Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Gjør-det-selv Enhet for gjenoppretting av Cryopreserved Prøver uhell falt inn Kryogeniske lagertanker

doi: 10.3791/3903 Published: May 11, 2012

Summary

Her presenterer vi en lav kostnad, slitesterk cryotolerant enhet for sample henting fra Dewar tanker fylt med flytende nitrogen. Den enkle konstruksjonen og modulære utformingen av enheten gjør prosessen med prøven henting fra kryogene tanker trygt og enkelt.

Abstract

Flytende nitrogen er fargeløs, luktfri, ekstremt kaldt (-196 ° C) væsken holdes under press. Den brukes ofte som en kryogen væske for langsiktig lagring av biologisk materiale som blod, celler og vev 1,2. Den kryogenisk natur flytende nitrogen, mens ideell for prøve bevaring, kan føre til rask frysing av levende vev ved kontakt - kjent som "kryogen burn '2, som kan føre til alvorlig forfrysning i personer involvert i lagring og gjenfinning av prøver fra Dewars. I tillegg, som flytende nitrogen fordamper det reduserer oksygenkonsentrasjonen i luften og kan forårsake kvelning, spesielt i trange rom 2.

I laboratorier, er biologiske prøver ofte lagret i cryovials eller cryoboxes stablet i rustfritt stål reoler innenfor Dewar tanks 1. Disse lagring stativer er utstyrt med en lang sjakt for å hindre bokser sklir ut fra stativet og inn i bunnen avDewars under rutinemessig håndtering. Alt for ofte, men bokser eller flasker med edle prøver gli ut og synker til bunnen av flytende nitrogen fylt tanken. I slike tilfeller kan prøvene tediously hentes Etter overføring av flytende nitrogen til et ekstra container eller forkaster det. Boksene og hetteglass kan da være relativt trygt utvinnes fra tømt Dewar. Men gjør kryogenisk natur flytende nitrogen og dens ekspansjon sats nedsunket prøven henting farlig. Det er ofte anbefalt av Safety Kontorer at prøven gjenfinning aldri utføres av en enkelt person. Et annet alternativ er å bruke kommersielt tilgjengelige kule grabbers eller tang for å trekke ut de hetteglassene 3. Samtidig er begrenset sikt i de mørke væskefylte Dewars en stor begrensning i bruken.

I denne artikkelen beskriver vi byggingen av et Cryotolerant DIY henting enhet, som gjør prøven henting fra Dewar inneholder kryogene væsker både sikkert ennd enkle.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Montering av Cryotolerant Enhet for henting av Cryoboxes

  1. Ved hjelp av tang, rette ut en side av 3 sided sterk-tie (figur 1A) for å gjøre en L-formet sterke tie vist i figur 1B. Merk: Dimensjonene på sterk-slips kan velges avhengig av diameteren på halsen av Dewar .
  2. Sikre to slike sterke-bånd med en sterk-tie T stropp (figur 2) med Crown bolt mutter, skive og skrue for å danne Cryoscoop basen som vist i Figur 3 (AB). Merk: To sterke bånd brukes til å tillate innhenting av 5 ½ tommer X 5 ½ i. cryoboxes.
  3. Bruke en slotted plate (figur 4), justere sporene på sterke-tie T stropp med sporene på den ene enden av slotted plate og sikre de to sammen med hjelp av Hillman mutter og bolter (figur 5). Merk: Hvis slotted plate og sterk slips er ikke co ikkemeg med pre-boret hull, må du ha hull bores med karbid borekronen.
  4. Bøy den andre enden av slotted plate ved hjelp av tang som vist i Figur 6. (Dette trinnet er valgfritt).
  5. Pakk håndtaket med skum for å bedre forstå enheten når den er i flytende nitrogen som vist i Figur 6. (Valgfritt) Merk: Fjern skummet før autoklavering.

2. Montering av Cryotolerant Enhet for henting av Cryovials

Den Cryotolerant DIY gjenfinning enheten kan også tilpasses for gjenfinning av cryovials. Dette innebærer å erstatte den flate basen med en rustfritt stål sil som vist endret for scooping ut ampuller fra flytende nitrogen (figur 7).

  1. Skru den Crown muttere og bolter som fester sterke-tie T stroppen til slotted plate.
  2. Før du fester i rustfritt stål sil til slotted plate, forsiktig bøye nakkensilen ved hjelp av tang for å orientere basen på skrå for å ligne en sleiv (Figur 8) Merk: Hvis sil kommer med en leppe, bruke tang for å bøye leppe ned, dette vil gjøre manøvrering med enheten enklere..
  3. Juster hullet på håndtaket på sil sammen med hullene på slotted plate og sikre sil med hjelp av Hillman muttere og bolter som vist i Figur 8. Merk: hvis silen ikke kommer med pre-boret hull, må du å sørge for å ha hull boret med karbid borekronen.

3. Hente Cryoboxes og Cryovials Fra Dewar

  1. For å begynne, ta på kryogene hansker og fjern 1 eller 2 frys stativene fra Dewar å gi plass til manøvrering.
  2. Forsiktig skrape langs bunnen av Dewar med oppreist Cryotolerant DIY gjenfinning enhet utstyrt med sterk-tie T stropp base (figur 5) og samle boksen fallen til bunnen av Dewar tank. Merk: Flytende nitrogen koker umiddelbart ved kontakt med en varmere gjenstand, omslutter objektet i isolerende nitrogen gass (Leidenfrost effekt). Å kjøle enheten før henting av prøver, sakte senk apparatet i Dewar og la flytende nitrogen til å kjøle enheten tilstrekkelig før du fortsetter med trinnet ovenfor.
  3. Trekk enheten oppreist langs veggene i Dewar å øse fryseren boksen ut av tanken.
  4. Grab boksen hentes fra bunnen av Dewar.
  5. For henting cryovials, forsiktig skrape bunnen av Dewar med cryoscoop utstyrt med en sil (figur 9).
  6. I likhet med cryobox henting, trekk enheten oppreist og ta tak i hetteglassene samlet i silen.

4. Representative Resultater

En hovedutfordring i genekspresjon studier er at kvaliteten på RNA avhenger av lagringsforholdenefor både frosne vevsprøver og hentet RNA 4. Figur 10 viser effekten av prøvehåndtering på integritet av total RNA. Totale RNA fra samme vev kilde (human adipose) ble utsatt for annen prøvehåndtering. Før eksperimentet viser intakt total RNA preparate klare 28S og 18S rRNA band med 28S rRNA bandet omtrent dobbelt så intens som den 18S rRNA bandet (Figur 10, kjørefelt 1). Dette forholdet 2:1 (28S: 18S) er en indikasjon på at RNA er intakt, mens delvis degradert RNA vises som en smear, eller 28S: 18S intensitet forholdet avviker fra 02:01 fem. Lanes 3-4 skildrer RNA prøver med betydelig degradering. Disse RNA prøver ble utsatt for gjentatt delvis defreezing av kortsiktige hentes fra Dewar (Metode A), og dermed modellering langtidslagring med periodisk dekantering grunn nødvendigheten av henting av den falne ampuller og bokser (Figur 10, Lane 3-4 ). Men prøver lagret i Dewar servicebruker DIY enhet (Metode B), og dermed ingen delvis defreezing, inneholder intakte RNA (Figur 10, 2 Lane).

Figur 1
Figur 1. A) Basen består av to tre tosidige sterk-tie visningsantall dimensjoner. Hver sterk-tie inneholder en stor pre-boret hull (solid pil) og flere mindre hull (liten pil) på hver ansiktet. Dette gir en mulighet til å tillate feste med mutter og bolter. Også de mindre hullene tillate rask drenering av flytende nitrogen under prøven henting. B) Den ene siden av hver av de sterke-tie er rettet ved hjelp av en tang for å lage L-formet sterk-tie.

Figur 2
Figur 2. Strong-Tie T stropp brukes til å sikre de sterke båndene sammen. Som sterk-tie, har T-stropp en stor pre-boret hull (solid pil) og to mindre hull (small pil) på hvert hjørne. Dette gjør sikre sterke bånd langs lengden av T - Strap bruker nøtter og bolt. Det gjør også feste T-stropp til slotted plate.

Figur 3
Figur 3. A) Hver sterk-tie er festet til det ene hjørnet av T-stropp, langs dens lengde med krone bolt muttere, bolter og skiver. B) To sterke båndene er sikret ved siden av hverandre for å hjelpe hente 5 ½ tommer X 5 ½ i. cryoboxes. For mindre cryoboxes eksempel 2 tommer X 2 tommer, kan en enkelt sterk-tie festes direkte til slotted plate uten en T-stropp.

Figur 4
Figur 4. Slotted flat plate brukes som håndtak. Lengde på slotted plate avhenger av dybden av Dewar. I dette tilfellet ble 4 meter slisset plate brukt. Tykkelsen på slotted plate er kritisk siden tynne slissede plater (<14 målere) er enheten spinkel mens hente prøver fra flytende nitrogen fylt Dewar.

Figur 5
Figur 5. Den flate basen bestående av sterke, slips og T stroppen er da sikret ved den ene enden av slotted plate. Jo større hull på de resterende hjørnet av T stroppen er på linje med sporet på flat tallerken og festes med hex bolt og mutter. Denne enheten kan nå brukes til å hente cryoboxes fra Dewar.

Figur 6
Figur 6. Ene enden av slotted flat plate er bøyd bruker tang og dekket med skum for å gi bedre grep, spesielt for dype Dewars, som vist i denne saken.

Figur 7
Figur 7. Sil med netting og rustfritt stål håndtakbrukes til å hente cryovials fra Dewar. Hvis håndtaket ikke er utstyrt med et spor, drill med karbid bit vil være nødvendig for å bore et hull.

Figur 8
Figur 8. Å lette gjenfinning av cryovials, er silen bøyd langs halsen på tang for å få øse formet sil. Dersom sil leveres med leppe som i dette tilfellet, kan tang brukes til å bøye den. Dette sikrer sil ikke blir fanget innenfor Dewar.

Figur 9
Figur 9. Sil er festet til slotted flat plate på ene enden bruker hex mutter og bolt.

Figur 10
Figur 10. Eksempel integritet av totalt RNA utsatt for ulike prøvehåndtering forhold. Å utforske hvordan RNA kvalitet påvirkes av prøvehåndtering conditions, ble et sett av RNA prøver fra samme kilde utsatt for to metoder for handlings. Metode A besto av lagring av RNA i Dewar utsatt for eksempler hentes med DIY-enhet, og dermed ikke delvis defreezing. Metode B besto av lagring av RNA i Dewar utsatt for gjentatt delvis defreezing av kortsiktige hentes fra Dewar, dermed modellere langtidslagring med periodisk dekantering for å hente falne prøver. Total RNA integritet ble deretter analysert ved gel elektroforese. Lane1: Eksempel før lagring i Dewar; Lane 2: Eksempel fra Dewar utsatt for gjenfinning av Metode A, 3 Lane, 4: Eksempel fra Dewar utsatt for gjenfinning av metode B, M: 100 bp stige.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

En av de vanligste metodene for å hente cryoboxes og cryovials fra bunnen av Dewar tanken er å decant flytende nitrogen i en ekstra container og trekke ut prøvene som er igjen i flasken eller flytende i dekantert flytende nitrogen. Dette er imidlertid en utrygg praksis som kan forårsake kryogeniske forbrenninger eller kvelning på grunn av langvarig eksponering for flytende nitrogen damper to. Annen vanlig måte å hente falne cryovials innebærer bruk av cryovial tang 3. Imidlertid begrenser begrenset sikt innenfor den mørke plassen av tanken fylt med flytende nitrogen sin manøvrerbarhet.

Den Cryotolerant DIY gjenfinning enheten som er beskrevet ovenfor gir en billigere, sikrere og enklere alternativ for å hente falne cryoboxes og cryovials fra bunnen av dype flasker med begrenset sikt. Den enkle å håndtere DIY henting enheten omgår behovet for å tømme flaskene før henting. Videre retrieval av cryovial med hjelp av sa enheten kan utføres av en enkeltperson. I tillegg forkorter bruk av DIY henting enheten betydelig mengde tid andre prøver lagret i samme enhet tilbringe henhold omgivelsestemperaturer, og dermed bedre eksempler lagringsforhold 6,7.

Mange brukte materialer som plast, karbon stål og gummi blir sprø i flytende nitrogen, og ofte sprekke under stress 8,9,10. Den rustfrie eller galvaniserte komponenter som brukes i DIY enheten er resistente mot skade fra sub-minusgrader i kryogene væsker. Videre disse komponentene er lett tilgjengelig i lokale jernvareforretninger og lave kostnader med bygging av DIY-enhet som beløper seg til mindre enn $ 50,00. Den lange håndtak hindrer føreren fra direkte kontakt med kryogen væske og den perforerte basen og sil tillate umiddelbar tapping av flytende nitrogen under prøven utvinning. Den raske retrieval lar minimum eksponering for flytende nitrogen damper gjør prøven henting en tryggere prosess. På grunn av sin modulære design, har DIY henting enheten fleksibilitet til å brukes til enten esker eller ampuller. Videre tillater enkle designen enheten som skal tilpasses for Dewars av varierende former og størrelser og muligens til å jobbe med andre typer kryogene væsker. Bruken av denne enheten kan imidlertid være begrenset i tilfelle av kryogeniske tanker som ikke har en flat bunn.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklært.

Acknowledgments

DIY kryogenisk gjenfinning enheten hadde blitt testet i løpet av de prosjektene "Modeling bakterieprotein prenylation i eukaryote celler ved hjelp av bioinformatikk og molekylær tilnærminger" sponset av Mary Louise Andrews Award for Cancer Research Program, Virginia Academy of Science, "Physiological Meaning of RNA Redigering i Plasma Dendrittiske celler "sponset av Thomas F. Jeffress og Kate Miller Jeffress Memorial Trust og State Kontrakt 16.740.11.0364 (Departementet for vitenskap og utdanning, Russland). Vi ønsker å takke Beth Eom for hjelp med RNA integritet eksperimentet.

References

  1. Kittel, P. Advances in Cryogenic Engineering. Springer. 41 (1996).
  2. Edeskuty, F. J., Walter, F. Stewart Safety in the handling of cryogenic fluids. Plenum Press. New York. (1996).
  3. Council, N. R. Prudent Practices in the Laboratory: Handling and Management of Chemical Hazards. National Academies Press. (2011).
  4. Muyal, J., Muyal, V., Kaistha, B., Seifart, C., Fehrenbach, H. Systematic comparison of RNA extraction techniques from frozen and fresh lung tissues: checkpoint towards gene expression studies. Diagnostic Pathology. 4, 9 (2009).
  5. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).
  6. Holland, N. T., Smith, M. T., Eskenazi, B., Bastaki, M. Biological sample collection and processing for molecular epidemiological studies. Mutation Research/Reviews in Mutation Research. 543, 217-234 (2003).
  7. Lynch, P. T. CELL, TISSUE AND ORGAN CULTURE | Storage and Cryopreservation. Encyclopedia of Rose Science. 106-111 (2003).
  8. Crawford, R. J. Plastics Engineering. Elsevier Butterworth-Heinemann. (1998).
  9. Gorenc, B., Tinyou, R., Syam, A. Steel designers' handbook. University of New South Wales Press. (1996).
  10. Harper, C. A., Petrie, E. M. Plastics materials and processes: a concise encyclopedia. Wiley-Interscience. (2003).
Gjør-det-selv Enhet for gjenoppretting av Cryopreserved Prøver uhell falt inn Kryogeniske lagertanker
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Mehta, R., Baranova, A., Birerdinc, A. Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks . J. Vis. Exp. (63), e3903, doi:10.3791/3903 (2012).More

Mehta, R., Baranova, A., Birerdinc, A. Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks . J. Vis. Exp. (63), e3903, doi:10.3791/3903 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter