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Biology

Do-It-Yourself dispositivo per il recupero di campioni crioconservati cadere accidentalmente nelle cisterne criogeniche

doi: 10.3791/3903 Published: May 11, 2012

Summary

Presentiamo qui un basso costo, durevole cryotolerant dispositivo per il recupero del campione da serbatoi Dewar riempiti con azoto liquido. La facilità di costruzione e la progettazione modulare del dispositivo rende il processo di recupero campione da serbatoi criogenici sicuro e facile.

Abstract

L'azoto liquido è incolore, inodore, estremamente freddo (-196 ° C) di liquido mantenuto sotto pressione. È comunemente usato come fluido criogenico per conservazione a lungo termine di materiali biologici come sangue, cellule e tessuti 1,2. La natura criogenico di azoto liquido, mentre l'ideale per la conservazione del campione, può causare congelamento rapido dei tessuti vivi a contatto - noto come 'criogenico burn' 2, che possono portare a gravi congelamenti in persone strettamente coinvolte nella conservazione e il recupero dei campioni di Dewars. Inoltre, come azoto liquido evapora riduce la concentrazione di ossigeno nell'aria e possono causare asfissia, specialmente in spazi ristretti 2.

Nei laboratori, i campioni biologici sono spesso conservati in cryovials cryoboxes o impilati in rack in acciaio inox all'interno dei serbatoi Dewar 1. Questi scaffali sono provvisti di un albero lungo per evitare scatole di scivolare fuori dai rack e sul fondo dellaDewars durante la routine di gestione. Troppo spesso, tuttavia, scatole o fiale con i campioni preziosi scivolare fuori e si depositano sul fondo del serbatoio di azoto liquido riempito. In tali casi, i campioni possono essere tediously recuperato dopo il trasferimento della azoto liquido in un contenitore di riserva o eliminazione. Le scatole e flaconi possono essere relativamente sicuro recuperato dal svuotato Dewar. Tuttavia, la natura criogenico di azoto liquido e il suo tasso di espansione rende pericolosa affondata il recupero del campione. È comunemente raccomandato da Uffici sicurezza che il recupero del campione non essere effettuata da una sola persona. Un'altra alternativa è quella di utilizzare grabber fresche reperibili in commercio o pinze per estrarre i flaconi 3. Tuttavia, la visibilità limitata all'interno degli oscuri Dewars pieni di liquido costituisce un grande limite nel loro utilizzo.

In questo articolo, si descrive la costruzione di un dispositivo di recupero Cryotolerant fai da te, che rende il recupero del campione da Dewar contenente liquidi criogenici sia sicuro unond facili.

Protocol

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1. Montaggio del dispositivo per il recupero di Cryotolerant Cryoboxes

  1. Utilizzando pinza, raddrizzare un lato di 3 lati forte legame (Figura 1A) per effettuare una forma di L-forte legame nota mostrata in figura 1B:. Le dimensioni del forte legame-può essere selezionata a seconda del diametro del collo di Dewar .
  2. Fissare due tali forte legame con un forte legame cinghia T (figura 2) utilizzando corona dado del bullone, la rondella e la vite per formare la base Cryoscoop come mostrato in Figura 3 (AB) Nota:. Due legami forti vengono utilizzati per consentire il recupero dei 5 ½ pollici X 5 ½ pollici cryoboxes.
  3. Utilizzando una piastra scanalata (figura 4), ​​allineare le aperture sul forte legame cinturino T con le scanalature su un'estremità della piastra asolata e fissare i due insieme con l'aiuto di dado Hillman e bulloni (Figura 5). Nota: Se la piatto forato e forte legame non si come con fori predisposti, si dovrà avere fori praticati con punta in metallo duro.
  4. Piegare l'altra estremità della piastra asolata con l'aiuto di una pinza come mostrato in Figura 6. (Questo passaggio è facoltativo).
  5. Avvolgere la maniglia con schiuma di comprendere meglio il dispositivo quando in azoto liquido, come mostrato nella Figura 6. (Opzionale) Nota: rimuovere la schiuma prima della sterilizzazione in autoclave.

2. Montaggio del dispositivo per il recupero di Cryotolerant Cryovials

Il Cryotolerant dispositivo di recupero fai da te può essere adattato anche per il recupero di cryovials. Ciò comporta sostituire la base piana con un filtro in acciaio inossidabile come mostrato alterato per scavando flaconi da azoto liquido (Figura 7).

  1. Svitare i dadi della Corona e bulloni che fissano il forte legame cinghia T alla piastra asolata.
  2. Prima di applicare il filtro in acciaio inox alla piastra asolata, flettere leggermente il colloil filtro con l'aiuto di pinze per orientare la base ad un angolo per assomigliare ad una siviera (Figura 8) Nota: Se il filtro è dotato di un labbro, utilizzare una pinza per piegare il labbro basso, questo renderà manovre con il dispositivo più facile..
  3. Allineare il foro sul manico del filtro con i fori sulla piastra asolata e fissare il filtro con l'aiuto di Hillman dadi e bulloni, come mostrato nella Figura 8. Nota: se il filtro non viene fornito con fori predisposti, sarà necessario di organizzare per avere fori con la punta in metallo duro.

3. Recupero Cryoboxes e Cryovials Da Dewar

  1. Per iniziare, indossare guanti criogenici e togliere 1 o 2 rack freezer dal Dewar per lasciare spazio di manovra.
  2. Raschiare delicatamente lungo la parte inferiore del Dewar con il montante Cryotolerant dispositivo di recupero fai da te dotata di una forte base di strap tie-T (Figura 5) e raccogliere l'Falle boxn al fondo del serbatoio Dewar Nota:. bolle azoto liquido immediatamente a contatto con un oggetto più caldo, avvolgente l'oggetto in isolante gas azoto (effetto Leidenfrost). Per raffreddare il dispositivo di recupero prima di campioni, lentamente immergere il dispositivo nella Dewar e consentire azoto liquido per raffreddare il dispositivo sufficientemente prima di procedere con la fase precedente.
  3. Tirare il dispositivo in posizione verticale lungo le pareti del Dewar per raccogliere la scatola freezer dal serbatoio.
  4. Afferrare la scatola recuperata dal fondo della Dewar.
  5. Per il recupero cryovials, delicatamente raschiare il fondo del Dewar con la cryoscoop munito di un filtro (Figura 9).
  6. Simile a cryobox recupero, estrarre il dispositivo in posizione verticale e prendere le fiale raccolti nel filtro.

4. Risultati rappresentativi

Una sfida in studi di espressione genica è che la qualità dell'RNA dipende dalle condizioni di conservazioneper entrambi i campioni di tessuto congelato e la Figura estratto RNA 4. 10 mostra l'effetto della manipolazione del campione sull'integrità di RNA totale. L'RNA totale dalla sorgente stesso tessuto (adiposo umano) è stato sottoposto a manipolazione dei campioni differenti. Prima di esperimento, intatto RNA totale preparato mostra chiare bande 28S e 18S rRNA con la banda 28S rRNA approssimativamente due volte più intenso come la banda 18S rRNA (Figura 10, corsia 1). Questo rapporto 2:1 (28S: 18S) è un'indicazione che l'RNA è intatto, mentre parzialmente degradata RNA appare come una macchia, o la sua 28S: intensità 18S rapporto parte da 2:01 5. Lanes 3-4 raffigura campioni di RNA con una degradazione significativa. Questi campioni di RNA sono stati sottoposti a ripetuti scongelamento parziale di breve termine richiami il Dewar (metodo A), modellando così stoccaggio a lungo termine con periodica decantazione a causa della necessità di recuperare il fiale caduta e caselle (Figura 10, corsia 3-4 ). Tuttavia, i campioni conservati in Dewar servitoutilizzare un dispositivo DIY (Metodo B) e, quindi, non scongelamento parziale, contengono RNA intatto (Figura 10, corsia 2).

Figura 1
Figura 1. A) La base è costituito da due tre lati dimensioni indicate forte della cravatta. Ogni forte legame contiene una grande pre-forate per infilare (freccia solido) e fori più piccoli (più piccola freccia) su ciascuna faccia. Questo fornisce un opzione per consentire il fissaggio con dado e bulloni. Anche i fori più piccoli consentono il rapido deflusso del liquido durante il recupero del campione. B) Un lato di ogni della forte legame viene raddrizzata con l'aiuto di una pinza per rendere L sagomato forte legame.

Figura 2
Figura 2. Strong-tie strap T viene utilizzato per proteggere i forti legami di insieme. Come forte legame, T-strap ha una grande pre-forate per infilare (freccia piena) e due fori più piccoli (SMALl freccia) in ogni angolo. Questo permette di fissaggio forte legame per tutta la lunghezza del T - Strap con viti e bulloni. Consente inoltre di fissaggio T-strap alla piastra asolata.

Figura 3
Figura 3. A) Ogni forte legame è fissata in un angolo di T-strap, tutta la sua lunghezza con i dadi dei bulloni corona, bulloni e rondelle. B) Due forte di legami sono fissati uno accanto all'altro per aiutare recuperare 5 ½ X 5 ½ pollici dentro cryoboxes. Per i più piccoli cryoboxes come 2 mm x 2 pollici, un unico forte legame può essere fissato direttamente alla piastra asolata senza T-strap.

Figura 4
Figura 4. Intaglio piastra piatta viene utilizzato come impugnatura. Lunghezza della piastra asolata dipende dalla profondità della Dewar. In questo caso, 4 piedi di piastra asolata stato utilizzato. Lo spessore della piastra scanalata s è criticacia sottili lastre scanalate (<14 calibri) rendere il dispositivo fragile durante il recupero di campioni di azoto liquido riempito Dewar.

Figura 5
Figura 5. La base piana costituita da forti legami di cinghia e T è poi fissato ad una estremità della piastra asolata. Il buco più grande all'angolo rimanente della cinghia T è allineata con la fessura sulla piastra piatta e fissata con bulloni e dado esagonale. Questo dispositivo può essere ora utilizzato per recuperare cryoboxes da Dewar.

Figura 6
Figura 6. Una estremità della piastra scanalata piana è piegata con una pinza e ricoperto di poliuretano per fornire una migliore aderenza soprattutto per Dewars profonde, come mostrato in questo caso.

Figura 7
Figura 7. Filtro con rete metallica e maniglia in acciaio inoxviene utilizzato per recuperare cryovials da Dewar. Se la maniglia non è provvisto di una scanalatura, con trapano bit carburo saranno necessari per la perforazione di un foro.

Figura 8
Figura 8. Per facilitare il recupero dei cryovials, filtro viene piegata lungo il collo con una pinza per ottenere filtro a forma di mestolo. Se il filtro è dotato di labbro come in questo caso, pinze possono essere utilizzati per piegarlo. In questo modo il filtro non rimanere intrappolati all'interno della Dewar.

Figura 9
Figura 9. Filtro è fissata alla piastra asolata piatta ad una estremità con dado e bullone.

Figura 10
Figura 10. L'integrità del campione di RNA totale sottoposta a diverse condizioni di gestione dei campioni. Per esplorare come la qualità RNA è influenzato dal campione gestione condizioni, una serie di campioni di RNA dalla stessa fonte è stato sottoposto a due metodi di manipolazioni. Metodo A consisteva di stoccaggio di RNA in Dewar sottoposto a recuperi di esempio utilizzando dispositivo fai da te, quindi non scongelamento parziale. Metodo B consisteva di stoccaggio di RNA in Dewar sottoposto a ripetute scongelamento parziale a breve termine richiami effettuati nell'ambito del Dewar, modellando così una conservazione a lungo termine con travasi periodici per il recupero dei campioni caduti. Integrità RNA totale è stato poi analizzato mediante elettroforesi su gel. Lane1: campione prima dello stoccaggio in Dewar; Lane 2: esempio da Dewar sottoposto a recupero secondo il metodo A; Lane 3, 4: Esempio da Dewar sottoposti a recupero con il metodo B, M: ladder 100 bp.

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Discussion

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Uno dei metodi più comuni di recupero cryoboxes e cryovials dal fondo del serbatoio Dewar è decantare azoto liquido in un contenitore di riserva ed estrarre i campioni rimanenti nel pallone o galleggiare in azoto liquido decantato. Questo è, tuttavia, una pratica sicura, che può provocare ustioni criogeniche o di asfissia a causa di una prolungata esposizione ai vapori di azoto liquido 2. Altro modo comune per il recupero dei caduti cryovials comporta l'uso di pinze esageratamente 3. Tuttavia, la visibilità limitata nello spazio scuro del serbatoio riempito con azoto liquido limita la manovrabilità.

Il Cryotolerant dispositivo di recupero fai da te descritto sopra fornisce un'alternativa più economica, più sicura e più facile per il recupero dei caduti e cryoboxes cryovials dal fondo di palloni profondi con visibilità limitata. La facilità di gestire il dispositivo di recupero fai da te elude la necessità di svuotare i contenitori prima di utilizzarli. Inoltre, il retrieval di esageratamente con l'ausilio di detto dispositivo può essere effettuata da un singolo individuo. Inoltre, l'uso del dispositivo di recupero DIY riduce sostanzialmente la quantità di tempo altri campioni memorizzati nella stessa unità trascorrere condizioni di temperatura ambiente, migliorando così le condizioni di conservazione del campione 6,7.

Molti materiali comunemente usati come plastica, acciaio al carbonio e gomma diventano fragili in azoto liquido, e spesso sotto stress frattura 8,9,10. I componenti in acciaio inox o zincato utilizzati nel dispositivo DIY sono resistenti ai danni da sub-congelamento temperature di fluidi criogenici. Inoltre, questi componenti sono facilmente reperibili nei negozi di ferramenta locali e di basso costo con la costruzione del dispositivo DIY pari a meno di $ 50.00. Il manico lungo impedisce operatore dal contatto diretto con i fluidi criogenici e la base forata e filtro permettono istantanea drenaggio del liquido durante il recupero del campione. Il r rapidaetrieval permette minima esposizione ai vapori di azoto liquido rendendo il recupero del campione di un processo più sicuro. Grazie al suo design modulare, il dispositivo di recupero fai da te ha la flessibilità necessaria per essere utilizzato sia per scatole o flaconi. Inoltre, la semplicità del disegno consente al dispositivo di essere adattato per Dewars di diverse forme e dimensioni ed eventualmente di lavorare con altri tipi di fluidi criogenici. L'uso di questo dispositivo può, tuttavia, essere limitata nel caso di serbatoi criogenici che non hanno un fondo piatto.

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Disclosures

Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

Acknowledgments

DIY criogenico dispositivo di recupero era stato testato in corso dei progetti "prenilazione proteica Modeling batteriche nelle cellule eucariotiche usando la bioinformatica e approcci molecolari", promosso dal Premio Mary Louise Andrews per il programma di ricerca sul cancro, Virginia Academy of Science ", significato fisiologico di RNA editing in Plasma Le cellule dendritiche "promosso dal Jeffress F. Thomas e Kate Miller Jeffress Memorial Trust e contratto 16.740.11.0364 Stato (Ministero della Scienza e Istruzione, Russia). Vorremmo ringraziare Beth Eom per l'assistenza con l'esperimento integrità RNA.

References

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  4. Muyal, J., Muyal, V., Kaistha, B., Seifart, C., Fehrenbach, H. Systematic comparison of RNA extraction techniques from frozen and fresh lung tissues: checkpoint towards gene expression studies. Diagnostic Pathology. 4, 9 (2009).
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Do-It-Yourself dispositivo per il recupero di campioni crioconservati cadere accidentalmente nelle cisterne criogeniche
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Cite this Article

Mehta, R., Baranova, A., Birerdinc, A. Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks . J. Vis. Exp. (63), e3903, doi:10.3791/3903 (2012).More

Mehta, R., Baranova, A., Birerdinc, A. Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks . J. Vis. Exp. (63), e3903, doi:10.3791/3903 (2012).

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