Karyotyping ספקטרלי (שמים) היא טכניקה מתקדמת cytogenetics לזהות סטיות כרומוזומליות גנומית. שיטה זו מנצלת את בדיקות ציור כרומוזום, המאפשרים סיווג של כרומוזומים כל. SKY יכול גם לזהות סטיות כרומוזום מורכבים ופגמים הפרדה בעכברים ובבני אדם עם מחלות שונות, לרבות מחלת כליות פוליציסטיות.
השיטה המקובלת לזהות ולסווג כרומוזומים בודדים תלוי בדגם פסים ייחודי של כל כרומוזום בעוד כמה מינים ספציפיים שאנו מנתחים 1, 2. זו טכניקה קלאסית פסים, לעומת זאת, אינה אמינה בזיהוי סטיות כרומוזומליות מורכבים, כגון אלה הקשורים בסרטן. כדי להתגבר על המגבלות של טכניקה פסים, Karyotyping ספקטרלית (SKY) הוא הציג לספק מידע אמין יותר על אי תקינות הכרומוזומים.
SKY היא הקרינה ססגוניות in-situ הכלאה (דגים) טכניקה לזהות כרומוזומים metaphase עם מיקרוסקופ רפאים 3, 4. SKY הוכח להיות כלי רב ערך לניתוח cytogenetic של מגוון רחב של מומים כרומוזום הקשורים למספר רב של מחלות גנטיות ומחלות ממאירות 5, 6. SKY כרוכה בשימוש של בדיקות ה-DNA ססגוניות fluorescently שכותרתו שהוכנו oligonucle מנוונתprimers otide על ידי PCR. לכן, כל כרומוזום יש צבע ייחודי רפאים לאחר ההכלאה in-situ עם בדיקות, אשר שכותרתו דיפרנציאלי בתערובת של צבעי ניאון (Rhodamine, טקסס רד, Cy5, FITC ו Cy5.5). בדיקות המשמשות SKY מורכב של עד 55 בדיקות ספציפיות כרומוזום 7-10.
הליך SKY כרוכה במספר שלבים (איור 1). SKY דורש זמינות של תאים עם מדד mitotic גבוהה מן הרקמות או חולה או דם. הכרומוזומים של תא בודד מתא בודד או העיקרי טרי או שורת תאים מפוזרים על שקופיות זכוכית. התפשטות זו כרומוזום מסומן עם שילוב שונה של צבעי ניאון ספציפיים עבור כל כרומוזום. בדיקה לאיתור ורכישת תמונה, מערכת דימות ספקטרלי מורכב interferometer sagnac ומצלמת CCD. זה מאפשר מדידה של ספקטרום האור הנראה הנפלט המדגם לרכוש תמונת רפאים הלוך ושובמ כרומוזומים בודדים. HiSKY, תוכנה להשתמש כדי לנתח את התוצאות של תמונות שנתפסו, מספק זיהוי קל של אנומליות כרומוזום. התוצאה הסופית היא metaphase ו סיווג קריוטיפ התמונה, שבה כל זוג כרומוזומים יש צבע מיוחד (איור 2). זה מאפשר זיהוי קל של זהויות כרומוזום translocations. לפרטים נוספים, בקר באתר יישומי הדמיה ספקטרלית ( http://www.spectral-imaging.com/ ).
SKY שימש לאחרונה לזיהוי ההפרדה פגמים כרומוזום הפרעות כרומוזום בבני אדם ועכברים עם מחלת כליות פוליציסטית אוטוזומלית דומיננטית (ADPKD), מחלה גנטית המאופיינת בתפקוד ב cilia העיקרי 11-13. באמצעות טכניקה זו, הפגנו נוכחות של הפרדה כרומוזום נורמלי פגמים כרומוזומליים בחולים ADPKD ומודלים עכבר 14. ניתוחים נוספים באמצעות SKY לא רק מאפשר לנו לזהות את מספר הזהות ואת כרומוזומליות, אלא גם כדי לזהות במדויק סטיות כרומוזומליות מורכבים מאוד כגון מחיקות כרומוזום טרנסלוקציות (איור 2).
Karyotyping ספקטרלי (שמים) היא טכניקה cytogenetics השתמשו בלימוד יצירות גנומית כרומוזומלית. שיטה זו מנצלת את בדיקות ציור כרומוזום, ואת גילוי של בדיקות אלה נרכשים דרך interferometer sagnac. תהליך SKY מלאה בדרך כלל לוקח בערך שבוע, והיא כוללת מספר שלבים עיקריים (איור 1). SKY משתמשת בפרוט?…
The authors have nothing to disclose.
המחברים מבקשים להודות בריאן Muntean, שאו הנה מאקי טקהאשי ובלייר מל לקבלת סיוע טכני שלהם. עבודה זו נתמכה על ידי פרסים מ-NIH (DK080640) ואת אוניברסיטת טולדו & ProMedica פרס גירוי Translational מחקר של ד"ר Surya נאולי.
Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
DMEM | Cellgro Mediatech Inc. | 10-013-CV | |
Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30088-03 | |
Penecillin/Streptomycin | Thermo Scientific | SV30010 | |
Colcemid | Roche Diagnostics | 10 295 892 001 | 10 μg/ml |
HCl | Fisher Scientific | A144-500 | |
KCl | Fisher Scientific | S77375-1 | |
Phosphate buffered saline | Thermo Scientific | SH30256-01 | |
SKY paint probe kit (Human) | Applied Spectral Imaging | SKY000028 | |
SKY paint probe kit (Mouse) | Applied Spectral Imaging | SKY000030 | |
Concentrated antibody detection kit | Applied Spectral Imaging | SKY000033 | |
Trypsin | Thermo Scientific | SH30236.01 | |
Methanol | Fisher Scientific | A433P-4 | |
Acetic acid | Fisher Scientific | A38-212 | |
RNase A | Roche Diagnostics | 10 109 169 001 | |
Pepsin | Sigma-Aldrich | P6887-5G | |
MgCl2 | Fluka | 63069-500ML | |
37% Formaldehyde | Mallinckrodt Baker | 2106-02 | |
20X SSC | Promega | V4261 | |
Formamide | Fluka | 47671 | prepare just before use |
Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
Microscope glass slides | Fisher Scientific | 12-549 | |
Microscope cover glass 24x60mm | VWR Vista Vision | 16004-312 | |
Rubber cement | Elmer’s (local retail store) | ||
Hybridization/ humidifiedchamber/Tray | Simport | M920-2 | put wet paper towels at the bottom |
Thermocycler | Eppendorf | Epgradient S | |
Shaking platform/Orbital shaker | Bellco Biotechnology | ||
Shaking/water bath | Precision Scientific | ||
DAPI filter cube | Chroma Technology | ||
SKY filter cube | Chroma Technology | ||
SpectraCube | Applied Spectral Imaging | ||
Inverted cell culture microscope | Nikon | Nikon Eclipse TS100 | |
Fluorescence microscope | Olympus | IX70 | 60X oil |