Summary
En i realtid screening för identifiering läkemedel som interagerar med G-protein-gated inåt likriktare K
Abstract
G-protein-gated inåt likriktartransistorerna K + (GIRK) kanaler fungerar som cellulära mediatorer av en mängd olika hormoner och neurotransmittorer och uttrycks i hjärna, hjärta, skelettmuskel och endokrin vävnad 1,2. GIRK kanaler aktiveras till följd av bindning av ligander (neurotransmittorer, hormoner, läkemedel, etc) till sin plasma membranbunden, G-proteinkopplade receptorer (GPCR). Denna bindning orsakar stimulering av G-proteiner (G ^ och G ^) som därefter binder till och aktiverar GIRK kanalen. När öppnade GIRK kanalen tillåter förflyttning av K + ut ur cellen som orsakar vilande membranpotentialen blir mer negativ. Som en följd minskar GIRK kanalaktivering i neuroner spontan bildning aktionspotential och inhiberar frisättning av excitatoriska neurotransmittorer. I hjärtat hämmar aktivering av GIRK kanalen pacemakern verksamheten och därigenom bromsa hjärtfrekvensen.
Här beskriver vi ett realtid screeningsanalys för att identifiera nya modulatorer av GIRK kanaler. I denna analys är neuronala AtT20 celler, som uttrycker GIRK kanaler, laddad med membranpotential-känsliga fluorescerande färgämnen, såsom bis-(1,3-dibutylbarbituric syra) trimethine oxonol [DiBAC 4 (3)] eller HLB 021-152 (figur 1 ). De färgmolekyler bli starkt fluorescerande efter upptag in i cellerna (Figur 1). Behandlingav cellerna med GPCR-ligander stimulerar GIRK kanaler för att öppna. Den resulterande K + utflöde ur cellen orsakar membranet kan bli mer negativ och den fluorescerande signalen för att minska (figur 1). Således kan läkemedel som modulerar K ^-utflöde genom GIRK kanalen skall analyseras med användning av en fluorescerande plattläsare. Till skillnad från andra screening-jonkanal-analyser, som atomabsorptionsspektrometri 4 eller radiotracer analys 5 ger GIRK kanalen fluorescerande analys en snabb, realtid och billigt urvalsförfarande.
Protocol
1. Beredning av celler
- Växa hypofysen AtT20 celler i Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) kompletterat med 10% hästserum och bibehålla kulturer vid 37 ° C i en fuktad atmosfär av 5% CO2.
- Bibehåll kulturen genom subkultur cellerna var 5 till 7 dagar med en vanlig trypsinisering förfarande.
- Belägga brunnarna i svart och klar botten och 96-brunnsplattor med 50 ^ il av poly-L-lysin. Tillåta brunnarna torka under 30 min i inkubatorn.
- Plattan cellerna i 96-brunnsplattor innehållande 200 | il medium vid en densitet av 30.000 celler per brunn och lagra cellerna i inkubator under 3-4 dagar.
- Använda en strävan konfiguration, bestående av en propp 4 liters kärl anslutet till ett vakuum på ena änden och en 200 mikroliter pipettspets vid den andra änden, för att långsamt aspirera odlingsmediet från cellmonoskiktet.
- Tvätta cellerna med 200 | il av normal buffertlösning (132 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 5 mM dextros, 5 mM HEPES, pH 7,4 med NaOH).
- Tillsätt 200 pl buffertlösning innehållande membranpotentialen-känsligt färgämne (MPD) DiBAC 4 (3) eller HLB 021-152 (5 pM) till varje brunn och inkubera cellerna under 40 min vid 37 ° C.
2. Beredning av testföreningar och cellbehandling
- Bered en seriell utspädning av testföreningar (lager = 10 mM i DMSO) från en förening bibliotek (i 96-brunnsformat) med användning av en Versette (ThermoFisher) automatisk vätskehanteringssystem.
- Avlägsna 96-brunnsplatta innehållande de AtT20 celler, från inkubatorn och tillåta plattan för att återgå till rumstemperatur. Aspirera bort den gamla bufferten och applicera färsk buffertlösning innehållande MPD till cellerna.
- Med användning av vätskehanteringssystem applicera olika koncentrationer (10 nM till 10 pM) av testföreningarna (2 till 20 | il) och kontrollösningar (0,1% DMSO) (i buffertlösning containing MPD) till 96-brunnsplattan innehållande cellerna.
- Inkubera cellerna i 5 minuter med testföreningar före de fluorescerande mätningar.
3. Aktivering av GIRK kanaler, Lysrör Mätning och analys
- Sätt i 96-brunnars platta i en Biotek Synergy2 fluorescerande plattläsare och erhålla den fluorescerande bakgrund-signal vid excitations-och emissionsvåglängder av 520 och 560 nm, respektive.
- Tillämpa GPCR-ligander (somatostatin = 200 nM eller karbakol = 10 | iM) eller kontrollösningen (endast buffert) (20 | il) till brunnarna (total volym = 220 | il) för att aktivera GIRK kanalerna med hjälp av Synergy2 injektorsystem. Samla datapunkter vid 10 s intervaller under en 300 s samplingsperiod vid excitations-och emissionsvåglängder av 520 och 560 nm, respektive.
- Skaffa tidsförloppet och topp amplituden av det fluorescerande förändringar med hjälp av Biotek Gen5 mjukvara och exportera data till Excel för vidare analys. Beräkna Z'-faktor för att bestämma tillförlitligheten hos analysen. Plattor som används för Z'-faktor bestämning innehöll 2 rader vardera positiva (GPCR ligand) och negativa (buffert enbart) kontroller. Den Z'-faktorn definieras som: Z '= 1 - (3σ P + 3σ N) / | μ P - μ N |, där μ P & μ N är medlen för den positiva kontrollen och negativa styrsignaler och o P & o N är standardavvikelserna från den positiva kontrollen och negativa styrsignaler respektive 6. Z'-faktorer i området av 0,5 till 1,0 indikera att kvaliteten hos analysen är utmärkt 6. Plattor med Z'-faktorer under 0,5 är uteslutna från analysen.
- Föreningar som modulerar den fluorescerande signalen återtestades i närvaro av Ba 2 + eller tertiapin-Q för att bekräfta inåt likriktaren K ^-kanal-specificitet.
4. Representative Resultat
Ett exempel på den fluorescenssignal mäts med användning av GIRK kanalen analys visas i Figur 2. Tillsatsen av GPCR-ligandaktivitet somatostatin (200 nM) till AtT20 celler orsakade en snabb, tidsberoende minskning i HLB 021-152 fluorescerande signalen (fig 2). I motsats härtill producerade tillsats av kontrollösningen en liten momentana ökning av fluorescensen som med tiden återgått till baslinjen (figur 2). Jämförelse av topp fluorescerande värden i 96-brunnsplattor som injicerats med kontroll och lösningar somatostatin gav en Z'-faktorer i området 0,5 till 0,7. För ytterligare kvantifiering var kontrollen posten subtraheras från somatostatin posten och den resulterande somatostatin-känsliga signalen analyseras (figur 2).
Analysen tillhandahåller en metod för att snabbt identifiera läkemedel som modulerar GIRK kanaler. Exempelvis kan läkemedel som hämmar GIRK channel bör minska GPCR-ligand-medierad minskningar i fluorescens genom att förhindra K ^ utflöde från cellerna. Såsom visas i figur 3, behandling av cellerna med tertiapin-Q, ett toxin som blockerar GIRK kanaler 7, gav en hämning av somatostatin-medierad fluorescens förändras. Propafenon, en antiarytmiska läkemedlet som blockerar GIRK kanaler i hjärtat 8, också hämmas av det fluorescerande förändring (figur 4). Analysen kan också vara användbara för att identifiera aktivatorer av GIRK kanalen. Emellertid tillämpning av etanol (100 & 200 mM), orsakade en aktivator av GIRK kanalen 2,3, ingen signifikant förändring i den fluorescerande signalen jämfört med kontroll-lösning (p> 0,5).
Figur 1. Experimentell utformning GIRK kanalen fluorescensanalys. AtT20 celler inkuberas i buffert innehållande ett membrane potential känsliga fluorescerande färgämne (D). De färgmolekyler in i cellerna och blir fluorescerande vid bindning till intracellulära proteiner (övre panelen). Bindning av somatostatin (SOM) till dess GPCR stimulerar G-inhiberande protein (Gi) som orsakar aktiveringen av GIRK kanalen (nedre panelen). Den efterföljande utflöde av K + ut ur cellerna orsakar att membranet kan bli mer negativ och färgmolekyler att avsluta cellerna. Som ett resultat av den fluorescerande signalen minskar (nedre panelen).
Figur 2. Representativa HLB 021-152 fluorescenssignal mäts över tiden i AtT20 celler under tillsats av somatostatin eller kontrollösningen. Förhållandet mellan den fluorescerande intensiteten (F / Fq) beräknades genom att dividera signal i närvaro (F) av somatostatin (eller kontroll-lösning) av baslinjen signalen mättes före (Fq) adsättning av somatostatin (eller kontroll-lösning). Varje punkt representerar medelvärdet ± SE erhållen i 5-6 brunnar. Somatostatin eller kontroll-lösning tillsattes vid tidpunkten noll (↓). Tillsatsen av kontroll-lösning gav en liten övergående ökning i fluorescenssignal. Detta resulterade från en temperaturförändring som orsakas genom injektion av lösningen.
Figur 3. Behandling av AtT20 celler med tertiapin-Q (500 nM) hämmar somatostatin-förmedlade minskningen i den fluorescerande signalen genom att binda till och blockera GIRK kanaler. Varje punkt representerar medelvärdet ± SE erhållen i 4-6 brunnar. Somatostatin tillsattes vid tidpunkten noll (↓).
Figur 4. Behandling av AtT20 celler med propafenon (20 pM) hämmar också somatostatin-förmedlade minskningen iden fluorescerande signalen. Varje punkt representerar medelvärdet ± SE erhållen i 5-6 brunnar. Somatostatin tillsattes vid tidpunkten noll (↓).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Medan membranpotential-känsliga fluorescerande färgämnen har använts för att identifiera läkemedel som modulerar jonkanaler 9,10, detta är den första rapporten av deras ansökan om neuronal GIRK kanalen läkemedelsutveckling. Den GIRK kanalen fluorescerande analys som presenteras här ger en snabb, pålitlig och i realtid metod för screening av ligand-gated K +-kanaler. Analysen kan modifieras för användning med en mängd olika celler innefattande immortaliserade cellinjer (HEK293, CHO, etc) som uttrycker ett exogent rekombinant GIRK kanal 11 eller klonala cellinjer (AtT20, PC-12) som uttrycker en endogen kanal. Dessutom kan analysen anpassas för screening av läkemedel i embryonala stamceller och primära cellkulturer. Som används med de AtT20 celler möjliggör provet även den extra fördelen att den studie av multipla GPCR-ligander (somatostatin och karbakol) på GIRK kanalen. Som med alla fluorescerande analys, måste kontrollexperiment utförs för att skicka eliminate artefakter på grund av sammansatta auto-fluorescens och för att identifiera fel som följd av direkt interaktion mellan de föreningar med färgämnet molekyler. Alternativa metoder som tallium inflödet analysen 11 och automatiserad patch clamp förfarandet 12 bör också övervägas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av US Public Health Service Award NS-071.530.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Cellgro | 10-013 | |
| Horse serum | Invitrogen | 16050-114 | |
| 96-well plates | Corning | 3603 | |
| Poly-l-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| Somatostatin | Sigma-Aldrich | S9129 | |
| Carbachol | Sigma-Aldrich | C4382 | |
| HLB 021-152 | AnaSpec | 89300 | |
| Versette automated liquid handler | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 650-01 | |
| Synergy2 fluorescent plate reader | BioTek | ||
| Gen5 analysis software | BioTek | ||
| Table 1. Table of specific reagents and equipment. | |||
References
- Hibino, H. Inward rectifying potassium channels: their structure, function and physiological roles. Physiol. Rev. 90, 291-366 (2010).
- Lusscher, C., Slesinger, P. A. Emerging roles for G protein-gated inwardly rectifying potassium (GIRK) channels in health and disease. Nat. Rev. Neurosci. 11, 301-315 (2010).
- Kobayashi, T., Ikeda, K. G protein-activated inwardly rectifying potassium channels as potential therapeutic targets. Cur. Pharm. Des. 12, 4513-4523 (2006).
- Terstappen, G. C. Functional analysis of native and recombinant ion channels using a high-capacity nonradioactive rubidium efflux assay. Anal. Biochem. 272, 149-155 (1999).
- Cheng, C. S. A high-throughput HERG potassium channel function assay: an old assay with a new look. Drug Dev. Ind. Pharm. 28, 177-191 (2002).
- Zhang, J. -H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).
- Jin, W., Lu, Z. A novel high-affinity inhibitor for inward-rectifier K+ channels. Biochem. 37, 13291-13299 (1998).
- Inomata, N. Anti-arrhythmic agents act differently on the activation phase of the Ach-response in guinea pig atrial myocytes. Br. J. Pharmacol. 108, 111-116 (1993).
- Tang, W. Development and evaluation of high throughput functional assay methods for HERG potassium channel. J. Biomol. Screen. 6, 325-331 (2001).
- Wolff, C., Fuks, B., Chatelain, P. Comparative study of membrane potential-sensitive fluorescent probes and their use in ion channel screening assays. J. Biomol. Screen. 8, 533-513 (2003).
- Niswender, C. M., Johnson, K. A., Luo, Q., Avala, J. E., Kim, C., Conn, P. J., Weaver, C. D. A novel assay of Gi/o-linked G protein-coupled receptor coupling to potassium channels provides new insights into the pharmacology of group III metabotropic glutamate receptors. Mol. Pharm. 73, 1213-1224 (2008).
- Bridal, T. R., Marquilis, M., Wang, X., Donio, M., Sorota, S. Comparison of human Ether-á-go-go related gene screening assays based on IonWorks Quattro and thallium flux. Assay Drug Dev. Technol. 8, 755-765 (2010).
