Spectral Karyotyping (SKY) er en avansert cytogenetikk teknikk for å identifisere genomisk og kromosomavvik. Denne teknikken tar nytte av kromosom maleri sonder, som lar klassifisering av alle kromosomer. SKY kan også identifisere komplekse kromosomavvik og segregering mangler i mus og mennesker med ulike sykdommer, inkludert polycystisk nyresykdom.
Konvensjonell metode for å identifisere og klassifisere de enkelte kromosomer avhenger unike striper mønster av hvert kromosom i en bestemt art blir analysert 1, 2. Denne klassiske banding teknikk, derimot, er ikke pålitelig i å identifisere komplekse kromosomavvik som de assosiert med kreft. For å overvinne begrensninger av den banding teknikk, Spectral Karyotyping (SKY) innført for å gi mye pålitelig informasjon om kromosomfeil.
SKY er en flerfarget fluorescens in-situ hybridisering (FISH) teknikk for å oppdage Metafasekromosomer med spektral mikroskop 3, 4. SKY har vist seg å være et verdifullt verktøy for cytogenetisk analyse av et bredt spekter av kromosomfeil forbundet med et stort antall genetiske sykdommer og malignitet 5, 6. SKY innebærer bruk av flerfarget fluorescently-merket DNA prober fremstilt fra den degenererte oligonucleotide primere med PCR. Dermed har hver kromosom en unik spektral farge etter in-situ hybridisering med prober, som er ulikt merket med en blanding av fluorescerende fargestoffer (Rhodamine, Texas Red, Cy5, FITC og Cy5.5). Sondene brukes til SKY bestå av opptil 55 kromosom spesifikke probene 7-10.
Prosedyren for SKY involverer flere trinn (figur 1). SKY krever tilgjengelighet av celler med høy mitotisk indeks fra normal eller sykt vev eller blod. Kromosomene i en enkelt celle fra enten en fersk isolert primær celle eller en cellelinje er spredt på en glass-slide. Dette kromosom spredningen er merket med en annen kombinasjon av fluorescerende fargestoffer spesifikke for hvert kromosom. For probe deteksjon og bilde oppkjøpet består spektral avbildning system av sagnac interferometer og en CCD-kamera. Dette gjør måling av det synlige lysspekteret slippes ut fra prøven og å skaffe en spektral bilde from enkelte kromosomer. HiSKY, leverer programvaren som brukes til å analysere resultatene av bildene, en enkel identifisering av kromosom anomalier. Sluttresultatet er en metafase og en karyotype klassifisering bilde, der hver kromosompar har en distinkt farge (figur 2). Dette gir enkel identifisering av kromosom identiteter og translokasjoner. For mer informasjon, vennligst besøk Applied Spectral Imaging nettsted ( http://www.spectral-imaging.com/ ).
SKY ble nylig brukt til en identifisering av kromosom segregering defekter og kromosomfeil hos mennesker og mus med autosomal dominant polycystisk nyresykdom (ADPKD), en genetisk sykdom karakterisert ved dysfunksjon i primær cilia 11-13. Ved hjelp av denne teknikken, viste vi tilstedeværelse av unormale kromosom segregasjon og kromosomavvik defekter i ADPKD pasienter og musemodeller 14. Videre analyser ved hjelp av SKY ikke bare tillot oss å identifisere kromosomal antall og identitet, men også til nøyaktig oppdage svært komplekse kromosomavvik som kromosom slettinger og translokasjoner (figur 2).
Spectral Karyotyping (SKY) er en cytogenetikk teknikk som brukes i å studere genomisk og kromosomal komposisjoner. Denne teknikken tar nytte av kromosom maleri sonder, og påvisning av disse sonder er anskaffet gjennom en sagnac interferometer. Den komplette SKY prosessen tar vanligvis omtrent en uke, og det innebærer flere viktige trinn (figur 1). SKY bruker en standard protokoll, som først ble beskrevet av Padilla-Nash et al tre. Protokollen har siden blitt bearbeidet av ulike c…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker å takke Brian Muntean, Shao Lo, Maki Takahashi og Blair Mell for deres tekniske assistanse. Dette arbeidet ble støttet av utmerkelser fra NIH (DK080640) og The University of Toledo & ProMedica translasjonsforskning Stimulering Award til Dr. Surya Nauli.
Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
DMEM | Cellgro Mediatech Inc. | 10-013-CV | |
Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30088-03 | |
Penecillin/Streptomycin | Thermo Scientific | SV30010 | |
Colcemid | Roche Diagnostics | 10 295 892 001 | 10 μg/ml |
HCl | Fisher Scientific | A144-500 | |
KCl | Fisher Scientific | S77375-1 | |
Phosphate buffered saline | Thermo Scientific | SH30256-01 | |
SKY paint probe kit (Human) | Applied Spectral Imaging | SKY000028 | |
SKY paint probe kit (Mouse) | Applied Spectral Imaging | SKY000030 | |
Concentrated antibody detection kit | Applied Spectral Imaging | SKY000033 | |
Trypsin | Thermo Scientific | SH30236.01 | |
Methanol | Fisher Scientific | A433P-4 | |
Acetic acid | Fisher Scientific | A38-212 | |
RNase A | Roche Diagnostics | 10 109 169 001 | |
Pepsin | Sigma-Aldrich | P6887-5G | |
MgCl2 | Fluka | 63069-500ML | |
37% Formaldehyde | Mallinckrodt Baker | 2106-02 | |
20X SSC | Promega | V4261 | |
Formamide | Fluka | 47671 | prepare just before use |
Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
Microscope glass slides | Fisher Scientific | 12-549 | |
Microscope cover glass 24x60mm | VWR Vista Vision | 16004-312 | |
Rubber cement | Elmer’s (local retail store) | ||
Hybridization/ humidifiedchamber/Tray | Simport | M920-2 | put wet paper towels at the bottom |
Thermocycler | Eppendorf | Epgradient S | |
Shaking platform/Orbital shaker | Bellco Biotechnology | ||
Shaking/water bath | Precision Scientific | ||
DAPI filter cube | Chroma Technology | ||
SKY filter cube | Chroma Technology | ||
SpectraCube | Applied Spectral Imaging | ||
Inverted cell culture microscope | Nikon | Nikon Eclipse TS100 | |
Fluorescence microscope | Olympus | IX70 | 60X oil |