethine oxonol [DiBAC 4 (3)] או HLB 021-152 (איור 1 ). את מולקולות צבע להיות ספיגת הבאה ניאון חזק אל תוך התאים (איור 1). טיפולשל תאים עם ligands GPCR מגרה ערוצי GIRK לפתוח. כתוצאה K + בזרימת מחוץ לתא גורמת פוטנציאל הממברנה להיות שלילית יותר את האות ניאון כדי להקטין (איור 1). לכן, תרופות לווסת K + בזרימת דרך ערוץ GIRK ניתן ושם ישקלו לו ויעריכו באמצעות הקורא הצלחת ניאון. שלא כמו אחרים ערוץ יון מבחני המיון, כגון ספיגת ספקטרומטריית אטומית 4 או 5 radiotracer ניתוח, assay ערוץ GIRK ניאון מספק בהליך מיון מהיר, בזמן אמת ולא יקר.
Protocol
1. הכנת תאים
- לגדול יותרת המוח AtT20 תאים במדיום שונה Dulbecco של הנשרים (DMEM) השלימו עם סרום סוס 10% ולשמור על תרבויות על 37 מעלות צלזיוס באווירה humidified של 5% CO 2.
- לשמור על התרבות התאים על ידי subculturing כל 5 עד 7 ימים באמצעות הליך trypsinization סטנדרטי.
- לצפות את הבארות של התחתון, שחור בהיר, צלחות 96-50 גם עם μL של פולי-L-ליזין. אפשר בארות את לייבוש למשך 30 דקות בחממה.
- הצלחת התאים את הצלחות 96-200 המכילים גם התקשורת μL בצפיפות של 30,000 תאים בכל טוב לאחסן את התאים בחממה של 3-4 ימים.
- השתמש ההתקנה השאיפה, בהיקף של צנצנת 4 ליטר פקוק מחובר ואקום בצד אחד טיפ 200 פיפטה μL בקצה השני, לאט לאט לשאוב בינוני תרבות monolayer מן התא.
- שוטפים את התאים עם μL 200 של פתרון חיץ רגיל (132 mM NaCl, KCl 5 מ"מ, 1 מ 'M CaCl 2, 1 mM MgCl 2, 5 מ"מ דקסטרוז, 5 HEPES מ"מ, ה-pH 7.4 עם NaOH).
- הוספת 200 μL של פתרון מאגר המכיל את הפוטנציאל רגיש קרום צבע (MPD) DiBAC 4 (3) או HLB 021-152 (5 מיקרומטר) זה טוב דגירה התאים דקות 40 ב 37 ° C.
2. הכנת תרכובות בדיקה וטיפול Cell
- הכן דילול סדרתי של תרכובות הבדיקה (מניות = 10 מ"מ DMSO) מספריית מתחם (בפורמט 96-היטב) באמצעות (ThermoFisher) Versette טיפול אוטומטי מערכת נוזלי.
- הסר את צלחת 96-ובכן, המכיל את AtT20 תאים, מן החממה ולאפשר הצלחת לחזור לטמפרטורת החדר. לשאוב את המאגר הישן וליישם פתרון חוצץ חדש המכיל את MPD אל התאים.
- באמצעות מערכת טיפול הנוזל להחיל ריכוזים שונים (10 ננומטר ל -10 מיקרומטר) של תרכובות הבדיקה (2-20 μL) ופתרונות שליטה (0.1% DMSO) (במאגר פתרון containing MPD) לצלחת 96-המכילה גם את התאים.
- דגירה התאים דקות 5 עם תרכובות הבדיקה שקדמו המדידות ניאון.
3. הפעלת ערוצים GIRK, מדידה וניתוח פלורסנט ו
- הכנס את צלחת 96-היטב לקורא Biotek צלחת Synergy2 ניאון ולקבל את האות רקע פלורסנט באורכי גל עירור ופליטה של 520 ו 560 ננומטר, בהתאמה.
- החל את ligands GPCR (= סומטוסטטין 200 מייל ימי או carbachol = 10 מיקרומטר) או פתרון שליטה (מאגר לבד) (20 μL) אל בארות (הנפח הכולל = 220 μL) להפעלת ערוצי GIRK באמצעות מערכת ההזרקה Synergy2. איסוף נקודות נתונים במרווחי זמן של 10 פני תקופה דגימה של 300 באורכי גל עירור ופליטה של 520 ו 560 ננומטר, בהתאמה.
- קבל את הקורס בזמן שיא האמפליטודה של שינוי ניאון באמצעות Biotek Gen5 תוכנה לייצא את הנתונים ל-Excel לצורך ניתוח נוסף. לחשב את Z'גורמים כדי לקבוע את המהימנות של assay. לוחות המשמשים לקביעת Z'גורם מכיל 2 שורות כל אחד חיובי (ליגנד GPCR) והשלילי (מאגר לבד) שולטת. Z'גורם מוגדר: Z '= 1 - (P + 3σ 3σ N) / | P μ - μ N |, כאשר μ μ P & N הן אמצעי שליטה חיובית אותות בקרה שליליות, ו σ P & σ N הן סטיות תקן של שליטה חיובית אותות בקרה שליליות, בהתאמה 6. Z'גורמי בטווח של 0.5-1.0 עולה כי איכות assay מצוין 6. צלחות עם גורמי Z'מתחת 0.5 אינם נכללים בניתוח.
- תרכובות לווסת את האות ניאון הם נוספת שתבצע בנוכחות Ba 2 + או tertiapin-Q כדי לאשר פנימה מיישר K + הספציפיות הערוץ.
4. Representative תוצאות
למשל האות הקרינה נמדדת באמצעות assay ערוץ GIRK מוצג באיור 2. תוספת של somatostatin ליגנד GPCR (200 ננומטר) ל AtT20 תאים הנגרם מהיר, הזמן תלוי ירידה האות HLB 021-152 ניאון (איור 2). לעומת זאת, התוספת של פתרון בקרת המיוצר עלייה מיידית קטנה הקרינה שעם הזמן חזר לקו הבסיס (איור 2). השוואה בין ערכים ניאון השיא ב 96-הזריק גם צלחות עם שליטה ופתרונות somatostatin נתן כמה Z'גורמי בטווח של 0.5-0.7. עבור כימות נוספת, הרשומה השליטה היה מפחיתים את שיא somatostatin ואת התוצאה somatostatin רגיש האות ניתח (איור 2).
Assay מספק שיטה מהירה לזיהוי תרופות לווסת ערוצי GIRK. לדוגמה, תרופות המעכבות את צ'ה GIRKnnel צריך להפחית GPCR ליגנד בתיווך ירידה הקרינה על ידי מניעת K + בזרימת מן התאים. כפי שניתן לראות באיור 3, טיפול של התאים עם tertiapin-Q, רעלן זה חוסם ערוצי GIRK 7, המיוצר על עיכוב של שינוי somatostatin בתיווך ניאון. Propafenone, תרופה אנטי בקצב לא סדיר שחוסמת ערוצי GIRK בלב 8, גם עכבות שינוי ניאון (איור 4). Assay יכול גם להיות שימושי עבור זיהוי activators של ערוץ GIRK. עם זאת, היישום של אתנול (100 & 200 מ"מ), גרמה activator של ערוץ GIRK 2,3, לא חל שינוי משמעותי אות ניאון בהשוואה לשלוט פתרון (p> 0.5).
באיור 1. עיצוב ניסיוני של assay GIRK ערוץ ניאון. AtT20 תאים מודגרת במאגר המכיל membranדואר פוטנציאל רגיש צבע פלואורסצנטי (D). את מולקולות צבע להיכנס לתאים ולהפוך ניאון על קשירה חלבונים תאיים (פאנל למעלה). עקידת somatostatin (סום) כדי GPCR שלה מגרה את החלבון מדכא G (G i) גורם להפעלה של ערוץ GIRK (הפאנל התחתון). בזרימת הבאות של K + מחוץ לתאים גורמת קרום הפוטנציאל להיות שלילי יותר את מולקולות צבע כדי לצאת התאים. כתוצאה מכך את האות יורדת ניאון (הפאנל התחתון).
2. איור נציג HLB 021-152 אות ניאון נמדד לאורך זמן את AtT20 תאים במהלך תוספת של somatostatin או פתרון שליטה. היחס בין עוצמת ניאון (F / F O) חושב על ידי חלוקת האות בנוכחות (ו) somatostatin (או פתרון שליטה) על ידי האות המחקר נמדד לפני (F O) מודעותdition של somatostatin (או פתרון שליטה). כל נקודה מייצגת ממוצע ± SE שהושגו 5-6 בארות. Somatostatin או פתרון שליטה נוסף בזמן אפס (↓). התוספת של פתרון בקרת גרם לעלייה חולפת קטן אות ניאון. זו תוצאה של שינוי הטמפרטורה הנגרמת על ידי הזרקה של הפתרון.
איור 3. טיפול של AtT20 תאים עם tertiapin-Q (500 ננומטר) מעכב את הירידה somatostatin בתיווך האות ניאון באמצעות קשירה וחסימת ערוצי GIRK. כל נקודה מייצגת ממוצע ± SE שהושגו 4-6 בארות. Somatostatin נוספה בזמן אפס (↓).
איור 4. טיפול של AtT20 תאים עם propafenone (20 מיקרומטר) גם מעכב ירידה somatostatin בתיווך באות ניאון. כל נקודה מייצגת ממוצע ± SE שהושגו 5-6 בארות. Somatostatin נוספה בזמן אפס (↓).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
למרות הפוטנציאל רגישים קרום צבעי ניאון נעשה שימוש כדי לזהות תרופות אשר לווסת תעלות יונים 9,10, זהו הדו"ח הראשון של בקשתם העצבית GIRK ערוץ גילוי תרופות. Assay ערוץ GIRK ניאון המובא כאן מספק שיטה מהירה, אמינה בזמן אמת להקרנה של ליגנד, מגודרת K + ערוצים. Assay ניתן לשנות לשימוש עם מגוון רחב של תאים, כולל תאים קווי הנציח (HEK293, צ 'ו, וכו') המבטאים אקסוגני רקומביננטי GIRK ערוץ 11 או שורות תאים משובטים (AtT20, PC-12) המבטאים ערוץ אנדוגני. בנוסף, assay ניתן להתאים תרופות ההקרנה בתאי גזע עובריים ותרבויות תאים ראשוניים. כמו בשימוש עם AtT20 תאים, assay גם מספק תועלת נוספת לאפשר את לימוד ligands GPCR מרובים (somatostatin ו carbachol) בערוץ GIRK. כמו עם כל assay ניאון, בקרת ניסויים יש לבצע את הliminate חפצים בשל מתחם אוטומטי הקרינה ולזהות טעויות הנובעות אינטראקציה ישירה של תרכובות עם מולקולות צבע. גישות חלופיות כגון assay זרם תליום 11 ו תיקון אוטומטי מהדק 12 ההליך צריך להיות גם נחשב.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגוד עניינים הצהיר.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי ארצות הברית בפרס אישי שירות הבריאות NS-071530.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Cellgro | 10-013 | |
| Horse serum | Invitrogen | 16050-114 | |
| 96-well plates | Corning | 3603 | |
| Poly-l-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| Somatostatin | Sigma-Aldrich | S9129 | |
| Carbachol | Sigma-Aldrich | C4382 | |
| HLB 021-152 | AnaSpec | 89300 | |
| Versette automated liquid handler | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 650-01 | |
| Synergy2 fluorescent plate reader | BioTek | ||
| Gen5 analysis software | BioTek | ||
| Table 1. Table of specific reagents and equipment. | |||
References
- Hibino, H. Inward rectifying potassium channels: their structure, function and physiological roles. Physiol. Rev. 90, 291-366 (2010).
- Lusscher, C., Slesinger, P. A. Emerging roles for G protein-gated inwardly rectifying potassium (GIRK) channels in health and disease. Nat. Rev. Neurosci. 11, 301-315 (2010).
- Kobayashi, T., Ikeda, K. G protein-activated inwardly rectifying potassium channels as potential therapeutic targets. Cur. Pharm. Des. 12, 4513-4523 (2006).
- Terstappen, G. C. Functional analysis of native and recombinant ion channels using a high-capacity nonradioactive rubidium efflux assay. Anal. Biochem. 272, 149-155 (1999).
- Cheng, C. S. A high-throughput HERG potassium channel function assay: an old assay with a new look. Drug Dev. Ind. Pharm. 28, 177-191 (2002).
- Zhang, J. -H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).
- Jin, W., Lu, Z. A novel high-affinity inhibitor for inward-rectifier K+ channels. Biochem. 37, 13291-13299 (1998).
- Inomata, N. Anti-arrhythmic agents act differently on the activation phase of the Ach-response in guinea pig atrial myocytes. Br. J. Pharmacol. 108, 111-116 (1993).
- Tang, W. Development and evaluation of high throughput functional assay methods for HERG potassium channel. J. Biomol. Screen. 6, 325-331 (2001).
- Wolff, C., Fuks, B., Chatelain, P. Comparative study of membrane potential-sensitive fluorescent probes and their use in ion channel screening assays. J. Biomol. Screen. 8, 533-513 (2003).
- Niswender, C. M., Johnson, K. A., Luo, Q., Avala, J. E., Kim, C., Conn, P. J., Weaver, C. D. A novel assay of Gi/o-linked G protein-coupled receptor coupling to potassium channels provides new insights into the pharmacology of group III metabotropic glutamate receptors. Mol. Pharm. 73, 1213-1224 (2008).
- Bridal, T. R., Marquilis, M., Wang, X., Donio, M., Sorota, S. Comparison of human Ether-á-go-go related gene screening assays based on IonWorks Quattro and thallium flux. Assay Drug Dev. Technol. 8, 755-765 (2010).
