Summary
G 단백질 문이 안쪽 정류기 K와 상호 작용하는 약물을 식별을위한 실시간 검사 절차
Abstract
G 단백질 문이 안쪽 정류기 K + (GIRK) 채널은 호르몬과 신경 전달 물질의 광범위한 셀룰러 중재자 역할과 뇌, 심장, 골격근 및 내분비 조직 1,2로 표현됩니다. GIRK 채널들은 플라즈마 멤브레인 바인딩된, G 단백질 결합 수용체 (GPCRs)에 (신경 전달 물질, 호르몬, 약물 등) 리간드의 바인딩에 따라 활성화된다. 이 바인딩은 이후에 바인딩하고 GIRK 채널을 활성화 G 단백질 (G i와 G O)의 자극을 초래합니다. 일단 GIRK 채널은 K의 움직임 +에서 더 많은 부정이 될 가능성이 휴식 멤브레인를 일으키는 세포의 수 있습니다 열었습니다. 결과적으로 뉴런에 GIRK 채널 인증은 자발적인 행동 잠재력의 형성을 감소하고 흥분성의 신경 전달 물질의 석방을 억제. 마음에 GIRK 채널의 활성화함으로써 심장 박동을 둔화 맥박 조정기의 활동을 억제.
여기서는 GIRK 채널의 새로운 변조기를 식별을위한 실시간 검사 분석을 설명합니다. 본 분석에서는 GIRK 채널을 표현의 연결을 AtT20 세포는 같은 비스 - (1,3-dibutylbarbituric 산)와 같은 멤브레인 가능성에 민감한 형광 염료와 함께로드됩니다 trimethine oxonol [DiBAC 4 (3)] 또는 HLB 021-152 (그림 1 ). 염료 분자 세포 (그림 1)에 강력하게 형광등 아래의 이해가된다. 치료GPCR의 리간드와 세포 열 GIRK 채널 자극. 세포의 결과 K + 유출 아웃 더 음수가 될 수있는 멤브레인 잠재력과 감소하는 형광 신호 (그림 1)을 일으 킵니다. 따라서 GIRK 채널을 통해 K + 유출을 조절 약물은 형광 플레이트 리더를 사용 assayed 수 있습니다. 다른 이온 채널 심사 assays 같은 원자 흡수 분광법 4 radiotracer 분석 5와는 달리, GIRK 채널 형광 분석은 빠른 실시간 저렴 심사 절차를 제공합니다.
Protocol
1. 세포의 준비
- 5% CO 2의 humidified 분위기에서 10 %의 목마 혈청 및 37 ° C에서 문화를 유지와 보완 Dulbecco의 수정된 이글 배지 (DMEM)에서 뇌하수체 AtT20 세포를 성장.
- 표준 trypsinization 절차를 사용하여 세포에게 5-7일마다 subculturing하여 문화를 유지합니다.
- 검정, 투명 하단의 문장은 우물, 폴리-L-라이신의 50 μL와 96 - 웰 플레이트. 우물은 인큐베이터에서 30 분 동안 건조하도록 허용합니다.
- 물론 당 30,000의 세포 밀도에서와 3-4일 동안 배양기에 세포를 저장하는 200 μL 미디어를 포함하는 96 - 웰 플레이트에 플레이트 세포를.
- 천천히 세포 단일층에서 문화 매체를 기음 한 끝에 진공에 연결된 마개 4리터 항아리와 다른 끝에 200 μL 피펫 팁으로 구성된 열망 설정을 사용합니다.
- 정상적인 완충 용액 200 μL (132 MM NaCl, 5 KCl MM, 1m로 세포를 씻어M CaCl 2, 1 밀리미터 MgCl 2, 5 밀리미터 덱스 트로 오스, 5 밀리미터 HEPES, NaOH로 pH를 7.4).
- 각도에 막 잠재적인 감광 염료 (MPD) DiBAC 4 (3) 또는 HLB 021-152 (5 μm의)를 포함하는 완충 용액 200 μL를 추가하고 37에서 40 분 대한 세포를 품어 ° C.
2. 시험 화합물과 세포 치료의 작성
- Versette (ThermoFisher) 자동 액체 처리 시스템을 사용하여 화합물 라이브러리에서 테스트 화합물의 시리얼 희석 (DMSO의 주식 = 10 밀리) (96 - 웰 형식) 준비합니다.
- , 96 - 웰 플레이트를 제거 AtT20 세포를 포함, 인큐베이터에서와 플레이트는 실내 온도로 돌아갈 수 있습니다. 오래된 버퍼를 기음과 세포에 MPD를 포함하는 새로운 버퍼 솔루션을 적용합니다.
- 액체 처리 시스템은 다양한 시험 화합물의 농도 (10 NM 10 μm의까지) (2-20 μL) 및 제어 솔루션 (0.1 % DMSO)을 (버퍼 용액 containi에 적용 사용세포를 포함하는 96 - 웰 플레이트에 NG MPD).
- 형광 측정에 대한 사전 테스트 화합물로 약 5 분 동안 세포를 품어.
3. GIRK 채널의 활성화, 형광 측정 및 분석
- Biotek Synergy2 형광 플레이트 판독기에 96 - 웰 플레이트를 삽입하고 각각 여기 및 방출 520의 파장과 560 nm의에서 형광 배경 신호를 구하십시오.
- Synergy2 인젝터 시스템을 사용 GIRK 채널을 활성화 (총 부피 = 220 μL)을 우물에 GPCR의 리간드 (somatostatin = 200 nm의 또는 carbachol이 = 10 μm의) 또는 제어 솔루션 (버퍼 혼자) (20 μL)을 적용합니다. 각각 여기 및 방출 520의 파장과 560 nm의에서 300의 샘플링 기간 동안 10의 간격으로 데이터 포인트를 수집합니다.
- 시간 코스와 Biotek Gen5 소프트웨어를 사용하여 형광 변화의 피크 진폭을 확보하고 추가 분석을 위해 Excel로 데이터를 내보냅니다. 분석의 신뢰성을 결정하는 Z' 팩터를 계산합니다. Z' 팩터 결정에 사용되는 플레이트는 2 행 긍정의 각 (GPCR의 리간드)과 부정 (버퍼 혼자) 컨트롤이 포함되어 있습니다. Z' 팩터과 같이 정의됩니다 : Z '= 1 - (3σ P + 3σ N) / | μ의 P - μ N | μ P & μ N은 긍정적인 제어 및 부정적인 제어 신호의 수단입니다, 그리고 σ P는 & σ N 긍정적인 컨트롤의 표준 편차와 부정적인 제어 신호를 각각 6 있습니다. 0.5-1.0의 범위에서 Z' - 요인 분석의 품질 6 우수한 것으로 나타났습니다. 0.5 아래 Z'-요인과 플레이트는 분석에서 제외됩니다.
- 형광 신호를 변조 화합물은 내향 정류기 K + 채널 특이성을 확인하는 바 2의 존재 + 또는 tertiapin-Q에 retested됩니다.
4. Representative 결과
GIRK 채널 분석을 사용하여 측정된 형광 신호의 예제는 그림 2에 표시됩니다. AtT20 세포 GPCR의 리간드 somatostatin (200 NM)의 추가는 HLB 021-152 형광 신호의 빠른 시간 종속적인 감소 (그림 2) 발생했습니다. 대조적으로, 제어 솔루션의 첨가 시간 (그림 2) 기준선에 반환되는 형광의 작은 순간적인 상승을 생산했다. 제어 및 somatostatin 솔루션으로 주입 96 - 웰 플레이트에서 최대 형광 값의 비교는 0.7에 0.5의 범위에서 Z'-요인을 주었다. 자세한 부량 들어, 제어 레코드는 somatostatin 레코드에서 빼는되었고 결과 somatostatin에 민감한 신호는 (그림 2) 분석했다.
분석은 신속하게 GIRK 채널 조절 약물을 식별하는 방법을 제공합니다. 예를 들어, 마약 GIRK 차를 억제 그nnel는 세포에서 K + 유출을 방지하여 형광의 GPCR 리간드 - 중재 감소을 감소해야합니다. 차단 GIRK 채널 7, somatostatin-매개 형광 변화의 억제를 생산하는 그림 3, tertiapin-Q, 독소와 세포 치료에 나와 있습니다. Propafenone, 심장 8 블록 GIRK 채널도 형광 변화 (그림 4)를 저해하는 안티 arrhythmic 약물. 분석은 또한 GIRK 채널의 activators을 식별하는 데 유용할 수 있습니다. 용액 (P> 0.5)을 제어할 비해 그러나 에탄올의 응용 (100 & 200 MM)는 GIRK 채널 2,3의 활성은 형광 신호의 큰 변화도 원인이 없습니다.
그림 1. GIRK 채널 형광 분석의 실험적 디자인. AtT20 세포 membran를 포함하는 버퍼에 incubated 있습니다전자 가능성에 민감한 형광 염료 (D). 염료 분자 세포에 입력하고 세포 내 단백질 (맨 위 패널)에 바인딩시 형광된다. 은 GPCR로 (Som) somatostatin의 바인딩 GIRK 채널 (하단 패널)의 활성화를 일으키는 G 억제 단백질을 (G I) 자극. K는 세포 밖으로 +의 후속 유출은 세포를 종료 것이 더 부정적와 염료 분자가 될 멤브레인 잠재됩니다. 따라서 형광 신호 감소 (하단 패널).
somatostatin 또는 제어 솔루션뿐만 동안 AtT20 세포에서 시간이 지남에 따라 측정 그림 2. 대표 HLB 021-152 형광 신호. 형광 강도 (F / F O)의 비율 (F O) 광고를하기 전에 측정 기준 신호에 의한 somatostatin의 존재 (F) (또는 제어 솔루션)의 신호를 나누어 계산somatostatin의 dition (또는 제어 솔루션). 각 포인트는 평균 ± SE 5-6 우물에서 얻어진을 나타냅니다. Somatostatin 또는 제어 솔루션은 시간이 영 (↓)에 추가되었습니다. 제어 솔루션의 추가는 형광 신호의 작은 과도 증가를 일으켰습니다. 이것은 솔루션의 주입에 의한 온도 변화에서 발생했습니다.
그림 3. tertiapin-Q (500 NM)와 AtT20 세포 치료로 묶는 방식과 GIRK 채널을 차단하여 형광 신호의 somatostatin-매개 감소를 억제. 각 포인트는 평균 ± SE 4-6 우물에서 얻어진을 나타냅니다. Somatostatin 시간이 영 (↓)에 추가되었습니다.
그림 4. propafenone (20 μm의)와 AtT20 세포의 치료도에서 somatostatin-매개 감소를 억제형광 신호. 각 포인트는 평균 ± SE 5-6 우물에서 얻어진을 나타냅니다. Somatostatin 시간이 영 (↓)에 추가되었습니다.
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Discussion
막 잠재력에 민감한 형광 염료가 이온 채널 조절 약물 9,10을 식별하는 데 사용되었습니다 있지만, 이것의 연결을 GIRK 채널 약물 발견에 대한 자신의 응용 프로그램의 첫 번째 보고서이다. 여기서 제시 GIRK 채널 형광 분석은 리간드 게이트 K + 채널의 심사를위한 빠르고, 신뢰할 수있는 실시간 방식을 제공합니다. 검정은 외인성 재조합 GIRK 채널 11 clonal 셀 라인 (AtT20, PC-12) 내생 채널을 표현하는 표현을 영원히 기억 세포 라인 (HEK293, CHO 등)을 포함한 세포의 광범위한 사용하기 위해 수정할 수 있습니다. 또한, 분석 결과는 배아 줄기 세포 및 기본 세포 배양의 심사 의약품에 대한 적응 수 있습니다. AtT20 세포와 함께 사용로서 분석도 GIRK 채널에 여러 GPCR의 리간드 (somatostatin 및 carbachol)의 연구를 허용하는 추가 혜택을 제공합니다. 어떤 형광 분석과 마찬가지로 제어 실험은 전자로 수행되어야합니다자동 형광 더 복잡하고 염료 분자와 화합물의 직접적인 상호 작용으로 인한 오류를 식별하기 때문에 유물을 liminate. 이러한 탈륨 유입 분석 11 자동 패치 클램프 절차 12와 같은 대체 방법도 고려되어야합니다.
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Disclosures
관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 미국 공중 보건 서비스 상을 NS-071530에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Cellgro | 10-013 | |
| Horse serum | Invitrogen | 16050-114 | |
| 96-well plates | Corning | 3603 | |
| Poly-l-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| Somatostatin | Sigma-Aldrich | S9129 | |
| Carbachol | Sigma-Aldrich | C4382 | |
| HLB 021-152 | AnaSpec | 89300 | |
| Versette automated liquid handler | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 650-01 | |
| Synergy2 fluorescent plate reader | BioTek | ||
| Gen5 analysis software | BioTek | ||
| Table 1. Table of specific reagents and equipment. | |||
References
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