Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Doe-het-zelf-Inrichting voor Herstel van gecryopreserveerde monsters per ongeluk laat vallen in cryogene opslagtanks

doi: 10.3791/3903 Published: May 11, 2012

Summary

Hier presenteren we een goedkope, duurzame cryotolerant apparaat voor het monster opvragen uit Dewar tanks gevuld met vloeibare stikstof. Het gemak van de bouw en de modulaire opbouw van het apparaat maakt het proces van het monster ophalen van cryogene tanks veilig en gemakkelijk.

Abstract

Vloeibare stikstof is kleurloos, geurloos, extreem koud (-196 ° C) vloeistof onder druk gehouden. Het wordt algemeen gebruikt als een cryogene vloeistof voor langdurige opslag van biologische materialen zoals bloed, cellen en weefsels 1,2. De cryogene aard van vloeibare stikstof, terwijl het ideaal voor het monster het behoud, kan leiden tot snel invriezen van levende weefsels bij contact - bekend als 'cryogene brandwonden "2, die kan leiden tot ernstige bevriezingsverschijnselen in de personen die nauw betrokken zijn bij de opslag en het ophalen van monsters van Dewars. Bovendien, zoals vloeibare stikstof verdampt vermindert de zuurstofconcentratie in de lucht kan veroorzaken asfyxie, vooral in afgesloten ruimten 2.

In laboratoria, zijn biologische monsters vaak opgeslagen in cryovials of cryoboxes gestapeld in roestvrij stalen rekken binnen de Dewar tanks 1. Deze stellingen zijn voorzien van een lange as dozen wegglijdt uit de rekken en in de onderzijde vanDewars tijdens routine behandeling. Maar al te vaak, echter, dozen of flesjes met kostbare stalen slip uit en zinken naar de bodem van vloeibare stikstof gevulde tank. In dergelijke gevallen kan monsters moeizaam teruggevonden na overdracht van de vloeibare stikstof in een extra container of ontdoen. De dozen en flacons kunnen dan relatief veilig hersteld van geleegd Dewar. Echter, de cryogene aard van vloeibare stikstof en de uitbreiding tarief maakt gezonken monster ophalen gevaarlijk. Het wordt algemeen aanbevolen door Veiligheid Kantoren die monster ophalen nooit worden uitgevoerd door een enkele persoon. Een ander alternatief is om in de handel verkrijgbare koele grijpers, tangen te gebruiken te trekken uit de flesjes 3. Echter, beperkte zichtbaarheid in de donkere vloeistof gevulde Dewars vormt een belangrijke beperking in het gebruik ervan.

In dit artikel beschrijven we de bouw van een Cryotolerant DIY vanginrichting, welk monster ophalen maakt van Dewar met cryogene vloeistoffen zowel veilig als eenND eenvoudig.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Vergadering van Cryotolerant Inrichting voor ophalen van Cryoboxes

  1. Met tangen, recht uit een zijde van drie zijden sterk band (figuur 1A) om een L-vormige sterk-tie in figuur 1B. Opmerking: De afmetingen van sterke-tie kan worden gekozen afhankelijk van de diameter van de hals van Dewar .
  2. Zet twee van zulke sterke banden met een sterke-band T-band (figuur 2) met behulp van Crown bout moer, ring en schroef aan om de Cryoscoop basis vormen zoals getoond in figuur 3 (AB). Opmerking: Twee sterke banden worden gebruikt voor het ophalen van maken 5 ½ inch x 5 ½ inch cryoboxes.
  3. Met behulp van een schuimspaan uit de plaat (figuur 4), breng de sleuven op de sterke-band T-band met de sleuven aan de ene kant van de sleuf plaat en elkaar vast de twee met behulp van Hillman moer en bouten (figuur 5). Opmerking: Als de gleuf plaat en sterke band's niet meemij met voorgeboorde gaten, dan moet u hebben gaten geboord met behulp van hardmetalen boor.
  4. Buig het andere uiteinde van de spleetplaat met behulp van een tang zoals weergegeven in figuur 6. (Deze stap is optioneel).
  5. Wikkel de handgreep met schuim beter begrijpen de toestel als in vloeibare stikstof in figuur 6. (Optioneel) Opmerking: Verwijder voor het schuim autoclaveren.

2. Vergadering van Cryotolerant Inrichting voor ophalen van Cryovials

De Cryotolerant DIY ophalen apparaat kan ook worden aangepast voor het ophalen van cryovials. Hierbij vervanging van vlakke bodem met een roestvrij stalen zeef zoals gewijzigd voor scheppen van flesjes van vloeibare stikstof (Figuur 7).

  1. Draai de kroon moeren en bouten bevestigen van de sterke-band T band aan de gleuf plaat.
  2. Voordat u de roestvrij stalen zeef om de gleuf plaat, buigt de hals vande zeef met de hulp van een tang te oriënteren de basis onder een hoek van een pollepel (figuur 8) Opmerking lijken: Als de filter wordt geleverd met een lip, tang gebruiken om de lip bukken, dit zal moeilijk te manoeuvreren is met het apparaat gemakkelijker te maken..
  3. Lijn het gat op de handgreep van de zeef, samen met de gaten in de gleuf plaat en de zeef met behulp van Hillman moeren en bouten zoals aangegeven in figuur 8 Opmerking veilig te stellen:. Als de zeef wordt niet geleverd met voorgeboorde gaten, moet u te regelen om gaten geboord met hardmetalen boor te hebben.

3. Ophalen Cryoboxes en Cryovials Van Dewar

  1. Om te beginnen, op cryogene handschoenen en verwijder 1 of 2 vriezer rekken van de Dewar om ruimte voor manoeuvreren mogelijk te maken.
  2. Voorzichtig schrapen over de bodem van de Dewar met de rechtopstaande Cryotolerant DIY ophalen van het apparaat uitgerust met een sterke-band T band basis (figuur 5) en het verzamelen van de doos Fallen de bodem van de tank Dewar. Opmerking: vloeibare stikstof kookt onmiddellijk bij contact met een warme object omhullen object isolerende stikstofgas (Leidenfrost effect). Om het apparaat afkoelen voordat u aan het ophalen van de monsters, langzaam onder te dompelen het apparaat in de Dewar en laat vloeibare stikstof om het apparaat voldoende afkoelen voordat u verder gaat met de bovenstaande stap.
  3. Rechtop Trek het apparaat langs de wanden van de Dewar aan de Vriesvak schep van de tank.
  4. Pak de doos afkomstig uit de onderzijde van de Dewar.
  5. Voor het ophalen van cryovials voorzichtig schrapen de bodem van de Dewar met de cryoscoop voorzien van een filter (Figuur 9).
  6. Net als bij cryobox ophalen, rechtop trekt het apparaat en pak de flesjes verzameld in de zeef.

4. Representatieve resultaten

Een groot probleem van genexpressie studies is dat de kwaliteit van RNA afhankelijk van de opslagomstandighedenvoor ingevroren weefselmonsters en geëxtraheerd RNA 4. Figuur 10 toont het effect van het monster handling integriteit van totaal RNA. Totaal RNA van hetzelfde weefsel bron (menselijke vet) werd onderworpen aan verschillende monsters behandeling. Voorafgaand aan experiment, intacte totaal RNA preparaat toont duidelijk 28S en 18S rRNA banden met de 28S rRNA band ongeveer twee keer zo intens als de 18S rRNA band (Figuur 10, baan 1). Deze 2:1 verhouding (28S: 18S) is een indicatie dat het RNA intact is, terwijl het gedeeltelijk afgebroken RNA verschijnt als een uitstrijkje, of de 28S: 18S intensiteit verhouding vertrekt vanaf 2:01 5. Lanes 3-4 toont RNA monsters met een degradatie. Deze RNA-monsters werden onderworpen aan herhaalde gedeeltelijke ontdooien door korte-termijn opvragingen uit de Dewar (methode A), waardoor het modelleren van lange termijn opslag met periodieke decanteren als gevolg van de noodzaak van het ophalen van de gevallen flesjes en doosjes (figuur 10, Lane 3-4 ). Echter monster opgeslagen in Dewar onderhoudenmet doe apparaat (methode B), en dus geen gedeeltelijke ontdooien bevatten intact RNA (Figuur 10, laan 2).

Figuur 1
Figuur 1. A) De basis bestaat uit twee 3-zijdige sterke band van de getoonde afmetingen. Elke sterk-tie bevat een grote pre-gat (volle pijl) en meerdere kleinere gaten (pijltje) aan elke kant. Dit biedt een optie om bevestiging met noten en bouten. Ook de kleinere openingen kunnen snelle afvoer van vloeibare stikstof gedurende monster ophalen. B) een zijde van elk van de sterke-tie wordt gestrekt met behulp van een tang om L-vormige sterk-tie.

Figuur 2
Figuur 2. Strong-band T-band wordt gebruikt om elkaar vast de sterke-schappen. Net als een sterke-tie, T-band heeft een grote pre-gat (volle pijl) en twee kleinere gaten (small pijl) op elke hoek. Dit maakt het beveiligen sterke banden langs de lengte van de T - band met behulp van moeren en bouten. Het maakt het ook mogelijk bevestiging van T-band aan de gleuf plaat.

Figuur 3
Figuur 3. A) Elk sterke band bevestigd is aan een hoek van T-band, langs zijn lengte met behulp van kroon bout bouten, moeren en ringen. B) Twee sterke banden zijn naast aan elkaar bevestigd om 5 ½ inch x 5 ½ te halen binnen cryoboxes. Voor kleinere cryoboxes zoals 2 inch x 2 inch, kan een sterk-tie rechtstreeks bevestigd aan de spleetplaat zonder T-band.

Figuur 4
Figuur 4. Sleuf vlakke plaat wordt gebruikt als handvat. Lengte van de spleetplaat afhankelijk van de diepte van de Dewar. In dit geval werd 4 voet spleetplaat gebruikt. De dikte van spleetplaat is van cruciaal belang isinds dunne sleuf platen (<14 meters) maken het apparaat ondeugdelijk bij het ophalen van monsters van vloeibare stikstof gevuld Dewar.

Figuur 5
Figuur 5. Vlakke bodem bestaande uit sterk banden en T band wordt bevestigd aan een uiteinde van de spleetplaat. Hoe groter het gat aan de resterende hoek van T band op een lijn met de sleuf op de vlakke plaat en bevestigd met behulp van zeskant bout en moer. Dit apparaat kan nu gebruikt worden om cryoboxes van Dewar te halen.

Figuur 6
Figuur 6. Een uiteinde van de sleuven vlakke plaat is gebogen met een tang en bedekt met schuim betere grip vooral diepe Dewars, zoals in dit geval.

Figuur 7
Figuur 7. Zeef met gaas en roestvrij stalen handgreepwordt gebruikt om cryovials van Dewar te halen. Indien de handgreep niet voorzien van een sleuf, boren met carbide bit nodig voor het boren van een gat.

Figuur 8
Figuur 8. Om het ophalen van cryovials te vergemakkelijken, wordt zeef gebogen langs de hals met een tang aan pollepel vormige zeef te krijgen. Als filter is voorzien lip zoals in dit geval kan worden tang te buigen. Dit zorgt ervoor zeef wordt niet gevangen in de Dewar.

Figuur 9
Figuur 9. Zeef wordt bevestigd aan de langwerpige vlakke plaat aan een einde met zeskantige moer en bout.

Figuur 10
Figuur 10. Voorbeeld integriteit van totaal RNA onderworpen aan verschillende voorwaarden behandelen van het monster. Om na te gaan hoe RNA kwaliteit wordt beïnvloed door behandelen van het monster cOORWAARDEN werd een reeks RNA monsters van dezelfde bron onderworpen aan twee methoden handelingen. Methode A bestond uit de opslag van RNA in Dewar onderworpen aan monster opvragingen gebruik van doe-apparaat, dus geen gedeeltelijke ontdooien. Methode B bestond uit opslag van RNA in Dewar onderworpen aan herhaalde gedeeltelijke ontdooien door korte-termijn opvragingen uit de Dewar, waardoor het modelleren van lange termijn opslag met periodieke decanteren voor het ophalen van gevallen monsters. Totaal RNA integriteit werd vervolgens geanalyseerd door gelelektroforese. Lane1: Voorbeeld voor de opslag in Dewar, Laan 2: Voorbeeld van Dewar onderworpen aan ophalen door Methode A; Lane 3, 4: Voorbeeld van Dewar onderworpen aan het ophalen van methode B, M: 100 bp ladder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Een van de meest voorkomende methoden van het ophalen van cryoboxes en cryovials van de bodem van de Dewar tank is om vloeibare stikstof decanteren in een vrije container en trek de monsters die nog in de kolf of drijvend in de afgegoten vloeibare stikstof. Dit is echter een onveilige die cryogene brandwonden of stikken door langdurige blootstelling aan vloeibare stikstof dampen 2. Andere veel voorkomende manier van het ophalen van gevallen cryovials betreft het gebruik van cryovial tang 3. Echter, de beperkte zichtbaarheid in de donkere ruimte van de tank gevuld met vloeibare stikstof beperkt hun wendbaarheid.

De Cryotolerant DIY ophalen apparaat hierboven beschreven biedt een goedkoper, veiliger en makkelijker alternatief voor het ophalen van gevallen cryoboxes en cryovials van de bodem van diepe kolven met beperkte zichtbaarheid. Het gemak van hanteren de doe vanginrichting voorkomt de noodzaak om de kolven voor ophalen legen. Bovendien is de retrieval van cryovial met behulp van de inrichting kan worden uitgevoerd door een individu. Bovendien kan het gebruik van de doe vanginrichting verkort hoofdzaak de tijd andere monsters in eenzelfde apparaat te brengen onder omgevingstemperatuur verhoogt dus monster opslag 6,7.

Veel gebruikte materialen, zoals kunststof, carbon staal en rubber broos worden in vloeibare stikstof, en vaak breken onder stress 8,9,10. De roestvrij stalen of verzinkte onderdelen die worden gebruikt in de doe-het apparaat goed zijn bestand tegen schade als gevolg van temperaturen onder nul van cryogene vloeistoffen. Bovendien zijn deze componenten zijn gemakkelijk verkrijgbaar in de plaatselijke bouwmarkten en van de lage kosten met de aanleg van doe-het apparaat een bedrag van minder dan $ 50,00. De lange steel helpt te voorkomen dat exploitant van direct contact met de cryogene vloeistoffen en de geperforeerde bodem en filter zijn altijd direct afvoeren van vloeibare stikstof tijdens het monster herstel. De snelle retrieval laat minimale blootstelling aan vloeibare stikstof dampen maken van monster ophalen van een veiliger proces. Door zijn modulaire ontwerp, de doe-het ophalen van apparaat heeft de flexibiliteit om te worden gebruikt voor een van beide dozen of flesjes. Verder is de eenvoud van het ontwerp kan het apparaat worden aangepast voor Dewars van verschillende vormen en afmetingen en eventueel met andere soorten van cryogene vloeistof. Het gebruik van deze inrichting kan echter beperkt bij cryogene tanks die geen vlakke bodem.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Geen belangenconflicten verklaard.

Acknowledgments

DIY cryogene ophalen van het apparaat had getest in de loop van de projecten "Modeling bacteriële eiwitten prenylatie in eukaryote cellen met behulp van bio-informatica en moleculaire aanpak" wordt gesponsord door Mary Louise Andrews Award for Cancer Research programma, Virginia Academie van Wetenschappen, "fysiologische betekenis van RNA bewerken in Plasma Dendritische cellen "gesponsord door The Thomas F. Jeffress en Kate Miller Jeffress Memorial Trust en staat Contract 16.740.11.0364 (Ministerie van Wetenschap en Onderwijs, Rusland). We willen Beth Eom bedanken voor hulp bij het RNA integriteit experiment.

References

  1. Kittel, P. Advances in Cryogenic Engineering. Springer. 41 (1996).
  2. Edeskuty, F. J., Walter, F. Stewart Safety in the handling of cryogenic fluids. Plenum Press. New York. (1996).
  3. Council, N. R. Prudent Practices in the Laboratory: Handling and Management of Chemical Hazards. National Academies Press. (2011).
  4. Muyal, J., Muyal, V., Kaistha, B., Seifart, C., Fehrenbach, H. Systematic comparison of RNA extraction techniques from frozen and fresh lung tissues: checkpoint towards gene expression studies. Diagnostic Pathology. 4, 9 (2009).
  5. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).
  6. Holland, N. T., Smith, M. T., Eskenazi, B., Bastaki, M. Biological sample collection and processing for molecular epidemiological studies. Mutation Research/Reviews in Mutation Research. 543, 217-234 (2003).
  7. Lynch, P. T. CELL, TISSUE AND ORGAN CULTURE | Storage and Cryopreservation. Encyclopedia of Rose Science. 106-111 (2003).
  8. Crawford, R. J. Plastics Engineering. Elsevier Butterworth-Heinemann. (1998).
  9. Gorenc, B., Tinyou, R., Syam, A. Steel designers' handbook. University of New South Wales Press. (1996).
  10. Harper, C. A., Petrie, E. M. Plastics materials and processes: a concise encyclopedia. Wiley-Interscience. (2003).
Doe-het-zelf-Inrichting voor Herstel van gecryopreserveerde monsters per ongeluk laat vallen in cryogene opslagtanks
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Mehta, R., Baranova, A., Birerdinc, A. Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks . J. Vis. Exp. (63), e3903, doi:10.3791/3903 (2012).More

Mehta, R., Baranova, A., Birerdinc, A. Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks . J. Vis. Exp. (63), e3903, doi:10.3791/3903 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter