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Biology

Do-It-Yourself Einrichtung zur Rückgewinnung von kryokonservierten Proben versehentlich fallengelassen in Kryo-Lagerbehälter

doi: 10.3791/3903 Published: May 11, 2012

Summary

Hier präsentieren wir Ihnen eine kostengünstige, langlebige cryotolerant Gerät zur Probe Abruf von Dewar Tanks mit flüssigem Stickstoff gefüllt. Die Einfachheit der Konstruktion und der modulare Aufbau des Gerätes macht den Prozess der Probe Abruf aus kryogenen Tanks sicher und einfach.

Abstract

Flüssiger Stickstoff ist farblos, geruchlos, extrem kalt (-196 ° C) Flüssigkeit unter Druck gehalten. Es wird allgemein als ein kryogenes Fluid für die langfristige Lagerung von biologischen Materialien wie Blut, Zellen und Geweben 1,2 verwendet. Die kryogene Natur des flüssigen Stickstoffs, während sich ideal für Probenkonservierung, kann dazu führen, schnelles Einfrieren von lebenden Gewebe in Berührung - bekannt als "Kryo-burn" 2, was zu schweren Erfrierungen in nahe stehende Personen in Ein-und Auslagerung von Proben aus Dewars beteiligt führen. Zusätzlich kann, wie flüssigem Stickstoff verdampft reduziert die Sauerstoffkonzentration in der Luft und kann dazu führen, Asphyxie, in geschlossenen Räumen, 2.

In Labors werden biologische Proben oft in Kryoröhrchen Kryoboxen oder in Edelstahl-Racks in den Dewar-Tanks 1 gestapelt gelagert. Diese Regale sind mit einem langen Schaft zu Boxen Herausrutschen aus den Regalen zu verhindern und in den Boden zur Verfügung gestelltDewars während der routinemäßigen Handhabung. Allzu oft jedoch rutschen Kisten oder Flaschen mit wertvollen Proben heraus und sinken auf den Boden von flüssigem Stickstoff gefüllten Tank. In solchen Fällen könnten Proben mühsam nach der Übertragung des flüssigen Stickstoffs in einem freien Container oder verwerfen sie abgerufen werden. Die Kästen und Flaschen können dann relativ sicher von Dewar geleert erholt. Jedoch macht es die kälteerzeugenden von flüssigem Stickstoff und Expansionsrate versunkenen Probe Abruf gefährlich. Es wird allgemein von Sicherheit Büros empfohlen, die Probe Retrieval nie durchgeführt werden, indem eine einzelne Person. Eine weitere Alternative ist im Handel erhältlich kühlen Grabber oder Zange benutzen, sich aus der Fläschchen 3. Allerdings stellt eingeschränkter Sicht in den dunklen Flüssigkeit gefüllt Dewars eine große Einschränkung in ihrer Verwendung.

In diesem Artikel beschreiben wir den Bau einer Cryotolerant DIY Rückholvorrichtung, die Probe macht Abruf von Dewar mit kryogenen Flüssigkeiten sowohl sicher als einND einfach.

Protocol

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1. Versammlung der Cryotolerant Einrichtung zur Abfrage von Kryoboxen

  1. Mit einer Zange, entzerrt einer Seite des 3-seitig Strong-Tie (1A), um einem L-förmigen Strong-Tie in 1B gezeigt ist. Hinweis: Die Abmessungen der Strong-Tie kann in Abhängigkeit von dem Durchmesser des Halses des Dewar werden .
  2. Befestigen Sie zwei so starke Bindungen zu einer-Strong-Tie Band T (Abbildung 2) mit GABELKOPFSCHRAUBE Mutter, Scheibe und Schraube, um die Basis zu bilden Cryoscoop wie in Abbildung 3 (AB) gezeigt. Hinweis: Zwei starke Bindungen werden zur Abfrage von ermöglichen 5 ½ Zoll x 5 ½ Zoll Cryoboxen.
  3. Mit Hilfe eines geschlitzten Platte (Abb. 4), richten Sie die Steckplätze auf der Strong-Tie T Gurt mit den Schlitzen an einem Ende der geschlitzten Platte und sichern Sie die beiden zusammen mit Hilfe von Hillman Mutter und Schrauben (Abbildung 5). Hinweis: Wenn die geschlitzten Platte und die starke Bindung nicht zusammenmich mit vorgebohrten Löchern, müssen Sie haben Löcher gebohrt, mit Hartmetall-Bohrer.
  4. Biegen des anderen Endes der Schlitzplatte mit Hilfe der Zange, so wie in 6 gezeigt. (Dieser Schritt ist optional).
  5. Wickeln Sie den Griff mit Schaumstoff, besser begreifen, wenn das Gerät in flüssigem Stickstoff, wie in Abbildung 6 dargestellt. (Optional) Hinweis: Entfernen Sie den Schaum vor dem Autoklavieren.

2. Versammlung der Cryotolerant Einrichtung zur Abfrage von Kryoröhrchen

Die Cryotolerant DIY Abruf kann auch für das Abrufen von Kryoröhrchen angepasst werden. Dabei ersetzt die flache Basis mit einem Sieb aus Edelstahl, wie gezeigt verändert für Aushöhlungen Fläschchen aus flüssigem Stickstoff (Abbildung 7).

  1. Lösen Sie die Krone Muttern und Bolzen Befestigung des Strong-Tie T Trageriemen an der geschlitzten Platte.
  2. Vor dem Anbringen des Edelstahlsieb an der Schlitzplatte, sanft beugen den Halsdas Sieb mit Hilfe der Zange zu orientieren die Basis in einem Winkel zu einer Schöpfkelle (Abbildung 8) ähneln Hinweis: Wenn das Sieb kommt mit einer Lippen-, Zange verwenden, um die Lippe bücken, das macht das Manövrieren mit dem Gerät erleichtern..
  3. Richten Sie das Loch am Griff des Filters zusammen mit den Löchern auf der geschlitzten Platte und sichern Sie das Sieb mit Hilfe von Hillman Muttern und Schrauben wie in Abbildung 8 dargestellt. Hinweis: wenn das Sieb nicht mit vorgebohrten Löchern kommen, müssen Sie zu arrangieren, um Löcher mit Hartmetall-Bohrer gebohrt haben.

3. Abrufen und Kryoröhrchen Kryoboxen Von Dewar

  1. Um zu beginnen, auf Tieftemperatur-Handschuhe an und entfernen Sie 1 oder 2 Gefriergestelle aus dem Dewar, um Platz zum Manövrieren zu ermöglichen.
  2. Vorsichtig entlang der Unterseite des Dewar mit dem aufrechten Cryotolerant DIY Rückholvorrichtung mit Strong-Tie T Gurt Basis (Abbildung 5) ausgerüstet kratzen und sammeln Sie die Box fallen auf den Boden des Tanks Dewar. Hinweis: Flüssiger Stickstoff siedet sofort bei Kontakt mit einer wärmeren Objekt, das Objekt in umhüllenden Isolierschicht Stickstoffgas (Leidenfrosteffekt). Um das Gerät vor zu kühlen, um Abrufen von Proben, langsam Tauchen Sie das Gerät in das Dewar und erlauben flüssigem Stickstoff, um das Gerät ausreichend abkühlen, bevor Sie mit dem obigen Schritt.
  3. Ziehen Sie das Gerät aufrecht an den Wänden des Dewar, um die Tiefkühltruhe aus dem Tank zu schaufeln.
  4. Besorgen Sie sich die Box aus dem Boden des Dewar abgerufen.
  5. Zum Abrufen von Kryoröhrchen, sanft kratzen den Boden des Dewar mit dem cryoscoop mit einem Sieb (Abbildung 9) ausgestattet.
  6. Ähnlich wie bei Kryobox Retrieval, ziehen Sie das Gerät aufrecht und ergreifen Sie die Fläschchen im Sieb aufgefangen.

4. Repräsentative Ergebnisse

Eine große Herausforderung in der Genexpression Studien ist, dass die Qualität der RNA von den Lagerbedingungen abhängigfür die beiden eingefrorenen Gewebeproben extrahiert und RNA-4. Abbildung 10 zeigt die Wirkung der Handhabung der Proben auf die Integrität von Gesamt-RNA. Gesamt-RNA aus dem gleichen Gewebe Quelle (menschliche Fettgewebe) wurde zu verschiedenen Probenhandhabung unterzogen. Vor dem Experiment zeigt intakte Gesamt-RNA-Präparat klar 28S und 18S rRNA-Banden mit der 28S-rRNA-Band etwa doppelt so intensiv wie die 18S-rRNA-Bande (Abbildung 10, Spur 1). Dieses Verhältnis von 2:1 (28S: 18S) ist ein Indiz dafür, dass die RNA intakt ist, während partiell abgebauten RNA erscheint als ein Abstrich oder seine 28S: 18S Intensitätsverhältnis fährt von 2.01 5. Lanes 3-4 zeigt RNA-Proben mit einem signifikanten Abbau. Diese RNA-Proben wurden wiederholt auftauen teilweise durch kurzfristige Abfragen im Dewar (Methode A) unterzogen, wodurch die Modellierung der Langzeitlagerung mit periodischen Dekantieren wegen Notwendigkeit der Rückholung der gefallenen Flaschen und Kisten (Abbildung 10, Lane 4.3 ). Allerdings Proben in Dewar gewartet gespeichertVerwendung DIY Vorrichtung (Verfahren B) und somit keine teilweise Abtauung enthalten intakte RNA (10, Spur 2).

1
Abbildung 1. A) Die Bemessungsgrundlage besteht aus zwei 3-seitige Strong-Tie von Dimensionen gezeigt. Jeder Strong-Tie enthält eine große vorgebohrte Loch (durchgezogener Pfeil) und mehrere kleinere Löcher (kleiner Pfeil) auf jeder Seite. Dies bietet eine Option, damit die Befestigung mit Mutter und Bolzen. Auch die kleineren Löcher ermöglichen die schnelle Ableitung von flüssigem Stickstoff während Probe Abruf. B) Eine Seite von jedem der starken Bindung mit Hilfe einer Zange, um L-förmigen Strong-Tie gerichtet ist.

2
2. Strong-Tie T Riemen verwendet wird, um die starken-Bindungen aneinander zu befestigen. Wie Strong-Tie, hat T-Gurt ein großer vorgebohrte Loch (durchgezogener Pfeil) und zwei kleinere Löcher (small Pfeil) an jeder Ecke. Dies ermöglicht die Sicherung starke-ten entlang der Länge des T - Strap mit Muttern und Bolzen. Es ermöglicht auch Befestigungs-T-Gurt an den geschlitzten Platte.

Abbildung 3
Abbildung 3. A) Jeder Strong-Tie wird an einer Ecke des T-Gurt befestigt, über seine Länge mit Krone Bolzen Muttern, Bolzen und Unterlegscheiben. B) Zwei starke-schaften sind benachbart aneinander befestigt werden, um abzurufen 5 ½ Zoll x 5 ½ in. Cryoboxen. Für kleinere Cryoboxen wie 2 Zoll x 2 Zoll, kann ein einzelner Strong-Tie direkt an die geschlitzte Platte befestigt werden, ohne eine T-Riemen.

Abbildung 4
Abbildung 4. Schlitz flache Platte als Griff dient. Länge der Schlitzplatte hängt von der Tiefe des Dewar. In diesem Fall wurde 4 Fuß von geschlitzten Platte verwendet. Die Dicke der geschlitzten Platte ist entscheidend, seit dünne geschlitzte Platten (<14 Manometer) machen das Gerät fadenscheinigen beim Abrufen von Proben aus flüssigem Stickstoff gefüllten Dewar.

Abbildung 5
Bild 5. Der flache Boden, bestehend aus starken Bindungen und T Gurt wird dann an einem Ende der geschlitzten Platte befestigt ist. Die größere Bohrung auf dem verbleibenden Ecke des T Gurt wird mit dem Schlitz auf der flachen Platte ausgerichtet und befestigt mit Hex-Schraube und Mutter. Dieses Gerät kann nun verwendet werden, um Cryoboxen von Dewar abzurufen.

6
6. Ein Ende des geschlitzten flachen Platte gebogen ist und mit einer Zange mit Schaum bedeckt besser zu greifen besonders bei tiefen Dewars, wie im vorliegenden Fall gezeigt wird.

7
Abbildung 7. Schmutzfänger mit Drahtgitter und Edelstahl-Griffwird verwendet, um Kryoröhrchen von Dewar abzurufen. Wenn der Griff nicht mit einem Schlitz versehen ist, mit Hartmetall-Bit-Bohrer wird zum Bohren eines Lochs erforderlich.

8
Abbildung 8. Um das Abrufen Kryoröhrchen zu erleichtern, ist Sieb entlang des Halses mit einer Zange zu Kelle geformten Sieb bekommen gebogen. Wenn Sieb mit Lippe wie in diesem Fall vorgesehen ist, kann Zangen verwendet werden, um es zu biegen. Dadurch wird sichergestellt, Sieb nicht innerhalb der Dewar verfangen.

Abbildung 9
Abbildung 9. Schmutzfänger an den geschlitzten flache Platte an einem Ende befestigt mit Hex-Schraube und Mutter.

Abbildung 10
Abbildung 10. Die Integrität der Probe von Gesamt-RNA zu unterschiedlichen Umgang mit den Proben unterworfen. Um zu untersuchen, wie RNA-Qualität durch Probenhandhabung c ist betroffenie Bedingungen, wurde eine Reihe von RNA-Proben aus der gleichen Quelle zwei Methoden der Handhabungen unterworfen. Methode A bestand aus Lagerung von RNA in Dewar-Probe unterzogen, um Abfragen mit DIY-Gerät, damit kein teilweiser auftauen. Verfahren B aus der Lagerung von RNA in Dewar einer wiederholten teilweisen Abtauung durch kurzfristige Abfragen im Dewar, damit Modellierung Langzeitlagerung mit periodischen Dekantieren zum Abrufen gefallen Proben. Gesamt-RNA-Integrität wurde dann durch Gelelektrophorese analysiert. Lane1: Probe vor der Lagerung in Dewar, Spur 2: Probe von Dewar unterzogen, um den Abruf durch Methode A, Spur 3, 4: Probe von Dewar unterzogen, um den Abruf durch Methode B, M: 100 bp Leiter.

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Discussion

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Eine der gängigsten Methoden zum Abrufen und Cryoboxen Kryoröhrchen aus dem Boden des Dewar-Tank ist in flüssigen Stickstoff in einen freien Behälter umfüllen und ziehen Sie die Proben im Kolben verbliebene oder schwebend in der dekantiert flüssigem Stickstoff. Dies ist jedoch eine unsichere Praxis, die kryogene Verbrennungen oder Erstickung durch längere Exposition gegenüber flüssigem Stickstoff 2 Dämpfe verursachen können. Andere gemeinsamen Weg bei der Abfrage von gefallenen Kryoröhrchen beinhaltet die Verwendung von 3-Kryoröhrchen Zange. Allerdings schränkt die eingeschränkte Sicht im dunklen Raum des Tanks mit flüssigem Stickstoff gefüllt ihre Wendigkeit.

Die Cryotolerant DIY Rückholvorrichtung oben beschrieben bietet eine billigere, sicherere und einfachere Alternative zum Abrufen gefallen Cryoboxen und Kryoröhrchen von der Unterseite der tiefen Flaschen mit eingeschränkter Sicht. Die einfache Handhabung des DIY Rückholvorrichtung umgeht die Notwendigkeit, die Flaschen vor dem Abruf zu leeren. Darüber hinaus ist die retrieval der Kryoröhrchen mit Hilfe der Vorrichtung aus können von einer einzigen Person ausgeführt werden. Außerdem ist die Verwendung der DIY Abrufvorrichtung wesentlich verkürzt die Zeit, anderen Proben in der gleichen Einheit zu verbringen unter Raumtemperatur gelagert, wodurch Probe Lagerbedingungen 6,7.

Viele häufig verwendete Materialien wie Kunststoff, Stahl und Gummi werden in flüssigem Stickstoff spröde und oft unter Stress 8,9,10 brechen. Die Edelstahl-oder verzinkten Bauteilen in der DIY-Gerät verwendet werden, sind resistent gegenüber von Temperaturen unter dem Gefrierpunkt von kryogenen Flüssigkeiten beschädigt werden. Darüber hinaus sind diese Komponenten leicht zugänglich in lokalen Baumärkten und der niedrigen Kosten mit dem Bau der DIY-Gerät in Höhe von weniger als 50,00 $. Der lange Stiel verhindert, dass Betreiber von direktem Kontakt mit den kryogenen Flüssigkeiten und des perforierten Bodens und Sieb ermöglichen sofortige Ablassen von flüssigem Stickstoff während der Probe Erholung. Die rasante retrieval ermöglicht Minimierung der Exposition gegenüber flüssigem Stickstoff Dämpfe machen Probe Retrieval eine sicherere Verfahren. Aufgrund seines modularen Aufbaus hat der DIY Rückholvorrichtung die Flexibilität, entweder für Boxen oder Fläschchen verwendet werden. Darüber hinaus erlaubt die Einfachheit des Designs, um das Gerät für Dewars von unterschiedlichen Formen und Größen und möglicherweise mit anderen Arten von kryogenen Flüssigkeiten arbeiten angepasst werden. Die Verwendung dieser Vorrichtung kann jedoch bei kryogenen Behälter, die nicht einen flachen Boden begrenzt werden.

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Disclosures

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Acknowledgments

DIY kryogenen Rückholvorrichtung hatte im Laufe der Projekte "Modellierung bakterieller Proteinprenylierung in eukaryotischen Zellen mit Hilfe der Bioinformatik und molekulare Ansätze" von Mary Louise Andrews Award for Cancer Research Program, Virginia Akademie der Wissenschaften gefördert ", physiologische Bedeutung von RNA-Editing in Plasma getestet Dendritische Zellen "von The Thomas F. Jeffress und Kate Miller Jeffress Memorial Trust und Staatsvertrages 16.740.11.0364 (Ministerium für Wissenschaft und Bildung, Russland) gesponsert. Wir möchten Beth Eom für die Unterstützung bei der RNA-Integrität Experiment danken.

References

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Do-It-Yourself Einrichtung zur Rückgewinnung von kryokonservierten Proben versehentlich fallengelassen in Kryo-Lagerbehälter
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Cite this Article

Mehta, R., Baranova, A., Birerdinc, A. Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks . J. Vis. Exp. (63), e3903, doi:10.3791/3903 (2012).More

Mehta, R., Baranova, A., Birerdinc, A. Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks . J. Vis. Exp. (63), e3903, doi:10.3791/3903 (2012).

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