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Biology

Do-It-Yourself dispositif de récupération d'échantillons cryoconservés tombé accidentellement dans les réservoirs de stockage cryogéniques

doi: 10.3791/3903 Published: May 11, 2012

Summary

Ici, nous présentons un faible coût, durable dispositif cryotolerant pour la récupération d'échantillon à partir de réservoirs de Dewar remplis avec de l'azote liquide. La facilité de la construction et la conception modulaire de l'appareil rend le processus de récupération de l'échantillon à partir de réservoirs cryogéniques sûr et facile.

Abstract

L'azote liquide est incolore, inodore, très froid (-196 ° C) liquide maintenu sous pression. Il est couramment utilisé comme fluide cryogénique pour le stockage à long terme de matériaux biologiques tels que le sang, des cellules et tissus 1,2. La nature de l'azote liquide cryogénique, tandis idéal pour la conservation des échantillons, peut provoquer une congélation rapide des tissus vivants au contact - connu sous le nom «cryogénique brûler» 2, ce qui peut conduire à des gelures sévères chez les personnes étroitement impliquées dans le stockage et la récupération des échantillons provenant de Dewars. En outre, comme l'azote liquide s'évapore il réduit la concentration d'oxygène dans l'air et peuvent provoquer l'asphyxie, en particulier dans des espaces confinés 2.

Dans les laboratoires, les échantillons biologiques sont souvent stockées dans des cryotubes ou cryoboîtes empilés dans des racks en acier inoxydable dans les réservoirs de Dewar 1. Ces supports de stockage sont pourvus d'un arbre long pour empêcher de glisser hors des boîtes à partir des supports et dans le fond deDewars lors de la manipulation de routine. Trop souvent, cependant, des boîtes ou flacons de précieux échantillons de s'échapper et de couler au fond de la cuve d'azote liquide remplie. Dans de tels cas, les échantillons pourraient être récupérés péniblement après le transfert de l'azote liquide dans un récipient de secours ou de le jeter. Les boîtes et flacons peut alors être récupéré à partir de façon relativement sûre vidé Dewar. Cependant, la nature de l'azote liquide cryogénique et son taux d'expansion fait coulé dangereux de récupération de l'échantillon. Il est souvent recommandé par les bureaux de sécurité que l'extraction d'échantillon sera jamais réalisée par une seule personne. Une autre alternative est d'utiliser commercialement disponibles accapareurs fraîches ou des pinces pour arracher les 3 flacons. Cependant, la visibilité limitée dans les sombres liquides Dewars remplis pose un obstacle majeur à leur utilisation.

Dans cet article, nous décrivons la construction d'un dispositif de récupération de bricolage Cryotolerant, ce qui rend la récupération de l'échantillon de Dewar contenant des fluides frigorigènes, à la fois la sécurité d'une faciles.

Protocol

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1. Assemblée des périphériques Cryotolerant pour la récupération de Cryoboîtes

  1. En utilisant des pinces, de redresser un côté de 3 côtés Strong-Tie (figure 1A) pour faire une forme de L Strong-Tie Remarque montré dans la figure 1B:. Les dimensions de Strong-Tie peuvent être sélectionnés en fonction du diamètre du col de Dewar .
  2. Fixez deux de ces forts des liens avec une sangle Strong-Tie T (figure 2) à l'aide de la Couronne écrou boulon, la rondelle et la vis pour former la base Cryoscoop comme le montre la figure 3 (AB). Remarque: Deux liens forts sont utilisés pour permettre la récupération de 5 ½ po x 5 ½ po cryoboîtes.
  3. En utilisant une plaque fendue (figure 4), aligner les fentes sur la sangle Strong-Tie T avec les fentes sur une extrémité de la plaque fendue et sécuriser les deux ensemble, avec l'aide de l'écrou Hillman et des boulons (figure 5). Remarque: Si l' plaque fendue et fort lien de ne coopère pasmoi avec des trous pré-percés, vous devrez avoir des trous percés à l'aide foret carbure.
  4. Plier l'extrémité de l'autre la plaque rainurée à l'aide de pinces, comme indiqué sur la figure 6. (Cette étape est facultative).
  5. Envelopper la poignée avec de la mousse afin de mieux saisir l'appareil lorsque dans l'azote liquide comme le montre la figure 6. (Facultatif) Remarque: Retirez la mousse avant l'autoclavage.

2. Assemblée des périphériques Cryotolerant pour la récupération de Cryotubes

Le dispositif de récupération Cryotolerant bricolage peut également être adapté pour la récupération des cryotubes. Ce substituant comprend la base plane avec une crépine d'acier inoxydable comme indiqué modifié pour évider flacons de l'azote liquide (figure 7).

  1. Dévissez les écrous et les boulons de la Couronne de fixation de la sangle de Strong-Tie T pour la plaque fendue.
  2. Avant de fixer la crépine en acier inoxydable à la plaque fendue, pliez doucement le col dela crépine avec l'aide de pinces pour orienter la base d'un angle à ressembler à une louche (Figure 8) Remarque: Si le filtre est livré avec une lèvre, d'utiliser des pinces pour plier la lèvre bas, ce qui rendra les manœuvres avec le plus facile appareil..
  3. Alignez le trou sur la poignée de la passoire avec les trous sur la plaque fendue et sécuriser la crépine avec l'aide des écrous et des boulons Hillman comme le montre la Figure 8. Remarque: si le filtre ne vient pas avec des trous pré-percés, vous aurez besoin prendre des dispositions pour avoir des trous percés avec une mèche au carbure.

3. Récupération Cryoboîtes et cryotubes De Dewar

  1. Pour commencer, mettez des gants cryogéniques et enlever 1 ou 2 racks de congélation de l'Dewar pour permettre une marge de manœuvre.
  2. Grattez délicatement le long du bas de l'Dewar avec l'appareil en position verticale de récupération Cryotolerant bricolage équipé Strong-Tie de base sangle T (figure 5) et de percevoir la falle boîten pour le fond de la cuve Dewar Note:. bout d'azote liquide immédiatement au contact avec un objet plus chaud, enveloppant l'objet dans l'isolation de l'azote gazeux (effet Leidenfrost). Pour refroidir l'appareil avant le prélèvement d'échantillons, lentement plonger l'appareil dans le Dewar et permettre l'azote liquide pour refroidir l'appareil suffisamment avant de procéder à l'étape ci-dessus.
  3. Tirez l'appareil en position verticale le long des murs du Dewar pour ramasser la boîte de congélateur hors du réservoir.
  4. Saisir le boîtier récupérées à partir du bas de la Dewar.
  5. Pour récupérer des cryotubes, grattez délicatement le fond de la Dewar avec la cryoscoop équipés d'un tamis (figure 9).
  6. Semblable à cryobox récupération, tirez sur le dispositif de droite et de saisir les flacons recueillis dans la passoire.

4. Les résultats représentatifs

Un défi majeur dans les études d'expression génique, c'est que la qualité de l'ARN dépend des conditions de stockagepour les deux échantillons de tissus congelés et Figure ARN extrait 4. La figure 10 montre l'effet de la manipulation de l'échantillon sur l'intégrité de l'ARN total. L'ARN total à partir de la source même tissu (tissu adipeux humain) a été soumis à la manipulation des échantillons différents. Avant d'expérimenter, intact ARN total preparate montre clairement 28S et 18S bandes d'ARNr avec la bande ARNr 28S d'environ deux fois plus intense que la bande ARNr 18S (Figure 10, piste 1). Ce rapport 2:1 (28S: 18S) est une indication que l'ARN est intact, tandis partiellement dégradée ARN apparaît comme un frottis, 28S ou son: rapport d'intensité 18S s'écarte de 2:1 5. Lanes 3-4 représente les échantillons d'ARN avec une dégradation importante. Ces échantillons d'ARN ont été soumis à dégel partiel répétée à court terme de données adressées au Dewar (Méthode A), modélisant ainsi le stockage à long terme avec décantation périodique en raison de la nécessité de la récupération de la flacons et des boîtes déchu (Figure 10, Lane 3-4 ). Cependant, les échantillons stockés dans Dewar desservien utilisant un dispositif de bricolage (méthode B) et, par conséquent, pas de dégel partiel, contiennent de l'ARN intacts (Figure 10, Lane 2).

Figure 1
Figure 1. A) La base est constituée de deux à 3 côtés Strong-Tie de dimensions indiquées. Chaque lien fort-contient un grand pré-trou foré (flèche pleine) et de multiples petits trous (petite flèche) sur chaque face. Ceci fournit une option pour permettre la fixation avec écrou et boulons. Également des trous plus petits permettre le drainage rapide de l'azote liquide pendant la récupération de l'échantillon. B) un côté de chacun de la cravate forte-est redressé à l'aide d'une pince pour faire en forme de L forte de couplage.

Figure 2
Figure 2. Sangle T Strong-Tie est utilisé pour sécuriser les liens forte-ensemble. Comme Strong-Tie, T-sangle présente un grand pré-trou foré (flèche pleine) et deux petits trous (small flèche) à chaque coin. Cela permet la sécurisation forte des liens le long de la longueur de la T - Strap l'aide d'écrous et de boulons. Il permet également la fixation T-bracelet à la plaque fendue.

Figure 3
Figure 3. A) Chaque lien fort-est fixé à un coin de T-strap, sur toute sa longueur à l'aide écrous des boulons de la couronne, boulons et rondelles. B) Deux forte-ment sont fixés côte à côte pour aider à récupérer 5 ½ po x 5 ½ po cryoboîtes. Pour les petits cryoboîtes tels que le 2 po x 2, une seule forte de couplage peut être fixé directement sur la plaque à fentes sans bride en T.

Figure 4
Figure 4. Fendue plaque plate est utilisée en tant que poignée. La longueur de la plaque à fentes dépend de la profondeur de l'Dewar. Dans ce cas, 4 pieds de plaque fendue a été utilisé. L'épaisseur de la plaque fendue est s critiqueepuis minces plaques à fentes (<14 jauges) rendre le dispositif fragile lors de la récupération des échantillons de l'azote liquide remplie Dewar.

Figure 5
Figure 5. La base plane comprenant des solides et des liens de sangle T est ensuite fixé à une extrémité de la plaque à fentes. Le plus grand trou dans le coin restant de la sangle T est alignée avec la fente sur la plaque plane et fixée en utilisant un boulon hexagonal et l'écrou. Ce dispositif peut maintenant être utilisé pour récupérer cryoboîtes de Dewar.

Figure 6
Figure 6. Une extrémité de la plaque fendue plat est plié en utilisant des pinces et recouverte de mousse pour assurer une meilleure adhérence en particulier pour les Dewars profondes, comme le montre dans ce cas.

Figure 7
Figure 7. Crépine avec un treillis métallique et poignée en acier inoxydableest utilisé pour récupérer des cryotubes de Dewar. Si la poignée n'est pas pourvu d'une fente, percer avec un foret en carbure seront nécessaires pour percer un trou.

Figure 8
Figure 8. Pour faciliter la récupération des cryotubes, filtre est plié le long du cou en utilisant une pince pour obtenir la crépine poche en forme de. Si la crépine est fourni avec la lèvre comme dans ce cas, une pince peut être utilisée pour le plier. Cela garantit la crépine ne se coince pas dans le Dewar.

Figure 9
Figure 9. Crépine est fixé à la plaque fendue plat à une extrémité à l'aide écrou et le boulon.

Figure 10
Figure 10. L'intégrité des échantillons d'ARN total soumis à différentes conditions de manipulation des échantillons. Pour explorer la façon dont la qualité est affectée par l'ARN manipulation de l'échantillon conditions, un ensemble d'échantillons d'ARN à partir de la même source a été soumis à deux méthodes de manipulations. Méthode A se composait de stockage de l'ARN dans Dewar soumis à extractions d'échantillons en utilisant un dispositif de bricolage, donc pas de dégel partiel. Méthode B se composait de stockage de l'ARN dans Dewar soumis à dégel partiel répétée à court terme de données adressées au Dewar, modélisant ainsi le stockage à long terme avec périodique décantation pour récupérer des échantillons tombés. Totale intégrité de l'ARN ont ensuite été analysées par électrophorèse sur gel. Lane1: Exemple avant de le ranger dans Dewar; Lane 2: Exemple de Dewar soumis à la récupération par la méthode A; Lane 3, 4: Exemple de Dewar soumis à la récupération par la méthode B, M: 100 pb échelle.

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Discussion

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Une des méthodes les plus courantes de récupération cryoboîtes et cryotubes du fond de la cuve Dewar, est de clarifier l'azote liquide dans un récipient de secours et de sortir les échantillons restants dans le ballon ou flottant dans l'azote liquide décanté. C'est, cependant, une pratique dangereuse qui peut causer des brûlures cryogéniques ou asphyxie due à une exposition prolongée à des vapeurs d'azote liquide 2. Autre manière commune de la récupération des cryotubes déchus implique l'utilisation de pinces Cryovial 3. Cependant, la visibilité limitée dans l'espace sombre de la cuve remplie d'azote liquide limite leur marge de manœuvre.

Le dispositif de récupération Cryotolerant bricolage décrit ci-dessus fournit une alternative moins chère, plus sûre et plus facile pour récupérer cryoboîtes tombés et cryotubes du fond de flacons profonds avec une visibilité limitée. La facilité de manipulation du dispositif de récupération de bricolage contourne la nécessité de vider les flacons avant le prélèvement. En outre, le retrieval de cryovial avec l'aide de ce dispositif peut être effectuée par un seul individu. En outre, l'utilisation du dispositif de récupération de bricolage réduit considérablement la quantité de temps d'autres échantillons stockés dans la même unité passer à des températures ambiantes, améliorant ainsi les conditions de stockage d'échantillons 6,7.

Beaucoup de matériaux couramment utilisés tels que le plastique, acier au carbone et le caoutchouc deviennent cassants dans l'azote liquide, et souvent la rupture sous contrainte 8,9,10. Les composants en acier inoxydable ou en acier galvanisé utilisés dans le dispositif de bricolage sont résistantes aux dommages causés par températures inférieures à zéro de fluides cryogéniques. En outre, ces composants sont facilement disponibles dans les quincailleries locales et de faible coût à la construction du dispositif de bricolage d'un montant de moins de $ 50,00. Le long manche permet d'éviter l'opérateur de tout contact direct avec les liquides cryogéniques et de la base perforée et la crépine de permettre le drainage instantanée de l'azote liquide pendant la récupération de l'échantillon. Le r rapideetrieval permet minimum l'exposition aux vapeurs d'azote liquide compliquent la récupération échantillon d'un processus plus sûr. Grâce à sa conception modulaire, le dispositif de récupération de bricolage a la souplesse nécessaire pour être utilisé pour les boîtes ou flacons. En outre, la simplicité de la conception permet au dispositif d'être adapté pour Dewars de différentes formes et tailles et, éventuellement, de travailler avec d'autres types de fluides cryogéniques. L'utilisation de ce dispositif peut, toutefois, être limitée dans le cas de réservoirs cryogéniques qui n'ont pas un fond plat.

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Disclosures

Pas de conflits d'intérêt déclarés.

Acknowledgments

DIY cryogénique de récupération dispositif a été testé en cours des projets de "prénylation des protéines Modélisation bactérienne dans les cellules eucaryotes à l'aide de la bioinformatique et des approches moléculaires», parrainé par Mary Louise Andrews Prix pour le programme de recherche sur le cancer, en Virginie Académie des sciences, "signification physiologique de l'ARN dans le plasma d'édition Les cellules dendritiques »parrainé par le Jeffress Thomas F. Miller et Kate Jeffress Memorial Trust et du contrat Etat 16.740.11.0364 (Ministère de la Science et de l'éducation, de la Russie). Nous tenons à remercier Beth Eom de l'aide pour l'expérience intégrité de l'ARN.

References

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Do-It-Yourself dispositif de récupération d&#39;échantillons cryoconservés tombé accidentellement dans les réservoirs de stockage cryogéniques
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Cite this Article

Mehta, R., Baranova, A., Birerdinc, A. Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks . J. Vis. Exp. (63), e3903, doi:10.3791/3903 (2012).More

Mehta, R., Baranova, A., Birerdinc, A. Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks . J. Vis. Exp. (63), e3903, doi:10.3791/3903 (2012).

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