Summary
قياس المثانة هي تقنية فعالة لقياس وظيفة المثانة من الحيوانات الصغيرة
Abstract
Protocol
1. مختبر الحيوانات
- ويضم الحيوانات (الفئران والجرذان) في منشأة متخصصة الحيوانية مع ضوء الظلام دورة 12-HR والإعلان باستمرار طيلة فترة التجربة الوصول إلى المياه والغذاء الكريات القياسية. كل سن وجنس الحيوانات المعالم الهامة التي يجب أن تكون موحدة وفقا لاحتياجات. نقوم عادة قياس المثانة في 10 - 12 أسبوعا من العمر 5،6 إناث الحيوانات.
- يتم تنفيذ جميع التجارب على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية للاتحاد الأوروبي ومجلس الجالية التي وافقت عليها لجنة الأخلاقيات المحلية.
2. خدر
- يتم استخدام التخدير Isoflurane لأداء العمليات الجراحية الصغيرة، حيث أنه من السهل أن جرعة قصيرة بسبب عمرها النصفي. المناسبة الغاز النفايات الكسح من الضروري عند استخدام isoflurane.
- توضع الحيوانات في صندوق مغلق، بالغاز مع 5٪ isoflurane في الأكسجين النقي (1 لتر / دقيقة).
- بعد التخدير، والحث على لتر المناسبةيتم الاحتفاظ من قبل إيفل قناع صغير (قطع حقنة مل 10) من 0،8 حتي 1 لتر / دقيقة الأكسجين مع 1 - 1.5٪ من isoflurane.
- بالنسبة للفئران، ويستخدم التخدير يوريتان خلال التسجيلات الفنية (cfr. أدناه). يتم استخدام التخدير يوريتان خلال التسجيلات الفنية، لأنه على عكس معظم عقاقير التخدير أخرى، لا يتم منع منعكس التبول قبل هذا الوكيل مخدر 4. إدارة يوريتان 1.2 غرام من وزن الجسم / كغ تحت الجلد (SC) 60 دقيقة قبل بدء التسجيلات. إذا لزم الأمر، يمكن معاير جرعة من يوريتان اللازمة للحصول على التخدير المناسب من قبل إدارة جرعات إضافية (0.1 جم / كجم) تحت الجلد. وتجدر الإشارة، مع ذلك، قد يغير هذا التخدير إضافية كفاءة وبالتالي يفرغ تواتر التبول 7،8. وبالتالي، ينبغي أن تراقب عن كثب cystometric التسجيلات والتخلص منها كلما لاحظت انحرافات كبيرة عن سلوك السيطرة. لا ينبغي أن تدار التخدير بينما الاختباريتم تطبيق المركبات لتجنب سوء تفسير البيانات.
3. إجراء العمليات الجراحية - قسطرة المثانة زراعة
- يتم تعقيم الأدوات الجراحية في الأوتوكلاف قبل استخدامها. حلق البطن من الحيوان، مع تطهير 70٪ من الإيثانول وإجراء البطن خط الوسط الأقل إلى فضح المثانة.
- تحت المجهر الجراحي، ضع خياطة محفظة سلسلة في قبة المثانة باستخدام غير قابل للامتصاص خياطة حيدة، (حجم 6-0).
- إجراء فغر المثانة الصغيرة (التي نستخدمها بشكل تفضيلي إبرة G 18) داخل السلسلة محفظة وإدراج القسطرة البولي اثيلين PE 50، مع صفعة صغيرة في نهاية (التي تم الحصول عليها عن طريق تسخين بعناية أنابيب) من خلال هذا الثقب. في أيدينا، أرق أنابيب (PE 10) لديها مقاومة أعلى وأكثر متغير. ويمكن تطهيرها الأنبوب وذلك بوضعها في محلول الإيثانول 70٪ أو تعقيمها في الأوتوكلاف. قبل زرع، ينبغي مسح أنابيب بمحلول ملحي.
- تأمين شارع محفظةجي حول أنبوب مع عقدة الجراح. سحب القسطرة يتم وضع الخارج بلطف حتى تلميح على شكل جرس الحق تحت خياطة. دفع قطعة من القسطرة G 18 نحو لمنع تسرب خياطة.
- ضخ كمية صغيرة من المياه المالحة (100 - 200 ميكرولتر) بلطف للتأكد من وجود تسرب. إذا تسرب موجودة، يجب وضع لخياطة إضافية.
- إغلاق عضلات البطن باستخدام الخيوط الجراحية حيدة، وترك ممر للقسطرة في الجزء العلوي من شق.
- النفق الأنبوب إلى المنطقة بين الكتفين باستخدام قضيب معدني أجوف، وبالتالي منع الحيوانات لدغة الأنبوب أثناء التجربة.
- يتم إغلاق الجلد باستخدام الخيوط الجراحية القابلة للامتصاص غير حيدة. يتم مسح القسطرة مزروع مع المالحة للتحقق من نفاذية لها.
- قبل الحيوانات توقظ، يتم إعطاء المسكنات تحت الجلد (البوبرينورفين، 0.05 ملغ / كلغ).
4. إعداد وقياس المثانة
- اعتمادا على questi التجريبيةعلى (والأنواع المستخدمة) يتم تنفيذ قياس المثانة في مستيقظا (ضبط النفس أو عدم تقييد) أو تخدير يوريتان-الحيوانات. في حين قياس المثانة قابل للتطبيق تماما في الفئران واعية، والتي تميل إلى الهدوء في بيئة ضبط النفس، ونقوم عادة تحت التخدير يوريتان قياس المثانة (1.2 ملغم / كغم، تحت الجلد) عند استخدام الفئران 3،5،6،9.
- في الفئران تخدير، ويتم رصد درجة حرارة الجسم باستمرار والاحتفاظ بها في 36،5 ° C ± 0.2 ° C عن طريق تحقيق درجة الحرارة ومصباح التدفئة.
- ومعايرة انشاء قبل كل تجربة وفقا لتعليمات الصانعين.
- يتم توصيل قسطرة مزروع من قبل كعب الأنبوب إلى الصنبور 3-الطريقة، التي يتم توصيلها إلى محول الضغط (إدواردز علوم الحياة) من جهة، ومضخة التسريب من جهة أخرى (هارفارد جهاز). توصيل محول الضغط عبر مكبر للصوت (78534c مراقب، وهيوليت باكارد) لنظام الحصول على البيانات (DI-730-USB، Dataq الصكوك) وشارك فيmputer. ويمكن استخدام Windaq / لايت برنامج للتسجيل.
- بدء تشغيل مضخة التسريب، وتمكن من ضخ المياه المالحة أو في برنامج تلفزيوني، على سبيل المثال، 100 ميكرولتر / دقيقة (في الفئران) أو 20 ميكرولتر / دقيقة (في الفئران). كما سيتم شغل هذه المثانة بمعدل ثابت، في حين يتم تسجيل الضغط داخل المثانة.
- الشكل 5 يصور أثر الضغط النموذجية: ضخ السوائل خلال، هناك تراكم الضغط في المثانة بطيئة، حتى يتم التوصل إلى حجم معين / ضغط، عتبة التبول. مرة واحدة يتم التوصل إلى هذا الحد، والمثانة، وبعد ذلك سوف العقد العضلة العاصرة البولية سيتم فتح، والسماح للمرور البول من خلال مجرى البول. على هذا النحو، يتم إفراغ المثانة، ووقف الانكماش والضغط سوف ينخفض مرة أخرى إلى مستوى "القاعدية".
- كما يتم وضع الفئران في قفص الأيضية والتوازن فوق رقمي، يمكن قياس حجم البول في وقت واحد، تعطي معلومات عن حجم باطلة. نظرا لصغر حجم باطلة في ميلم، ويمكن أن تكون صعبة للغاية باستخدام هذا النظام. لذلك، يتم تحديد حجم البول باستخدام أوراق الترشيح الصغيرة وزنه قبل وبعد يفرغ.
- عادة، تركنا النظام تتوازن لمدة 30 دقيقة، تليها فترة تسجيل 30 دقيقة. ثم، يمكن إعطاء الأدوية بشكل منتظم أو intravesically وتسجل آخر 30 دقيقة.
- يمكن تصدير البيانات المسجلة على هيئة ملفات CSV. التي يمكن استيرادها إلى برامج متخصصة للتحليل الكمي. ونحن عادة استخدام المنشأ (شركة OriginLab، MA، الولايات المتحدة الأمريكية).
- بعد التجارب، وضحت من قبل خلع عنق الرحم الحيوانات (الفئران) أو تسمم CO 2 (الفئران).
5. ممثل النتائج
الشكل 1. نظرة عامة البطن. A) ضع الفئران في موقف ضعيف. B) الحلاقة وإعداد antiseptically الموقع الجراحية. C) شق في الجلد. D) شق سو عضلات البطن، والتعرض المثانة.
الشكل 2. A خياطة محفظة السلسلة.
الشكل 3. غرس قسطرة.
الشكل 4. حفر الأنفاق للقسطرة.
وترد أمثلة على قياسات ضغط عليها خلال نضح إينترفسكل من المياه المالحة في الفئران واعية والماوس تخدير في الشكل 5. ويمكن استخراج معلمات متعددة من إشارة الضغط (على سبيل المثال الفاصل intercontractile، والضغط خط الأساس وعتبة الضغط). للحصول على وصف شامل لهذه المعايير، الرجاء راجع أندرسون وآخرون (المرجع 4) وYoshiyama وآخرون. ( المرجع 10).
وقد استخدمنا قياس المثانة مؤخرا لتحديد الأهداف الجزيئية من زيت الخردل (MO)، وهو مركب شديد التفاعل التي استخدمت طويلا في نماذج تجريبية من الالتهاب وفرط التألم من أجهزة الحشوي مثل المثانة البولية 11،12. التسريب الناجم إينترفسكل من 10 ألف ملي MO زيادة كبيرة في وتيرة يفرغ (النقص في الفترة الفاصلة intercontractile) في الفئران البرية نوع (الشكل 6A، B) وانخفاض حجم باطلة 6. ومن المثير للاهتمام، MO الناجمة تغييرات مماثلة في الفئران خلل في مستقبلات MO TRPA1. في المقابل، بفعل التغيرات MO أضعف بكثير في cystometric المعلمات في الفئران KO TRPV1 من الفئران في WT وكان دون أي تأثير في الفئران KO Trpa1/Trpv1. جنبا إلى جنب مع قياسات الافراج عن الجينات كالسيتونين الببتيد ذات الصلة (CGRP) 6، تشير هذه البيانات إلى إثبات أن TRPV1 قد تلعب دورا رئيسيا في تهيج الحشوي الناجم عن MO.
ve_content ">
الشكل 5. آثار ممثل الضغط داخل المثانة سجلت في الفئران الإناث واعية (A) والإناث في الماوس لتخدير (B). ويعرف ضغط أقل باسم "الضغط الأساسي" (الأسهم الحمراء). تم وضع علامة على الضغط في نهاية المرحلة ملء مع الأسهم الزرقاء. حجم السوائل التي غرست بين هذه النقاط، مقسوما على فرق الضغط، ويسمح حساب الامتثال للجدار المثانة (الامتثال = غرست حجم / (عتبة الضغط - الضغط الأساسي) و"الفاصل الزمني intercontractile" (ICI) هو الوقت بين 2 تقلصات يفرغ.
الشكل 6. آثار تطبيق إينترفسكل من زيت الخردل على نمط قياس المثانة في نوع البرية والفئران خروج المغلوب Trpa1، وTRPV1 Trpa1/Trpv1.(A) أمثلة ممثل تغيرات الضغط داخل المثانة سجلت في WT، KO Trpa1، KO TRPV1 والفئران KO Trpa1/Trpv1 ردا على ضخ MO ملي المالحة و 10. (B) طبعا وقت وتيرة يفرغ حظية المتوسط قبل وأثناء ضخ إينترفسكل من MO. لجميع الفئران، تم تطبيع البيانات إلى تردد متوسط تم الحصول عليها خلال ضخ المالحة. ويتم تكييف هذه البيانات من وآخرون Everaerts. (المرجع 6)، بإذن من السيفير.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تقنية قياس المثانة المقدمة هنا يسمح أداء قياسات الجسم الحي في وظيفة المثانة في النماذج الحيوانية. الفئران هي على الأرجح الأكثر استخداما نموذج حيواني. الفئران هي أكثر صعوبة في التعامل معها، ولكن تقدم ميزة استخدام الحيوانات التلاعب وراثيا. بسبب صعوبة استخدام التقنية الفئران واعية، والتي تميل إلى أن تكون نشطة للغاية مما أدى إلى تخفيف زرع القسطرة والتغيرات في الضغوط داخل البطن التي قد تؤثر على الضغط داخل المثانة، فإننا ننصح للحفاظ على تخدير مع يوريتان خلال قياس المثانة الكامل البروتوكول. وبالطبع، فإن فوائد وجود الفئران مخدرا، ينبغي أن يكون وزنه ضد آثار التخدير. على هذا النحو، يمكن أن يكون لها تأثير يوريتان كبير على بعد 7،8 يفرغ حجم المتبقية. ولذلك ننتظر حتى نحصل على درجة مستقرة من التخدير، وقبل أن نبدأ لدينا تسجيلات والتدخلات.
يجب على الباحثين النظر في رانه الفرق بين التبول القوارض الذكور والإناث 13. أيضا، عمر الحيوانات له أهمية كبيرة. نقوم قياس المثانة في الحيوانات التي هي 10 - 12 أسبوعا من العمر. يجب أن يتم تنفيذ جميع التجارب في بيئة هادئة، خاصة عند استخدام الحيوانات واعية. وقد وصف عدد من معدلات التسريب لدينا نماذج حيوانية. ونحن عادة استخدام معدلات ضخ 20 ميكرولتر / دقيقة بالنسبة للفئران و 100 ميكرولتر / دقيقة بالنسبة للفئران.
كما ذكر أعلاه، التبول في البشر والقوارض تختلف اختلافا كبيرا. على سبيل المثال، ATP هو المساهم الرئيسي في تقلص النافصة في الفئران والجرذان، في حين أنه في البشر، وتوسط أساسا تقلص المثانة، في ظل الظروف الفسيولوجية التي كتبها أستيل 4. ومع ذلك، فإن الاحتمالات لأداء قياسات الغازية التي هي باهظة عموما في سياق السريرية واستخدام الحيوانات المعدلة وراثيا، والسماح استكشاف الحدود الحالية من الفيزيولوجيا المرضية لالمثانةد الصيدلة. وفي هذا الصدد، تم الحصول عليها مؤخرا تقدما كبيرا في توضيح دور المسكارينية البروستاجلاندين، 14 15 والمستقبلات الأدرينالية 16، نيوروببتيد 17، كا 2 + K + تنشيط قنوات 18 و TRP قنوات 3،5،6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من الحكومة الاتحادية البلجيكية (IUAP P6/28)، ومؤسسة أبحاث الفلاندر (FWO) (G.0565.07 وG.0686.09)، وجائزة المؤسسة الأوروبية Astellas 2009 ومجلس البحوث التابع لوفين KU (GOA 2009/07، وEF/95/010 PFV/10/006). PU، ونحن زملاء الدكتوراه من مؤسسة أبحاث الفلاندر (FWO). MB هو زميل ماري كوري. DDR زميل الأساسية السريرية من FWO.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| urethane | Urethane, Sigma-Aldrich | 315419 | group 2B carcinogen |
| isoflurane | Isoba, Schering-Plough Animal Health | ||
| polyethylene catheter | Intramedic Polyethylene tubing PE50, Becton Dickinson | 427411 | |
| surgical microscope | Op-Mi 6, Carl Zeiss | Op-Mi 6 | |
| purse-string suture | Prolene 6/0, Ethicon | 8610H | |
| fascia and skin suture | Ethilon 4/0 or 5/0, Ethicon | 662G or 661G | |
| postoperative analgesics | Temgesic, Schering-Plough Animal Health | dosage for rats: 0.05 mg/kg | |
| amplifier | 78534c monitor, Hewlett Packard | ||
| analytical balances and balance data acquisition software | FZ 300i, A&D | FZ-300i | |
| infusion pumps | pump 33, Harvard apparatus | HA33 | |
| cystometry recording system | Dataq instruments, DI-730 series and Windaq/Lite | DI-730-USB Windaq/Lite | |
| temperature registration | Fluke 52 KJ thermometer | 52 KJ | |
| pressure transducers | Edwards Lifesciences, pressure monitoring set | T322247A |
References
- Everaerts, W., Gevaert, T., Nilius, B., De Ridder, D. On the origin of bladder sensing: Tr(i)ps in urology. Neurourol. Urodyn. 27, 264-2673 (2008).
- Fry, C. H. Animal models and their use in understanding lower urinary tract dysfunction. Neurourol. Urodyn. 29, 603-608 (2010).
- Gevaert, T. Deletion of the transient receptor potential cation channel TRPV4 impairs murine bladder voiding. J. Clin. Invest. 117, 3453-3462 (2007).
- Andersson, K. E., Soler, R., Fullhase, C. Rodent models for urodynamic investigation. Neurourol. Urodyn. 30, 636-646 (2011).
- Everaerts, W. Inhibition of the cation channel TRPV4 improves bladder function in mice and rats with cyclophosphamide-induced cystitis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 19084-19089 (2010).
- Everaerts, W. The capsaicin receptor TRPV1 is a crucial mediator of the noxious effects of mustard oil. Curr. Biol. 21, 316-321 (2011).
- Yoshiyama, M., Roppolo, J. R., Thor, K. B., de Groat, W. C. Effects of LY274614, a competitive NMDA receptor antagonist, on the micturition reflex in the urethane-anaesthetized rat. Br. J. Pharmacol. 110, 77-86 (1993).
- Yoshiyama, M., Roppolo, J. R., de Groat, W. C. Effects of MK-801 on the micturition reflex in the rat--possible sites of action. J. Pharmacol. Exp. Ther. 265, 844-850 (1993).
- Boudes, M. Functional Characterization of a Chronic Cyclophosphamide-Induced Overactive Bladder Model in mice. Neurourol. Urodyn. , (2011).
- Yoshiyama, M. Sex-related differences in activity of lower urinary tract in response to intravesical acid irritation in decerebrate unanesthetized mice. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 295, R954-R960 (2008).
- McMahon, S. B., Abel, C. A model for the study of visceral pain states: chronic inflammation of the chronic decerebrate rat urinary bladder by irritant chemicals. Pain. 28, 109-127 (1987).
- Du, S., Araki, I., Yoshiyama, M., Nomura, T., Takeda, M. Transient receptor potential channel A1 involved in sensory transduction of rat urinary bladder through C-fiber pathway. Urology. 70, 826-831 (2007).
- Streng, T., Santti, R., Talo, A. Similarities and differences in female and male rat voiding. Neurourol. Urodyn. 21, 136-141 (2002).
- Igawa, Y. Cystometric findings in mice lacking muscarinic M2 or M3 receptors. J. Urol. 172, 2460-2464 (2004).
- Schroder, A., Newgreen, D., Andersson, K. E. Detrusor responses to prostaglandin E2 and bladder outlet obstruction in wild-type and Ep1 receptor knockout mice. J. Urol. 172, 1166-1170 (2004).
- Chen, Q. Function of the lower urinary tract in mice lacking alpha1d-adrenoceptor. J. Urol. 174, 370-374 (2005).
- May, V., Vizzard, M. A. Bladder dysfunction and altered somatic sensitivity in PACAP-/- mice. J. Urol. 183, 772-779 (2010).
- Thorneloe, K. S., Meredith, A. L., Knorn, A. M., Aldrich, R. W., Nelson, M. T. Urodynamic properties and neurotransmitter dependence of urinary bladder contractility in the BK channel deletion model of overactive bladder. Am. J. Physiol. Renal. Physiol. 289, 604-610 (2005).
