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Biology

Do-It-Yourself de dispositivos para la recuperación de las muestras criopreservadas de caída accidental en los tanques de almacenamiento criogénicos

doi: 10.3791/3903 Published: May 11, 2012

Summary

Aquí se presenta un bajo coste, duradero dispositivo de cryotolerant para la recuperación de la muestra de los tanques de Dewar lleno de nitrógeno líquido. La facilidad de construcción y el diseño modular del dispositivo hace que el proceso de recuperación de muestras de los tanques criogénicos seguro y fácil.

Abstract

El nitrógeno líquido es incoloro, inodoro, muy frío (-196 ° C) de líquido mantiene bajo presión. Se utiliza comúnmente como un fluido criogénico para el almacenamiento a largo plazo de los materiales biológicos tales como sangre, células y tejidos 1,2. La naturaleza criogénica de nitrógeno líquido, mientras ideal para la preservación de la muestra, puede causar una rápida congelación de los tejidos vivos en contacto - conocido como "quemadura criogénica '2, que puede conducir a la congelación severa en personas estrechamente implicados en el almacenamiento y recuperación de muestras de Dewars. Además, como el nitrógeno líquido se evapora, se reduce la concentración de oxígeno en el aire y pueden causar asfixia, especialmente en espacios confinados 2.

En los laboratorios, las muestras biológicas a menudo se almacenan en crioviales o criocajas apilados en bastidores de acero inoxidable dentro de los tanques de Dewar 1. Estos bastidores de almacenamiento se proporcionan con un eje largo para evitar que las cajas se deslice fuera de los bastidores y en la parte inferior deDewars durante el manejo de rutina. Con demasiada frecuencia, sin embargo, las cajas o frascos con muestras preciosas salirse y se hunden hasta el fondo del tanque de nitrógeno líquido llena. En tales casos, las muestras pueden ser tediosamente recuperado después de transferir el nitrógeno líquido en un recipiente de repuesto o desecharlo. Las cajas y los viales a continuación, puede ser relativamente segura recuperado de vaciado Dewar. Sin embargo, la naturaleza criogénica de nitrógeno líquido y su tasa de expansión hace peligrosos hundida recuperación de la muestra. Se recomienda con frecuencia por las oficinas de seguridad que la recuperación de la muestra no se llevará a cabo por una sola persona. Otra alternativa es el uso de tarjetas de adquisición de frescos disponibles en el mercado o tenazas para sacar los 3 viales. Sin embargo, la visibilidad limitada en la oscuridad Dewars llenos de líquido representa una importante limitación en su uso.

En este artículo se describe la construcción de un dispositivo de recuperación de Cryotolerant bricolaje, lo que hace que la recuperación de la muestra de Dewar que contiene líquidos criogénicos, tanto de caja fuerteª fáciles.

Protocol

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1. Asamblea de dispositivos Cryotolerant para la recuperación de Cajas criogénicas

  1. Usando los alicates, enderezar un lado de 3 caras fuerte de corbata (Figura 1A) para hacer una forma de L-fuerte lazo Nota se muestra en la Figura 1B. Las dimensiones de fuerte lazo se puede seleccionar en función del diámetro del cuello de Dewar .
  2. Asegure dos tan fuertes los lazos con una correa de Strong-Tie T (Figura 2) con la Corona tuerca del perno, arandela y el tornillo para formar la base Cryoscoop como se muestra en la Figura 3 (AB). Nota: Dos fuertes lazos se utilizan para permitir la recuperación de 5 ½ pulgadas x 5 ½ pulgadas criocajas.
  3. Usando una placa ranurada (Figura 4), ​​alinear las ranuras de la correa T-fuerte lazo con las ranuras en un extremo de la placa ranurada y asegurar los dos juntos con ayuda de tuerca Hillman y pernos (Figura 5). Nota: Si el placa de ranurado y fuerte lazo de no cooperarmí con agujeros previamente perforados, se le tiene que tener agujeros perforados con broca de carburo.
  4. Doble el otro extremo de la placa ranurada con la ayuda de pinzas como se muestra en la Figura 6. (Este paso es opcional).
  5. Envolver el mango con espuma para comprender mejor el dispositivo en nitrógeno líquido, como se muestra en la Figura 6. (Opcional) Nota: Quite la espuma antes de la esterilización en autoclave.

2. Asamblea de dispositivos Cryotolerant para la recuperación de crioviales

El dispositivo Cryotolerant bricolaje recuperación también se puede adaptar para la recuperación de crioviales. Esto implica la sustitución de la base plana con un filtro de acero inoxidable como se muestra alterada para sacando viales de nitrógeno líquido (Figura 7).

  1. Desenroscar la corona tuercas y los tornillos que sujetan la correa de Strong-Tie T a la placa ranurada.
  2. Antes de fijar el filtro de acero inoxidable a la placa ranurada, doble suavemente el cuello delel filtro con la ayuda de pinzas para orientar la base en un ángulo para asemejarse a una cuchara (Figura 8) Nota: Si el filtro viene con un labio, utilizar pinzas para doblar el labio hacia abajo, lo que hará que las maniobras con el dispositivo de fácil..
  3. Alinee el agujero en el mango del filtro, junto con los orificios de la placa ranurada y asegurar el colador con la ayuda de las tuercas y los pernos de Hillman, como se muestra en la Figura 8. Nota: Si el filtro no viene con agujeros previamente perforados, tendrá que hacer arreglos para que los agujeros perforados con una broca de metal duro.

3. Recuperación de Cajas criogénicas y crioviales de Dewar

  1. Para empezar, se puso los guantes criogénicos y eliminar 1 o 2 bastidores del congelador de la Dewar para dejar espacio para maniobrar.
  2. Raspe suavemente en la parte inferior de la Dewar con la posición vertical del dispositivo de recuperación de bricolaje Cryotolerant equipado con Strong-Tie base de la tira T (Figura 5) y recoger el cuadro de Fallen hasta el fondo del tanque de Dewar. Nota: hierve de nitrógeno líquido inmediatamente en contacto con un objeto más caliente, envolviendo el objeto en el aislamiento de gas nitrógeno (efecto Leidenfrost). Para enfriar el dispositivo antes de la recuperación de muestras, lentamente sumergir el dispositivo en el Dewar y permitir nitrógeno líquido para enfriar el dispositivo suficientemente antes de proceder con la etapa anterior.
  3. Extraiga el dispositivo en posición vertical a lo largo de las paredes de la Dewar para sacar la caja del congelador fuera del tanque.
  4. Agarra el cuadro extraído de la parte inferior del Dewar.
  5. Para recuperar los crioviales, raspar suavemente el fondo de la Dewar con la cryoscoop equipado con un filtro (Figura 9).
  6. Al igual que en Caja criogénica de recuperación, tire del dispositivo en posición vertical y apoderarse de los viales recogidos en el colador.

4. Los resultados representativos

Un problema importante en los estudios de expresión génica es que la calidad de ARN depende de las condiciones de almacenamientopara ambas muestras de tejido congeladas y la Figura 4 se extrajo el ARN. 10 muestra el efecto del manejo de la muestra en la integridad del ARN total. ARN total de la fuente mismo tejido (adiposo humano) se sometió a la manipulación de la muestra diferente. Antes de experimentar, intacta total de ARN preparate muestra claras 28S y 18S rRNA con las bandas de la banda 28S rRNA aproximadamente dos veces más intensa que la banda 18S rRNA (Figura 10, carril 1). Esta relación de 2:1 (28S: 18S) es una indicación de que el ARN está intacta, mientras que parcialmente degradado ARN aparece como una mancha, o su 28S: relación 18S intensidad se aparta de 02:01 5. Los carriles 3-4 representa muestras de ARN con una degradación significativa. Estas muestras de ARN se sometieron a descongelación repetidos parcial a corto plazo consultas en el Dewar (Método A), por lo tanto el modelado de almacenamiento a largo plazo con periódico decantación debido a la necesidad de la recuperación de los viales de caída y cajas (Figura 10, el carril 3-4 ). Sin embargo, las muestras almacenadas en Dewar serviciousando un dispositivo de bricolaje (Método B) y, por tanto, ninguna descongelación parcial, contienen ARN intacto (Figura 10, calle 2).

Figura 1
Figura 1. A) La base se compone de dos caras 3 Strong-Tie de dimensiones que se muestran. Cada lazo fuerte contiene un gran orificio perforado (flecha sólida) y múltiples orificios más pequeños (flecha pequeña) en cada cara. Esto proporciona una opción para permitir fijar con la tuerca y los tornillos. También los agujeros más pequeños permitir el drenaje rápido de nitrógeno líquido durante la recuperación de la muestra. B) Un lado de cada una de la corbata fuerte se endereza con la ayuda de pinzas para hacer en forma de L-fuerte lazo.

Figura 2
Figura 2. Strong-Tie correa T se utiliza para proteger los fuertes lazos de juntas. Al igual que Strong-Tie, T-correa tiene un gran agujero previamente taladrado (flecha sólida) y dos orificios más pequeños (Small flecha) en cada esquina. Esto permite asegurar fuerte de los lazos a lo largo de la longitud de la T - correa por medio de tuercas y pernos. También permite sujeción de T-correa a la placa ranurada.

Figura 3
Figura 3. A) Cada lazo fuerte-se fija en una esquina de la T-correa, a lo largo de su longitud usando las tuercas de los pernos de la corona, pernos y arandelas. B) Dos fuertes-dades se fijan al lado de la otra para ayudar a recuperar 5 ½ x 5 ½ pulgadas in criocajas. Para los más pequeños criocajas como 2 pulgadas x 2 pulgadas, un solo Strong-Tie se puede fijar directamente a la placa con ranuras en T, sin correa.

Figura 4
Figura 4. Ranurado placa plana se utiliza como el mango. Longitud de la placa ranurada depende de la profundidad del Dewar. En este caso, 4 pies de placa ranurada fue utilizado. El espesor de la placa ranurada es crítico sesde delgadas placas ranuradas (<14 indicadores) que el dispositivo débil, mientras que la recuperación de muestras de nitrógeno líquido, lleno de Dewar.

Figura 5
Figura 5. La base plana que consta de fuertes los lazos y la correa T se asegura entonces en un extremo de la placa ranurada. El agujero más grande en la esquina restante de la correa T está alineada con la ranura en la placa plana y se fija usando un perno y una tuerca hexagonal. Este dispositivo puede ser ahora usado para recuperar criocajas de Dewar.

Figura 6
Figura 6. Un extremo de la placa ranurada plana se dobla con unos alicates y se cubre con espuma para proporcionar un mejor agarre especialmente para Dewars profundas, como se muestra en este caso.

Figura 7
Figura 7. Filtro con una malla metálica y mango de acero inoxidablese utiliza para recuperar crioviales de Dewar. Si el mango no está provisto de una ranura, perfore con poco carburo se requiere para la perforación de un agujero.

Figura 8
Figura 8. Para facilitar la recuperación de los crioviales, el filtro se dobla a lo largo del cuello con unos alicates para obtener filtro en forma de cuchara. Si colador está provista de labios como en este caso, alicates se puede utilizar para doblarla. Esto asegura colador de no quedar atrapados en el Dewar.

Figura 9
Figura 9. El filtro está fijado a la placa ranurada plana en un extremo mediante una tuerca hexagonal y perno.

Figura 10
Figura 10. Integridad de la muestra de ARN total sometidos a diferentes condiciones de manejo de muestra. Para explorar cómo la calidad del ARN de la muestra se ve afectada por el manejo de condiciones, un conjunto de muestras de ARN de la misma fuente se sometió a dos métodos de manejos. Método A constaba de almacenamiento de ARN en Dewar sometido a recuperaciones de ejemplo utilizando el dispositivo de bricolaje, por lo tanto no descongelación parcial. Método B consistió en almacenamiento de ARN en Dewar sometido a descongelación repetidos parcial a corto plazo consultas en el Dewar, por lo tanto el modelado de almacenamiento a largo plazo con periódico decantación para recuperar muestras caídas. Total integridad del ARN se analizó luego por electroforesis en gel. Lane1: Muestra antes de su almacenamiento en el Dewar, Carril 2: Muestra de Dewar objeto de recuperación por el método A, Calle 3, 4: Muestra de Dewar objeto de recuperación por el método B, M: escalera de 100 pb.

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Discussion

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Uno de los métodos más comunes de recuperar criocajas y crioviales desde el fondo del tanque Dewar es decantar nitrógeno líquido en un recipiente de repuesto y extraer las muestras restantes en el matraz o flotando en el nitrógeno líquido se decantó. Esta es, sin embargo, una práctica insegura que puede causar quemaduras criogénicas o asfixia debido a la exposición prolongada a vapores de nitrógeno líquido 2. Otra forma común de recuperación de los crioviales caídos implica el uso de pinzas criovial 3. Sin embargo, la escasa visibilidad en el espacio oscuro del tanque lleno de nitrógeno líquido restringe su capacidad de maniobra.

El dispositivo de bricolaje Cryotolerant de recuperación descrito anteriormente proporciona una alternativa más barata, más segura y más fácil para recuperar criocajas caídos y crioviales desde el fondo de los frascos de profundidad con poca visibilidad. La facilidad de manipulación del dispositivo de recuperación de bricolaje evita la necesidad de vaciar los matraces antes de la recuperación. Además, el RETrieval de criovial con la ayuda de dicho dispositivo puede ser llevado a cabo por una sola persona. Además, el uso del dispositivo de recuperación de bricolaje sustancialmente acorta la cantidad de tiempo otras muestras almacenadas en la misma unidad pasar bajo temperaturas ambiente, mejorando así las condiciones de almacenamiento de muestras 6,7.

Muchos de los materiales de uso común, tales como plástico, acero al carbono y caucho se vuelven frágiles en nitrógeno líquido, y con frecuencia se fractura bajo tensión 8,9,10. Los componentes de acero inoxidable o galvanizado utilizados en el dispositivo de bricolaje son resistentes al daño de temperaturas bajo cero de líquidos criogénicos. Además, estos componentes son fácilmente disponibles en las ferreterías locales y de bajo costo con la construcción del dispositivo de bricolaje que asciende a menos de $ 50.00. El mango largo ayuda a evitar que el operador del contacto directo con los fluidos criogénicos y la base perforada y filtro permitir instante drenaje de nitrógeno líquido durante la recuperación de la muestra. El r rápidaetrieval permite mínima exposición a los vapores de nitrógeno líquido, haciendo muestra de la recuperación de un proceso más seguro. Debido a su diseño modular, el sistema de recuperación de bricolaje tiene la flexibilidad para ser usado tanto para cajas o frascos. Además, la simplicidad del diseño permite que el dispositivo se adapta para Dewars de diferentes formas y tamaños y, posiblemente, para trabajar con otros tipos de líquidos criogénicos. El uso de este dispositivo pueden, sin embargo, estar limitada en el caso de depósitos criogénicos que no tienen un fondo plano.

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Disclosures

No hay conflictos de interés declarado.

Acknowledgments

DIY criogénico dispositivo de recuperación ha sido probado en el curso de los proyectos "prenilación modelado de proteínas bacterianas en las células eucariotas uso de la bioinformática y los enfoques moleculares", patrocinado por Mary Louise Andrews Premio para el programa de Investigación del Cáncer, la Academia de Ciencias de Virginia, "significado fisiológico de la edición del ARN en el plasma Las células dendríticas "patrocinado por la Jeffress Thomas F. Miller y Kate Jeffress Memorial Trust y el Contrato 16.740.11.0364 Estado (Ministerio de Educación y Ciencia, Rusia). Nos gustaría dar las gracias a Bet Eom para obtener ayuda con el experimento de la integridad del RNA.

References

  1. Kittel, P. Advances in Cryogenic Engineering. Springer. 41 (1996).
  2. Edeskuty, F. J., Walter, F. Stewart Safety in the handling of cryogenic fluids. Plenum Press. New York. (1996).
  3. Council, N. R. Prudent Practices in the Laboratory: Handling and Management of Chemical Hazards. National Academies Press. (2011).
  4. Muyal, J., Muyal, V., Kaistha, B., Seifart, C., Fehrenbach, H. Systematic comparison of RNA extraction techniques from frozen and fresh lung tissues: checkpoint towards gene expression studies. Diagnostic Pathology. 4, 9 (2009).
  5. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).
  6. Holland, N. T., Smith, M. T., Eskenazi, B., Bastaki, M. Biological sample collection and processing for molecular epidemiological studies. Mutation Research/Reviews in Mutation Research. 543, 217-234 (2003).
  7. Lynch, P. T. CELL, TISSUE AND ORGAN CULTURE | Storage and Cryopreservation. Encyclopedia of Rose Science. 106-111 (2003).
  8. Crawford, R. J. Plastics Engineering. Elsevier Butterworth-Heinemann. (1998).
  9. Gorenc, B., Tinyou, R., Syam, A. Steel designers' handbook. University of New South Wales Press. (1996).
  10. Harper, C. A., Petrie, E. M. Plastics materials and processes: a concise encyclopedia. Wiley-Interscience. (2003).
Do-It-Yourself de dispositivos para la recuperación de las muestras criopreservadas de caída accidental en los tanques de almacenamiento criogénicos
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Mehta, R., Baranova, A., Birerdinc, A. Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks . J. Vis. Exp. (63), e3903, doi:10.3791/3903 (2012).More

Mehta, R., Baranova, A., Birerdinc, A. Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks . J. Vis. Exp. (63), e3903, doi:10.3791/3903 (2012).

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