Summary
दवाओं के कि प्रोटीन gated जी आवक सही करनेवाला कश्मीर साथ बातचीत की पहचान के लिए एक वास्तविक समय स्क्रीनिंग प्रक्रिया
Protocol
1. प्रकोष्ठों के तैयार
- है Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) 10% और 5% सीओ 2 के एक humidified माहौल घोड़े सीरम में 37 ° C पर संस्कृतियों को बनाए रखने के साथ पूरक में पिट्यूटरी AtT20 कोशिकाओं के आगे बढ़ें.
- संस्कृति कोशिकाओं subculturing हर 5 से 7 दिनों एक मानक trypsinization प्रक्रिया का उपयोग करके बनाए रखें.
- कोट काला, स्पष्ट नीचे के कुओं, पाली एल Lysine के 50 μL साथ में 96 अच्छी तरह प्लेटें. कुओं को इनक्यूबेटर में 30 मिनट के लिए शुष्क करने की अनुमति.
- 96 अच्छी तरह से अच्छी तरह से प्रति 30,000 कोशिकाओं के घनत्व और 3-4 दिनों के लिए इनक्यूबेटर में कोशिकाओं की दुकान 200 μL मीडिया वाले प्लेट में कोशिकाओं प्लेट.
- एक आकांक्षा सेटअप एक stoppered 4 लीटर एक छोर पर एक वैक्यूम से जुड़े जार और दूसरे छोर पर एक 200 μL विंदुक टिप शामिल है, का उपयोग करने के लिए धीरे सेल monolayer से संस्कृति के माध्यम महाप्राण (व्यंजन).
- सामान्य बफर समाधान की 200 μL (132 मिमी NaCl, 5 मिमी KCl, 1 मीटर के साथ कोशिकाओं को धोएम 2 CaCl, 1 मिमी 2 MgCl, 5 मिमी द्रक्षौज, 5 मिमी HEPES के, NaOH के साथ 7.4 पीएच).
- बफर संभावित संवेदनशील झिल्ली (एमपीडी) डाई 4 DiBAC (3) या 021-152 HLB (5 माइक्रोन) एक अच्छी तरह से युक्त समाधान के 200 μL जोड़ें और 37 पर 40 मिनट के लिए कोशिकाओं को सेते हैं डिग्री सेल्सियस
2. टेस्ट कम्पाउँड और सेल उपचार की तैयारी
- परीक्षण यौगिकों की एक धारावाहिक मन्दन (स्टॉक = DMSO में 10 मिमी) एक परिसर पुस्तकालय से 96 अच्छी तरह प्रारूप में एक Versette (ThermoFisher) स्वचालित तरल हैंडलिंग प्रणाली का उपयोग कर तैयार है.
- , AtT20 कोशिकाओं से युक्त 96 अच्छी तरह से थाली निकालें, मशीन से और प्लेट कमरे के तापमान पर लौटने के लिए अनुमति देते हैं. पुराने बफर महाप्राण (व्यंजन) और ताजा बफर कोशिकाओं को एमपीडी युक्त समाधान लागू होते हैं.
- का प्रयोग तरल हैंडलिंग प्रणाली परीक्षण यौगिकों के विभिन्न सांद्रता (10 एनएम से 10 माइक्रोन के लिए) (2 से 20 μL) और नियंत्रण (0.1% DMSO के) (बफर समाधान containi में समाधान लागूएमपीडी एनजी 96 अच्छी तरह से कोशिकाओं से युक्त थाली).
- फ्लोरोसेंट माप से पहले परीक्षण यौगिकों के साथ 5 मिनट के लिए कोशिकाओं को सेते हैं.
3. GIRK चैनल के सक्रियकरण, प्रतिदीप्त मापन और विश्लेषण
- बायोटेक Synergy2 फ्लोरोसेंट प्लेट रीडर में 96 अच्छी तरह से थाली डालें और 520 की उत्तेजना और उत्सर्जन तरंगदैर्य और 560 एनएम पर फ्लोरोसेंट पृष्ठभूमि संकेत प्राप्त करने के लिए, क्रमशः.
- कुओं GPCR (सोमेटोस्टेटिन = 200 एनएम या carbachol के = 10 माइक्रोन) ligands के या नियंत्रण समाधान (बफर अकेला) (20 μL) लागू (कुल = 220 μL मात्रा) GIRK Synergy2 सुई लगानेवाला प्रणाली का उपयोग करते हुए चैनल सक्रिय. 520 की उत्तेजना और उत्सर्जन तरंगदैर्य और 560 एनएम पर 10 300 के नमूने अवधि में अंतराल पर डेटा बिंदुओं क्रमशः लीजिए,.
- समय पाठ्यक्रम और फ्लोरोसेंट बायोटेक Gen5 सॉफ्टवेयर का उपयोग कर परिवर्तन के शिखर आयाम प्राप्त करें और आगे के विश्लेषण के लिए Excel में डेटा निर्यात. Z'कारक गणना करने के लिए परख की विश्वसनीयता निर्धारित करने के लिए. Z'कारक दृढ़ संकल्प के लिए इस्तेमाल किया प्लेट्स 2 सकारात्मक का प्रत्येक पंक्तियाँ (GPCR ligand) और नकारात्मक नियंत्रण (बफर अकेला) होता है. Z'कारक के रूप में परिभाषित किया गया है: जेड '= 1 - (3σ पी 3σ एन) / | μ पी - एन μ |,, जहां μ पी एंड μ एन सकारात्मक नियंत्रण और नकारात्मक नियंत्रण संकेतों के साधन हैं और σ पी एंड का σ एन सकारात्मक नियंत्रण के मानक विचलन और नकारात्मक नियंत्रण संकेतों, क्रमशः 6. 0.5 से 1.0 की रेंज में Z'कारकों का संकेत मिलता है कि परख की गुणवत्ता 6 उत्कृष्ट है. नीचे 0.5 Z'कारकों के साथ प्लेट्स विश्लेषण से बाहर रखा गया है.
- यौगिकों कि फ्लोरोसेंट संकेत न्यूनाधिक + या tertiapin क्यू 2 दादी की उपस्थिति में retested आवक सही करनेवाला + चैनल विशिष्टता कश्मीर की पुष्टि कर रहे हैं.
4. आरepresentative परिणाम
प्रतिदीप्ति संकेत GIRK चैनल परख का उपयोग करके मापा का एक उदाहरण चित्रा 2 में दिखाया गया है. GPCR ligand के AtT20 कोशिकाओं को सोमेटोस्टेटिन (200 एनएम) के अलावा एक तेजी से, समय पर निर्भर HLB 021-152 फ्लोरोसेंट संकेत में कमी (चित्रा 2) के कारण होता है. इसके विपरीत, नियंत्रण समाधान के अलावा प्रतिदीप्ति में एक छोटे से तात्कालिक वृद्धि है कि समय के साथ आधारभूत लौट आए (चित्रा 2) का उत्पादन किया. 96 नियंत्रण और सोमेटोस्टेटिन समाधान के साथ अच्छी तरह से इंजेक्शन प्लेटों में शिखर फ्लोरोसेंट मूल्यों की तुलना 0,7 0,5 की रेंज में एक Z'कारकों दिया है. आगे मात्रा का ठहराव के लिए, नियंत्रण रिकॉर्ड सोमेटोस्टेटिन रिकॉर्ड से घटाया गया था और परिणामस्वरूप सोमेटोस्टेटिन संवेदनशील संकेत विश्लेषण (चित्रा 2).
परख जल्दी दवाओं कि GIRK चैनलों मिलाना की पहचान के लिए एक तरीका प्रदान करता है. उदाहरण के लिए, दवाओं कि GIRK के चा रोकनाnnel + K तपका से कोशिकाओं को रोकने के द्वारा GPCR प्रतिदीप्ति में ligand मध्यस्थता कम हो जाती है कम करना चाहिए. चित्रा 3, कक्षों की tertiapin क्यू, एक विष के साथ उपचार में दिखाया गया है कि ब्लॉक GIRK 7 चैनल, फ्लोरोसेंट परिवर्तन सोमेटोस्टेटिन की मध्यस्थता के निषेध का उत्पादन किया. Propafenone, एक विरोधी अतालता संबंधी दवा है कि दिल में 8 GIRK चैनलों ब्लॉक भी फ्लोरोसेंट परिवर्तन (चित्रा 4) हिचकते हैं. परख भी GIRK चैनल की activators की पहचान करने के लिए उपयोगी हो सकता है. हालांकि, इथेनॉल के आवेदन (100 और 200 मिमी), एक उत्प्रेरक की GIRK 2,3 चैनल, फ्लोरोसेंट संकेत में कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन का कारण बना है जब समाधान (पी 0.5>) को नियंत्रित करने के लिए की तुलना में.
चित्रा 1 GIRK चैनल फ्लोरोसेंट परख की प्रयोगात्मक डिजाइन. AtT20 कोशिकाओं membran युक्त बफर में incubated हैंई क्षमता के प्रति संवेदनशील फ्लोरोसेंट रंजक (डी). डाई अणु की कोशिकाओं में प्रवेश और intracellular प्रोटीन (शीर्ष पैनल) के लिए बाध्य करने पर फ्लोरोसेंट हो जाते हैं. इसके GPCR सोमेटोस्टेटिन की बाइंडिंग (सोम) जी निरोधात्मक प्रोटीन GIRK चैनल (नीचे पैनल) के सक्रियण के कारण (मैं जी) को बढ़ावा देने. कश्मीर कोशिकाओं के बाहर + के बाद तपका झिल्ली के लिए और अधिक नकारात्मक और डाई अणु कोशिकाओं से बाहर निकलने के बनने की क्षमता का कारण बनता है. एक परिणाम के रूप में फ्लोरोसेंट संकेत कम हो जाती है (नीचे पैनल).
चित्रा 2. प्रतिनिधि HLB 021-152 फ्लोरोसेंट संकेत सोमेटोस्टेटिन या नियंत्रण समाधान के अलावा के दौरान AtT20 कोशिकाओं में समय पर मापा. फ्लोरोसेंट तीव्रता (एफ / ओ एफ) का अनुपात सोमेटोस्टेटिन (एफ) विज्ञापन (ओ एफ) से पहले मापा आधारभूत संकेत द्वारा (या नियंत्रण समाधान) उपस्थिति में संकेत विभाजित करके गणना की गईसोमेटोस्टेटिन के प्रत्यर्पण (या नियंत्रण समाधान). प्रत्येक बिंदु मतलब ± एसई 5-6 कुओं में प्राप्त प्रतिनिधित्व करता है. Somatostatin या नियंत्रण समाधान शून्य समय (↓) में जोड़ा गया है. नियंत्रण समाधान के अलावा फ्लोरोसेंट संकेत में एक छोटे क्षणिक वृद्धि के कारण होता है. इस समाधान के इंजेक्शन की वजह से एक तापमान परिवर्तन से परिणामस्वरूप.
चित्रा 3 tertiapin क्यू (500 एनएम) के साथ AtT20 कोशिकाओं के उपचार के लिए बाध्य और GIRK चैनलों अवरुद्ध द्वारा फ्लोरोसेंट संकेत की मध्यस्थता में कमी सोमेटोस्टेटिन रोकता. प्रत्येक बिंदु मतलब ± एसई 4-6 कुओं में प्राप्त प्रतिनिधित्व करता है. Somatostatin शून्य समय (↓) में जोड़ा गया है.
चित्रा 4 propafenone (20 माइक्रोन) के साथ AtT20 कोशिकाओं के उपचार भी सोमेटोस्टेटिन की मध्यस्थता में कमी रोकताफ्लोरोसेंट संकेत. प्रत्येक बिंदु मतलब ± एसई 5-6 कुओं में प्राप्त प्रतिनिधित्व करता है. Somatostatin शून्य समय (↓) में जोड़ा गया है.
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Discussion
जबकि संभावित संवेदनशील झिल्ली फ्लोरोसेंट रंजक के लिए दवाओं है कि आयन चैनल मिलाना 9,10 की पहचान के लिए इस्तेमाल किया गया है, इस neuronal GIRK चैनल दवाओं की खोज के लिए अपने आवेदन की पहली रिपोर्ट है. GIRK चैनल फ्लोरोसेंट परख यहाँ प्रस्तुत ligand-gated कश्मीर + चैनलों की स्क्रीनिंग के लिए एक तेज, विश्वसनीय और वास्तविक समय तरीका प्रदान करता है. परख अमर कोशिकाओं लाइनों (HEK293, चो, आदि) एक बहिर्जात पुनः संयोजक GIRK 11 चैनल या प्रतिरूप सेल लाइनों (AtT20, पीसी -12) एक अंतर्जात चैनल व्यक्त व्यक्त सहित कोशिकाओं की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ प्रयोग के लिए संशोधित किया जा सकता है. इसके अलावा, परख भ्रूण स्टेम कोशिकाओं और प्राथमिक सेल संस्कृतियों में स्क्रीनिंग दवाओं के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. प्रयोग AtT20 कोशिकाओं के साथ किया, परख भी GIRK चैनल पर कई GPCR ligands के (सोमेटोस्टेटिन और carbachol) के अध्ययन की अनुमति के अतिरिक्त लाभ प्रदान करता है. कोई फ्लोरोसेंट परख के साथ के रूप में, नियंत्रण प्रयोगों के लिए ई बाहर किया जाना चाहिएऑटो प्रतिदीप्ति यौगिक और डाई अणु के साथ यौगिकों के प्रत्यक्ष बातचीत से उत्पन्न त्रुटियों की पहचान की वजह से कलाकृतियों liminate. थालियम बाढ़ 11 परख और स्वचालित पैच दबाना प्रक्रिया 12 के रूप में वैकल्पिक तरीकों पर भी विचार किया जाना चाहिए.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
यह काम अमेरिका के सार्वजनिक स्वास्थ्य सेवा पुरस्कार एन एस 071,530 द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Cellgro | 10-013 | |
| Horse serum | Invitrogen | 16050-114 | |
| 96-well plates | Corning | 3603 | |
| Poly-l-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| Somatostatin | Sigma-Aldrich | S9129 | |
| Carbachol | Sigma-Aldrich | C4382 | |
| HLB 021-152 | AnaSpec | 89300 | |
| Versette automated liquid handler | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 650-01 | |
| Synergy2 fluorescent plate reader | BioTek | ||
| Gen5 analysis software | BioTek | ||
| Table 1. Table of specific reagents and equipment. | |||
References
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