Do-It-Yourself Dispositivo de Recuperação de amostras criopreservadas cair acidentalmente em Tanques de armazenamento criogênico

Summary

Aqui nós apresentamos um baixo custo, durável cryotolerant dispositivo para a recuperação de amostra de Dewar tanques cheios de nitrogênio líquido. A facilidade de construção e design modular do dispositivo faz com que o processo de recuperação da amostra de tanques criogênicos seguro e fácil.

Abstract

O nitrogênio líquido é incolor, inodoro, extremamente frio (-196 ° C) líquido mantido sob pressão. É comummente usado como um fluido criogénico para armazenamento a longo prazo de materiais biológicos tais como sangue, células e tecidos ^1,2. A natureza criogénico de azoto líquido, enquanto ideal para a preservação da amostra, pode causar congelação rápida dos tecidos vivos em contacto - conhecido como 'criogénico queimadura' ^2, o que pode levar a queimaduras graves em pessoas intimamente envolvidas no armazenamento e recuperação de amostras de Dewars. Além disso, como o azoto líquido evapora que reduz a concentração de oxigénio no ar e pode causar asfixia, especialmente em espaços confinados ^2.

Nos laboratórios, amostras biológicas são frequentemente armazenados em criotubos ou cryoboxes empilhados em prateleiras de aço inoxidável dentro dos tanques de Dewar ^1. Estes suportes de armazenamento são fornecidos com um eixo de tempo para impedir caixas de deslizar para fora dos suportes e na parte inferior doDewars durante o manuseio de rotina. Com demasiada frequência, no entanto, caixas ou frascos com amostras preciosas escorregar e afundar até o fundo do tanque de nitrogênio líquido preenchido. Em tais casos, as amostras podem ser tediosamente recuperada após a transferência do azoto líquido para um recipiente de reserva ou descartá-lo. As caixas e frascos pode então ser recuperado a partir com relativa segurança Dewar esvaziado. No entanto, a natureza criogénico de azoto líquido e da sua taxa de expansão torna perigoso recuperação afundado amostra. É geralmente recomendado pelo Escritórios de segurança que a recuperação da amostra nunca ser realizada por uma única pessoa. Outra alternativa é usar comercialmente disponíveis grabbers frescos ou pinças para retirar os ³ frascos. No entanto, a visibilidade limitada dentro dos escuros cheios de líquidos Dewars representa uma grande limitação na sua utilização.

Neste artigo, descrevemos a construção de um dispositivo Cryotolerant recuperação DIY, que faz recuperação de amostra de Dewar contendo fluidos criogênicos tanto a segurança de umnd fáceis.

Protocol

1. Montagem do dispositivo Cryotolerant para Recuperação de Cryoboxes

1. Usando um alicate, endireitar um lado da face 3 Nota uma forte L-tie (Figura 1A) para fazer forte-tie em forma mostrada na Figura 1B:. As dimensões do tie-forte pode ser seleccionada dependendo do diâmetro do gargalo do Dewar .
2. Garantir dois tão fortes de laços com uma cinta de T-tie forte (Figura 2) usando Crown porca e parafuso, anilha e parafuso para formar a base Cryoscoop como mostrado na Figura 3 (AB). Nota: Dois fortes são usadas para permitir a recuperação de 5 ½ x 5 ½ pol cryoboxes.
3. Utilizando uma placa ranhurada (Figura 4), ​​alinhar as ranhuras na cinta forte-tie T com as ranhuras em uma extremidade da placa ranhurada e fixar os dois em conjunto com a ajuda de Hillman porca e parafusos (Figura 5). Nota: Se o placa entalhada e forte laço de não come com furos pré-perfurados, você terá que ter furos perfurados utilizando carboneto de broca.
4. Dobrar a outra extremidade da placa ranhurada com a ajuda de um alicate, como mostrado na Figura 6. (Este passo é opcional).
5. Enrole a alça com espuma para compreender melhor o dispositivo quando em azoto líquido, como mostrado na Figura 6. (Opcional) Nota: Remova a espuma antes da autoclavagem.

2. Montagem do dispositivo Cryotolerant para Recuperação de criotubos

O dispositivo de recuperação Cryotolerant DIY pode também ser adaptado para a recuperação de criotubos. Isto envolve a substituição da base plana, com um filtro de aço inoxidável como mostrado alterados para escavar para fora a partir de frascos de azoto líquido (Figura 7).

1. Soltar a porca da Coroa e os parafusos que prendem a forte-tie alça T para a placa entalhada.
2. Antes de fixar o filtro de aço inoxidável à placa ranhurada, dobre o pescoço doo filtro com a ajuda de um alicate para orientar a base com um ângulo para se assemelhar a uma concha (Figura 8) Nota: Se o filtro é fornecido com um lábio, usar um alicate para dobrar o lábio para baixo, o que irá fazer com a manobra mais fácil do dispositivo..
3. Alinhe o orifício na alça do filtro junto com os furos na placa entalhada e proteger o filtro com a ajuda de porcas e parafusos Hillman como mostrado na Figura 8. Nota: se o filtro não vem com furos pré-perfurados, você vai precisar de arranjar para ter furos perfurados com broca de carboneto.

3. Recuperando Cryoboxes e criotubos De Dewar

1. Para começar, coloque luvas criogênicas e remover 1 ou 2 prateleiras de resfriamento do Dewar para permitir espaço para manobras.
2. Raspar suavemente ao longo da parte inferior do Dewar com o dispositivo de recuperação Cryotolerant DIY vertical equipado com forte-tie base de cinta T (Figura 5), e recolher o falle caixan para o fundo do tanque Nota Dewar:. ferve de azoto líquido imediatamente em contacto com um objeto mais quente, que envolve o objecto no gás isolante azoto (efeito Leidenfrost). Para arrefecer o dispositivo antes da recuperação de amostras, lentamente imergir o dispositivo no Dewar e permitir azoto líquido para arrefecer o dispositivo suficientemente antes de prosseguir com o passo acima.
3. Puxar o dispositivo na posição vertical ao longo das paredes do Dewar para colher a caixa congelador para fora do tanque.
4. Agarrar a caixa recuperados a partir do fundo do Dewar.
5. Para recuperar criotubos, raspar suavemente a parte inferior da Dewar com o cryoscoop equipado com um filtro (Figura 9).
6. Semelhante ao cryobox recuperação, puxe o dispositivo na posição vertical e pegue os frascos coletados no coador.

4. Os resultados representativos

Um grande desafio em estudos de expressão de genes é que a qualidade do RNA depende das condições de armazenamentopara ambas as amostras de tecido congelado e Figura extraída RNA ^4. 10 mostra o efeito da manipulação da amostra sobre a integridade do RNA total. O RNA total a partir da fonte de tecido mesmo (adiposo humano) foi submetido a manipulação da amostra diferente. Antes da experiência, intacta RNA total preparate mostra claras bandas 28S e 18S rRNA com a banda rRNA 28S aproximadamente duas vezes tão intensa como a banda de rRNA 18S (Figura 10, pista 1). Esta proporção de 2:1 (28S: 18S) é uma indicação de que o RNA está intacta, enquanto que o RNA parcialmente degradadas aparece como uma mancha, ou a sua 28S: 18S relação da intensidade de partida de 2:01 ^5. As pistas 3-4 descreve amostras de RNA com uma degradação significativa. Estas amostras de RNA foram sujeitas a repetidos descongelamento parcial, por curto prazo consultas das Dewar (Método A), assim modelando o armazenamento a longo prazo com periódica decantação, devido à necessidade de a recuperação do frascos caído e caixas (Figura 10, Lane 3-4 ). No entanto, as amostras armazenadas em Dewar atendidousando DIY dispositivo (Método B) e, portanto, não descongelamento parcial, contêm RNA intactas (Figura 10, pista 2).

Figura 1. A) A base é constituído por duas faces 3 forte-tie de dimensões indicadas. Cada ligação forte contém um furo pré-perfurado grande (seta sólida) e múltiplos orifícios mais pequenos (seta pequena) em cada face. Isso fornece uma opção para permitir a fixação com porca e parafusos. Além disso, os orifícios mais pequenos permitir a drenagem rápida de azoto líquido durante a recuperação de amostra. B) Um lado de cada um dos laço forte-é endireitado com a ajuda de um alicate para fazer em forma de L-tie forte.

Figura 2. Forte-tie alça T é usado para proteger os fortes laços de conjunto. Como forte-tie, T-cinta tem um furo pré-grandes (seta contínua) e dois furos menores (small seta) em cada canto. Isto permite garantir forte-dades ao longo do comprimento do T - Strap usando porcas e parafusos. Também permite a fixação T-cinta para a placa ranhurada.

Figura 3. A) Cada laço forte-é presa a um canto de T-cinta, ao longo do seu comprimento com porcas de parafuso de coroa, parafusos e anilhas. B) Dois forte-dades são protegidos adjacentes uns aos outros para ajudar a recuperar 5 ½ polegadas x 5 ½ dentro cryoboxes. Para cryoboxes menores, como 2 polegadas x 2 polegadas, um único forte-tie pode ser fixado diretamente à placa entalhada sem cinta-T.

Figura 4. Ranhurada placa plana é utilizada como a alça. Comprimento da placa ranhurada depende da profundidade do Dewar. Neste caso, 4 pés de placa ranhurada foi usado. A espessura da placa ranhurada é s críticoesde finas placas de fenda (<14 medidores) fazer o dispositivo frágil ao recuperar amostras de nitrogênio líquido cheio Dewar.

Figura 5. A base plana constituída por fortes-dades e cinta T é então fixada a uma extremidade da placa ranhurada. O orifício maior no canto restante da correia T está alinhada com a ranhura na placa plana e fixado utilizando o parafuso e porca sextavada. Este dispositivo pode ser agora usado para recuperar cryoboxes de Dewar.

Figura 6. Uma extremidade da placa ranhurada plana é dobrada com um alicate e coberto com espuma para proporcionar uma melhor aderência especialmente para Dewars profundas, como mostrado no presente caso.

Figura 7. Filtro com malha de arame e cabo de aço inoxidávelé usado para recuperar criotubos de Dewar. Se o identificador não está provida de uma ranhura, perfurar com bit carboneto será necessário para a perfuração de um orifício.

Figura 8. Para facilitar a recuperação de criotubos, filtro é dobrado ao longo do pescoço usando alicates para obter filtro de concha em forma. Se o filtro está provido de lábio como no presente caso, alicates pode ser usado para dobrar. Isso garante o filtro não fica presa dentro do Dewar.

A Figura 9. Filtro é fixada à placa ranhurada plana numa extremidade usando porca sextavada e parafuso.

Figura 10. Integridade da amostra de RNA total submetido a diferentes condições de manejo da amostra. Para explorar como a qualidade do RNA é afetado pela manipulação da amostra cONDIÇÕES, um conjunto de amostras de ARN a partir da mesma fonte foi submetido a dois métodos de tratamentos. Método A consistiu de armazenamento de RNA em Dewar submetido a recuperações de exemplo usando dispositivo DIY, portanto, não descongelamento parcial. Método B consistiu de armazenamento de RNA em Dewar submetido a repetidas descongelamento parcial, por curto prazo consultas das Dewar, assim modelando o armazenamento a longo prazo com periódica decantação para recuperar amostras caídas. Integridade de RNA total foi então analisada por electroforese em gel. Lane1: Amostra antes do armazenamento em Dewar; Pista 2: Amostra de Dewar submetido a recuperação pelo método A; Pista 3, 4: Exemplo de Dewar submetido a recuperação pelo método B, M: 100 pb ladder.

Discussion

Um dos métodos mais comuns de recuperar cryoboxes e criotubos a partir do fundo do tanque Dewar é decantar azoto líquido para um recipiente de reserva e puxar para fora as amostras restantes no balão ou flutuando na azoto líquido decantado. Isto é, no entanto, uma prática insegura que pode provocar queimaduras criogénicos ou asfixia devido a exposição prolongada a vapores de azoto líquido ^2. Outra forma comum de recuperação de criotubos caídos envolve o uso de pinças criotubo ^3. No entanto, a visibilidade limitada dentro do espaço escuro do tanque cheio com azoto líquido restringe a sua capacidade de manobra.

O dispositivo de recuperação Cryotolerant DIY descrito acima fornece uma alternativa mais barata, mais seguro e fácil para a recuperação de cryoboxes caídas e criotubos a partir do fundo dos frascos profundas com visibilidade limitada. A facilidade de manusear o dispositivo de recuperação DIY contorna a necessidade de esvaziar os frascos antes da recuperação. Além disso, a retrieval de criotubo com a ajuda do referido dispositivo pode ser efectuada por um único indivíduo. Além disso, a utilização do dispositivo de recuperação de DIY substancialmente encurta o período de tempo de outras amostras armazenadas na mesma unidade passar sob temperaturas ambientes, melhorando assim as condições de armazenamento da amostra ^6,7.

Muitos materiais comumente utilizados, tais como plástico, aço carbono e borracha tornam-se frágeis em nitrogênio líquido, e muitas vezes fraturar sob estresse ^8,9,10. Os componentes de aço inoxidável ou galvanizado utilizados no dispositivo de DIY são resistentes a danificar a partir de sub-congelação a temperaturas de fluidos criogénicos. Além disso, esses componentes estão facilmente disponíveis em lojas de ferragens locais e de baixo custo com a construção de DIY dispositivo no valor de menos de US $ 50,00. O longa alça ajuda a prevenir operador do contato direto com os fluidos criogênicos e base perfurada e filtro de permitir instante drenagem de nitrogênio líquido durante a recuperação da amostra. A r rápidaetrieval permite mínimo de exposição aos vapores de nitrogênio líquido que fazem recuperação de uma amostra processo mais seguro. Devido à sua concepção modular, o dispositivo de recuperação de DIY tem a flexibilidade para ser usada tanto para caixas ou frascos. Além disso, a simplicidade do desenho permite que o dispositivo seja adaptado para Dewars de diferentes formas e tamanhos e, possivelmente, a trabalhar com outros tipos de fluidos criogénicos. A utilização deste dispositivo pode, contudo, limitada, no caso de reservatórios criogénicos que não têm uma base plana.