Summary
Gタンパク質依存性内向き整流Kと相互作用する薬剤を同定するためのリアルタイムスクリーニングの手順
Abstract
Gタンパク質依存性内向き整流K +（GIRK）チャンネルはホルモンや神経伝達物質の広い範囲の細胞のメディエーターとして機能し、脳、心臓、骨格筋、内分泌組織の1,2で表されます。 GIRKチャネルは、それらの細胞膜結合型のリガンド（神経伝達物質、ホルモン、薬物など）、Gタンパク質共役型受容体（GPCR）の結合後に有効になります。この結合は、その後に結合し、GIRKチャネルを活性化するGタンパク質（G iとG o）の刺激を引き起こす。一度GIRKチャネルは、Kの動きを可能にする+外より負になるための静止膜電位を引き起こす細胞からオープンしました。その結果、ニューロンのGIRKチャネルの活性化は、自発的活動電位の形成を減少させ、興奮性神経伝達物質の放出を阻害する。心の中で、GIRKチャネルの活性化は、それによって心拍数を遅くするペースメーカー活性を阻害する。
ここでは、GIRKチャネルの新たなモジュレーターを同定するためのリアルタイムスクリーニングアッセイを説明します。このアッセイでは、GIRKチャネルを発現神経AtT20細胞は、例えば、ビス- （1,3 - dibutylbarbituric酸）トリメチンオキソノール[DiBAC 4（3）]またはHLB 021から152（ 図1のような膜電位感受性蛍光色素を使用してロードされ。）色素分子は、細胞（ 図1）に強い蛍光を、次の取り込みになります。治療GPCRリガンドと細胞のGIRKチャネルを開くために刺激する。細胞外の結果K +流出は、膜電位がより負と減少する蛍光シグナル（ 図1）になるようになります。したがって、GIRKチャネルを介してK +流出を調節する薬剤は蛍光プレートリーダーを用いてアッセイすることができます。他のイオンチャネルスクリーニングアッセイなど、原子吸光分析法4または放射性トレーサー解析5と異なり、GIRKチャネル蛍光アッセイは、高速リアルタイムかつ安価なスクリーニング法を提供します。
Protocol
1。細胞の調製
- 5％CO 2の加湿雰囲気で10％ウマ血清、37℃で培養を維持すると補足したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）で下垂体AtT20細胞を成長させる。
- 標準的なトリプシン処理プロシージャを使用してすべての5〜7日の細胞を継代培養により培養を維持しています。
- コート、黒、透明底のウェル、ポリ-L-リジンの50μL、96ウェルプレート。井戸はインキュベーター内で30分間乾燥させます。
- ウェル当たり30,000細胞の密度で3-4日間培養器内のセルを格納し、200μLの培地を含有する96ウェルプレートのプレートの細胞を。
- 徐々に細胞単層から培地を吸引するために、一方の端に真空ともう一方の端に200μLピペットの先端に接続された栓を4リットル瓶で構成され、誤嚥のセットアップを使用しています。
- 通常の緩衝液（132 mM塩化ナトリウム、5 mMのKClを、1メートルの200μLで細胞を洗浄MのCaCl 2、1mMのMgCl 2、5mMのデキストロース、5mMのHEPES、NaOHでpH 7.4）。
- 各ウェルに膜電位感受性色素（MPD）DiBAC 4（3）またはHLB 021から152（5μM）を含む緩衝液200μLを追加し、37℃で40分間細胞をインキュベート℃に
2。試験化合物および細胞治療の準備
- Versette（サーモフィッシャー）自動液体ハンドリングシステムを使用して、化合物ライブラリーからの試験化合物の希釈（DMSO中ストック= 10 mM）を（96ウェルフォーマットで）を準備します。
- インキュベーターから、AtT20細胞を含む、96ウェルプレートを取り外し、プレートを室温に戻すことができます。古いバッファをオフに吸引し、細胞へのMPDを含む新鮮な緩衝液を適用します。
- 液体ハンドリングシステムは、様々な試験化合物の濃度（10 nMの10μMまで）（2から20μL）と制御ソリューション（0.1％DMSO）を（緩衝液containiに適用される使用NG MPD）細胞を含む96ウェルプレートへ。
- 蛍光測定の前に試験化合物を5分間、細胞をインキュベートします。
3。 GIRKチャネルの活性化、蛍光測定と解析
- バイオテックSynergy2蛍光プレートリーダーに96ウェルプレートを挿入し、それぞれ、520および560nmの励起および発光波長で蛍光バックグラウンド信号を得る。
- Synergy2インジェクターシステムを使用して、GIRKチャネルをアクティブにする（総量= 220μL）をウェルにGPCRリガンド（ソマトスタチン= 200 nM以上カルバコール= 10μM）またはコントロール溶液（緩衝液のみ）（20μL）を適用します。それぞれ520および560 nmの励起および発光波長で300秒のサンプリング期間を10秒間隔でデータポイントを収集します。
- 時間経過とバイオテックGEN5ソフトウェアを用いた蛍光変化のピーク振幅を取得し、さらに分析するためにデータをExcelにエクスポートします。 アッセイの信頼性を決定するためにZ '因子を計算します。 Z '因子の決定のために使用されるプレートは、2行正（GPCRリガンド）と負（バッファーのみ）の各コントロールが含まれていました。 Z '因子は次のように定義されています。Z' = 1 - （3σP +3σN）/ |μのP - μN |μP＆μNは正の制御と負の制御信号の手段である、、、σ P＆N、σは正の制御とそれぞれ負の制御信号、6の標準偏差である。 0.5から1.0の範囲でZ '因子は、アッセイの品質が6に優れていることを示します。 0.5以下Z'-因子とプレートは分析から除外されます。
- 蛍光シグナルを調節する化合物は、内向き整流K +チャネルの特異性を確認するのBa 2 +の存在またはtertiapin-Qで再検査されています。
4。 Representative結果
GIRKチャネルアッセイを用いて測定した蛍光シグナルの例を図2に示されています。 AtT20細胞にGPCRリガンドのソマトスタチン（200 nm）の添加は、HLB 021から152蛍光シグナル（ 図2）が急速に、時間依存性の減少を引き起こした。対照的に、コントロール溶液の添加は、時間とともに（ 図2）ベースラインに戻ったことを蛍光の小さな瞬間的な上昇を作り出した。制御およびソマトスタチンソリューションを注入し、96ウェルプレートのピーク蛍光値の比較は0.5から0.7の範囲でZ '因子を与えた。さらに、定量化のため、制御レコードはソマトスタチンレコードと（ 図2）分析結果のソマトスタチン敏感な信号から減算されました。
アッセイは迅速にGIRKチャネルを調節する薬剤を同定する方法を提供する。 GIRKチャを阻害する、例えば、薬物nnel細胞からK +流出を防止することにより、蛍光のGPCRリガンド媒介減少を減らす必要があります。などのブロックGIRKチャネル7その毒素、tertiapin-Qによる細胞の処理は、 図3に示すように、ソマトスタチンを介した蛍光変化の抑制を作り出した。プロパフェノン、心臓8のブロックGIRKチャネルを抗不整脈薬はまた、蛍光の変化（ 図4）を阻害した。アッセイはまた、GIRKチャネルの活性化を識別するための役に立つかもしれません。ソリューション（P> 0.5）を制御すると比較した場合しかし、エタノールのアプリケーション（100＆200 mM）を、GIRKチャネル2,3の活性化は、蛍光シグナルの有意な変化を引き起こさなかった。
図1。GIRKチャネル蛍光アッセイの実験的デザイン。 AtT20細胞はmembranを含む緩衝液中でインキュベートされる電子電位感受性蛍光色素（D）。色素分子は、細胞に入ると細胞内のタンパク質（上のパネル）に結合すると蛍光灯になります。そのGPCRへ（SOM）ソマトスタチンの結合は、GIRKチャネル（下パネル）の活性化を引き起こすG阻害タンパク質（G i）を刺激します。 K +外細胞のその後の流出は、膜電位は細胞を終了するには、より負と色素分子になるようになります。結果として、蛍光シグナルの減少（下パネル）。
ソマトスタチンまたはコントロール溶液の添加時にAtT20細胞内で経時的に測定図2。代表HLB 021から152蛍光シグナル。蛍光強度（F / F O）の比率は（F O）広告する前に測定されたベースライン信号によるソマトスタチンの有無（F）（またはコントロール溶液）で信号を割ることによって算出したソマトスタチンのdition（またはコントロール溶液）。各点は平均値±SE 5から6の井戸で得を表しています。ソマトスタチンまたはコントロール溶液は、時間ゼロ（↓）で追加されました。コントロール溶液の添加は、蛍光シグナルの小さな一時的な増加を引き起こした。これは、溶液の注入によって引き起こされる温度変化に起因する。
図3。tertiapin-Q（500 nm）でAtT20細胞の治療は、ソマトスタチン媒介に結合し、GIRKチャネルを遮断することによって蛍光シグナルの減少を抑制する。各点は平均値±4から6の井戸で得られたSEを表しています。ソマトスタチンは、時間ゼロ（↓）で追加されました。
図4プロパフェノン（20μM）とAtT20細胞の治療はまたのソマトスタチン媒介の減少を抑制する蛍光シグナル。各点は平均値±SE 5から6の井戸で得を表しています。ソマトスタチンは、時間ゼロ（↓）で追加されました。
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Discussion
膜電位感受性蛍光色素がイオンチャネルを調節する薬物9,10を識別するために使用されているが、これはニューロンのGIRKチャネル創薬への応用の最初の報告である。ここに提示GIRKチャネルの蛍光アッセイは、リガンド依存性K +チャネルのスクリーニングのための、高速で信頼性の高いリアルタイムメソッドを提供します。アッセイは、内因性のチャネルを発現している外因性の遺伝子組換えGIRKチャネル11またはクローン細胞株を発現する不死化細胞株（HEK293、CHO等）（AtT20、PC-12）を含むセルの広い範囲で使用するために変更することができます。さらに、このアッセイは、胚性幹細胞と初代培養細胞に薬物をスクリーニングするために適合させることができる。 AtT20セルで使用されるように、アッセイはまた、GIRKチャネル上の複数のGPCRリガンド（ソマトスタチンおよびカルバコール）の研究を可能にするの余分な利点を提供します。任意の蛍光アッセイと同様に、コントロール実験がeに実施しなければならない自家蛍光を配合し、色素分子を有する化合物の直接的な相互作用に起因するエラーを識別するためにアーティファクトをliminate。そのようなタリウム流入アッセイ11自動パッチクランプ手順12のような代替アプローチも考慮する必要があります。
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Disclosures
利害の衝突が宣言されません。
Acknowledgments
この作品は、米国公衆衛生局賞NS-071530によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Cellgro | 10-013 | |
| Horse serum | Invitrogen | 16050-114 | |
| 96-well plates | Corning | 3603 | |
| Poly-l-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| Somatostatin | Sigma-Aldrich | S9129 | |
| Carbachol | Sigma-Aldrich | C4382 | |
| HLB 021-152 | AnaSpec | 89300 | |
| Versette automated liquid handler | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 650-01 | |
| Synergy2 fluorescent plate reader | BioTek | ||
| Gen5 analysis software | BioTek | ||
| Table 1. Table of specific reagents and equipment. | |||
References
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