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Biology

Do-It-Yourself Dispositivo de Recuperação de amostras criopreservadas cair acidentalmente em Tanques de armazenamento criogênico

doi: 10.3791/3903 Published: May 11, 2012

Summary

Aqui nós apresentamos um baixo custo, durável cryotolerant dispositivo para a recuperação de amostra de Dewar tanques cheios de nitrogênio líquido. A facilidade de construção e design modular do dispositivo faz com que o processo de recuperação da amostra de tanques criogênicos seguro e fácil.

Abstract

O nitrogênio líquido é incolor, inodoro, extremamente frio (-196 ° C) líquido mantido sob pressão. É comummente usado como um fluido criogénico para armazenamento a longo prazo de materiais biológicos tais como sangue, células e tecidos 1,2. A natureza criogénico de azoto líquido, enquanto ideal para a preservação da amostra, pode causar congelação rápida dos tecidos vivos em contacto - conhecido como 'criogénico queimadura' 2, o que pode levar a queimaduras graves em pessoas intimamente envolvidas no armazenamento e recuperação de amostras de Dewars. Além disso, como o azoto líquido evapora que reduz a concentração de oxigénio no ar e pode causar asfixia, especialmente em espaços confinados 2.

Nos laboratórios, amostras biológicas são frequentemente armazenados em criotubos ou cryoboxes empilhados em prateleiras de aço inoxidável dentro dos tanques de Dewar 1. Estes suportes de armazenamento são fornecidos com um eixo de tempo para impedir caixas de deslizar para fora dos suportes e na parte inferior doDewars durante o manuseio de rotina. Com demasiada frequência, no entanto, caixas ou frascos com amostras preciosas escorregar e afundar até o fundo do tanque de nitrogênio líquido preenchido. Em tais casos, as amostras podem ser tediosamente recuperada após a transferência do azoto líquido para um recipiente de reserva ou descartá-lo. As caixas e frascos pode então ser recuperado a partir com relativa segurança Dewar esvaziado. No entanto, a natureza criogénico de azoto líquido e da sua taxa de expansão torna perigoso recuperação afundado amostra. É geralmente recomendado pelo Escritórios de segurança que a recuperação da amostra nunca ser realizada por uma única pessoa. Outra alternativa é usar comercialmente disponíveis grabbers frescos ou pinças para retirar os 3 frascos. No entanto, a visibilidade limitada dentro dos escuros cheios de líquidos Dewars representa uma grande limitação na sua utilização.

Neste artigo, descrevemos a construção de um dispositivo Cryotolerant recuperação DIY, que faz recuperação de amostra de Dewar contendo fluidos criogênicos tanto a segurança de umnd fáceis.

Protocol

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1. Montagem do dispositivo Cryotolerant para Recuperação de Cryoboxes

  1. Usando um alicate, endireitar um lado da face 3 Nota uma forte L-tie (Figura 1A) para fazer forte-tie em forma mostrada na Figura 1B:. As dimensões do tie-forte pode ser seleccionada dependendo do diâmetro do gargalo do Dewar .
  2. Garantir dois tão fortes de laços com uma cinta de T-tie forte (Figura 2) usando Crown porca e parafuso, anilha e parafuso para formar a base Cryoscoop como mostrado na Figura 3 (AB). Nota: Dois fortes são usadas para permitir a recuperação de 5 ½ x 5 ½ pol cryoboxes.
  3. Utilizando uma placa ranhurada (Figura 4), ​​alinhar as ranhuras na cinta forte-tie T com as ranhuras em uma extremidade da placa ranhurada e fixar os dois em conjunto com a ajuda de Hillman porca e parafusos (Figura 5). Nota: Se o placa entalhada e forte laço de não come com furos pré-perfurados, você terá que ter furos perfurados utilizando carboneto de broca.
  4. Dobrar a outra extremidade da placa ranhurada com a ajuda de um alicate, como mostrado na Figura 6. (Este passo é opcional).
  5. Enrole a alça com espuma para compreender melhor o dispositivo quando em azoto líquido, como mostrado na Figura 6. (Opcional) Nota: Remova a espuma antes da autoclavagem.

2. Montagem do dispositivo Cryotolerant para Recuperação de criotubos

O dispositivo de recuperação Cryotolerant DIY pode também ser adaptado para a recuperação de criotubos. Isto envolve a substituição da base plana, com um filtro de aço inoxidável como mostrado alterados para escavar para fora a partir de frascos de azoto líquido (Figura 7).

  1. Soltar a porca da Coroa e os parafusos que prendem a forte-tie alça T para a placa entalhada.
  2. Antes de fixar o filtro de aço inoxidável à placa ranhurada, dobre o pescoço doo filtro com a ajuda de um alicate para orientar a base com um ângulo para se assemelhar a uma concha (Figura 8) Nota: Se o filtro é fornecido com um lábio, usar um alicate para dobrar o lábio para baixo, o que irá fazer com a manobra mais fácil do dispositivo..
  3. Alinhe o orifício na alça do filtro junto com os furos na placa entalhada e proteger o filtro com a ajuda de porcas e parafusos Hillman como mostrado na Figura 8. Nota: se o filtro não vem com furos pré-perfurados, você vai precisar de arranjar para ter furos perfurados com broca de carboneto.

3. Recuperando Cryoboxes e criotubos De Dewar

  1. Para começar, coloque luvas criogênicas e remover 1 ou 2 prateleiras de resfriamento do Dewar para permitir espaço para manobras.
  2. Raspar suavemente ao longo da parte inferior do Dewar com o dispositivo de recuperação Cryotolerant DIY vertical equipado com forte-tie base de cinta T (Figura 5), e recolher o falle caixan para o fundo do tanque Nota Dewar:. ferve de azoto líquido imediatamente em contacto com um objeto mais quente, que envolve o objecto no gás isolante azoto (efeito Leidenfrost). Para arrefecer o dispositivo antes da recuperação de amostras, lentamente imergir o dispositivo no Dewar e permitir azoto líquido para arrefecer o dispositivo suficientemente antes de prosseguir com o passo acima.
  3. Puxar o dispositivo na posição vertical ao longo das paredes do Dewar para colher a caixa congelador para fora do tanque.
  4. Agarrar a caixa recuperados a partir do fundo do Dewar.
  5. Para recuperar criotubos, raspar suavemente a parte inferior da Dewar com o cryoscoop equipado com um filtro (Figura 9).
  6. Semelhante ao cryobox recuperação, puxe o dispositivo na posição vertical e pegue os frascos coletados no coador.

4. Os resultados representativos

Um grande desafio em estudos de expressão de genes é que a qualidade do RNA depende das condições de armazenamentopara ambas as amostras de tecido congelado e Figura extraída RNA 4. 10 mostra o efeito da manipulação da amostra sobre a integridade do RNA total. O RNA total a partir da fonte de tecido mesmo (adiposo humano) foi submetido a manipulação da amostra diferente. Antes da experiência, intacta RNA total preparate mostra claras bandas 28S e 18S rRNA com a banda rRNA 28S aproximadamente duas vezes tão intensa como a banda de rRNA 18S (Figura 10, pista 1). Esta proporção de 2:1 (28S: 18S) é uma indicação de que o RNA está intacta, enquanto que o RNA parcialmente degradadas aparece como uma mancha, ou a sua 28S: 18S relação da intensidade de partida de 2:01 5. As pistas 3-4 descreve amostras de RNA com uma degradação significativa. Estas amostras de RNA foram sujeitas a repetidos descongelamento parcial, por curto prazo consultas das Dewar (Método A), assim modelando o armazenamento a longo prazo com periódica decantação, devido à necessidade de a recuperação do frascos caído e caixas (Figura 10, Lane 3-4 ). No entanto, as amostras armazenadas em Dewar atendidousando DIY dispositivo (Método B) e, portanto, não descongelamento parcial, contêm RNA intactas (Figura 10, pista 2).

A Figura 1
Figura 1. A) A base é constituído por duas faces 3 forte-tie de dimensões indicadas. Cada ligação forte contém um furo pré-perfurado grande (seta sólida) e múltiplos orifícios mais pequenos (seta pequena) em cada face. Isso fornece uma opção para permitir a fixação com porca e parafusos. Além disso, os orifícios mais pequenos permitir a drenagem rápida de azoto líquido durante a recuperação de amostra. B) Um lado de cada um dos laço forte-é endireitado com a ajuda de um alicate para fazer em forma de L-tie forte.

A Figura 2
Figura 2. Forte-tie alça T é usado para proteger os fortes laços de conjunto. Como forte-tie, T-cinta tem um furo pré-grandes (seta contínua) e dois furos menores (small seta) em cada canto. Isto permite garantir forte-dades ao longo do comprimento do T - Strap usando porcas e parafusos. Também permite a fixação T-cinta para a placa ranhurada.

A Figura 3
Figura 3. A) Cada laço forte-é presa a um canto de T-cinta, ao longo do seu comprimento com porcas de parafuso de coroa, parafusos e anilhas. B) Dois forte-dades são protegidos adjacentes uns aos outros para ajudar a recuperar 5 ½ polegadas x 5 ½ dentro cryoboxes. Para cryoboxes menores, como 2 polegadas x 2 polegadas, um único forte-tie pode ser fixado diretamente à placa entalhada sem cinta-T.

A Figura 4
Figura 4. Ranhurada placa plana é utilizada como a alça. Comprimento da placa ranhurada depende da profundidade do Dewar. Neste caso, 4 pés de placa ranhurada foi usado. A espessura da placa ranhurada é s críticoesde finas placas de fenda (<14 medidores) fazer o dispositivo frágil ao recuperar amostras de nitrogênio líquido cheio Dewar.

A Figura 5
Figura 5. A base plana constituída por fortes-dades e cinta T é então fixada a uma extremidade da placa ranhurada. O orifício maior no canto restante da correia T está alinhada com a ranhura na placa plana e fixado utilizando o parafuso e porca sextavada. Este dispositivo pode ser agora usado para recuperar cryoboxes de Dewar.

A Figura 6
Figura 6. Uma extremidade da placa ranhurada plana é dobrada com um alicate e coberto com espuma para proporcionar uma melhor aderência especialmente para Dewars profundas, como mostrado no presente caso.

A Figura 7
Figura 7. Filtro com malha de arame e cabo de aço inoxidávelé usado para recuperar criotubos de Dewar. Se o identificador não está provida de uma ranhura, perfurar com bit carboneto será necessário para a perfuração de um orifício.

A Figura 8
Figura 8. Para facilitar a recuperação de criotubos, filtro é dobrado ao longo do pescoço usando alicates para obter filtro de concha em forma. Se o filtro está provido de lábio como no presente caso, alicates pode ser usado para dobrar. Isso garante o filtro não fica presa dentro do Dewar.

A Figura 9
A Figura 9. Filtro é fixada à placa ranhurada plana numa extremidade usando porca sextavada e parafuso.

A Figura 10
Figura 10. Integridade da amostra de RNA total submetido a diferentes condições de manejo da amostra. Para explorar como a qualidade do RNA é afetado pela manipulação da amostra cONDIÇÕES, um conjunto de amostras de ARN a partir da mesma fonte foi submetido a dois métodos de tratamentos. Método A consistiu de armazenamento de RNA em Dewar submetido a recuperações de exemplo usando dispositivo DIY, portanto, não descongelamento parcial. Método B consistiu de armazenamento de RNA em Dewar submetido a repetidas descongelamento parcial, por curto prazo consultas das Dewar, assim modelando o armazenamento a longo prazo com periódica decantação para recuperar amostras caídas. Integridade de RNA total foi então analisada por electroforese em gel. Lane1: Amostra antes do armazenamento em Dewar; Pista 2: Amostra de Dewar submetido a recuperação pelo método A; Pista 3, 4: Exemplo de Dewar submetido a recuperação pelo método B, M: 100 pb ladder.

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Discussion

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Um dos métodos mais comuns de recuperar cryoboxes e criotubos a partir do fundo do tanque Dewar é decantar azoto líquido para um recipiente de reserva e puxar para fora as amostras restantes no balão ou flutuando na azoto líquido decantado. Isto é, no entanto, uma prática insegura que pode provocar queimaduras criogénicos ou asfixia devido a exposição prolongada a vapores de azoto líquido 2. Outra forma comum de recuperação de criotubos caídos envolve o uso de pinças criotubo 3. No entanto, a visibilidade limitada dentro do espaço escuro do tanque cheio com azoto líquido restringe a sua capacidade de manobra.

O dispositivo de recuperação Cryotolerant DIY descrito acima fornece uma alternativa mais barata, mais seguro e fácil para a recuperação de cryoboxes caídas e criotubos a partir do fundo dos frascos profundas com visibilidade limitada. A facilidade de manusear o dispositivo de recuperação DIY contorna a necessidade de esvaziar os frascos antes da recuperação. Além disso, a retrieval de criotubo com a ajuda do referido dispositivo pode ser efectuada por um único indivíduo. Além disso, a utilização do dispositivo de recuperação de DIY substancialmente encurta o período de tempo de outras amostras armazenadas na mesma unidade passar sob temperaturas ambientes, melhorando assim as condições de armazenamento da amostra 6,7.

Muitos materiais comumente utilizados, tais como plástico, aço carbono e borracha tornam-se frágeis em nitrogênio líquido, e muitas vezes fraturar sob estresse 8,9,10. Os componentes de aço inoxidável ou galvanizado utilizados no dispositivo de DIY são resistentes a danificar a partir de sub-congelação a temperaturas de fluidos criogénicos. Além disso, esses componentes estão facilmente disponíveis em lojas de ferragens locais e de baixo custo com a construção de DIY dispositivo no valor de menos de US $ 50,00. O longa alça ajuda a prevenir operador do contato direto com os fluidos criogênicos e base perfurada e filtro de permitir instante drenagem de nitrogênio líquido durante a recuperação da amostra. A r rápidaetrieval permite mínimo de exposição aos vapores de nitrogênio líquido que fazem recuperação de uma amostra processo mais seguro. Devido à sua concepção modular, o dispositivo de recuperação de DIY tem a flexibilidade para ser usada tanto para caixas ou frascos. Além disso, a simplicidade do desenho permite que o dispositivo seja adaptado para Dewars de diferentes formas e tamanhos e, possivelmente, a trabalhar com outros tipos de fluidos criogénicos. A utilização deste dispositivo pode, contudo, limitada, no caso de reservatórios criogénicos que não têm uma base plana.

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Disclosures

Não há conflitos de interesse declarados.

Acknowledgments

DIY criogênico dispositivo de recuperação tinha sido testado no decorrer dos projetos "Modelagem prenilação proteína bacteriana em células eucarióticas utilizando abordagens moleculares e de bioinformática", patrocinado pelo Prêmio Mary Louise Andrews para o programa de Pesquisa do Câncer, Virginia Academy of Science ", significado fisiológico da edição de RNA no Plasma Células dendríticas ", patrocinado pela F. Thomas Jeffress e Kate Miller Jeffress Memorial Trust e Contrato 16.740.11.0364 Estado (Ministério da Ciência e Educação, Rússia). Gostaríamos de agradecer a Beth Eom para obter ajuda com o experimento integridade do RNA.

References

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Do-It-Yourself Dispositivo de Recuperação de amostras criopreservadas cair acidentalmente em Tanques de armazenamento criogênico
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Mehta, R., Baranova, A., Birerdinc, A. Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks . J. Vis. Exp. (63), e3903, doi:10.3791/3903 (2012).More

Mehta, R., Baranova, A., Birerdinc, A. Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks . J. Vis. Exp. (63), e3903, doi:10.3791/3903 (2012).

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