Выделение и первичной культуре клеток крысы Печеночная

Summary

Первичные гепатоциты стать ценным инструментом для оценки биохимических, молекулярных и метаболических функций в физиологически соответствующие экспериментальные системы. Мы описываем надежный протокол для крыс на месте перфузии печени, которая постоянно создает жизнеспособную гепатоцитов до to1.0 × 10

Abstract

Первичная культура гепатоцитов является ценным инструментом, который широко используется в области фундаментальных исследований функции печени, болезни, патофизиологии, фармакологии и других смежных областях. Метод, основанный на двухступенчатую коллагеназы перфузии выделения интактных гепатоцитов был впервые введен Берри и другу в 1969 году ^1, и с тех пор претерпел множество изменений. Наиболее часто используемый метод был описан Seglenin 1976 ^2. По существу, являются гепатоциты отделена от наркоза крысы взрослого без рециркуляции коллагеназы перфузии через систему воротной вены. Изолированных клеток, затем фильтруют через поры 100 мкм сетчатый фильтр нейлон размер, и культивировали на пластинах. После 4-часовой культуры, среда заменена сыворотки, содержащие или бессывороточной среде, например, HepatoZYME-SFM, дополнительное время для культуры. Эти процедуры требуют хирургического и стерильной культуры шагов, которые могут быть лучше продемонстрировали видео, чем текст. Hпрежде чем мы документально подробные инструкции для этих процедур, как видео, так и письменных протоколов, которые позволяют последовательно в поколение жизнеспособных гепатоцитов в больших количествах.

Protocol

1. Подготовка

Все буферы свежеприготовленный с использованием стерильной техники и фильтр стерилизовать помощью Corning 0,22 мкм фильтр.

1. Подготовить перфузии буфер я, добавив следующие строки в сбалансированном солевом растворе Хенкса (HBSS без Са ^{2 +} и Mg ^{2 +,} см. таблицу 1): Mg ^{2 +} (MgCl ₂₎ до 0,9 мм, ЭДТА до 0,5 мм, а HEPES до 25 мМ.
2. Подготовить перфузии буфер II, добавив следующее HBSS (с Са ^{2 +} и Mg ^{2 +,} см. таблицу 1): HEPES до 25 мм.
3. Подготовить перфузии буфер II плюс collagenaseII: Растворите коллагеназы II (1000 ЕД) с 300 мл перфузии буфер II и поддерживать решение теплой водяной бане до перфузии. Этот раствор следует использовать в течение 30 минут, потому что активность коллагеназы II уменьшилось со временем.
4. Подготовка полного среднего Уильяма: Добавьте следующиек средней E Уильямс: L-глютамин до 2 мм, эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) до 5%, инсулин до 100 нм, дексаметазон до 100 нм, пенициллин по 100 МЕ / мл стрептомицина и до 100 мг / мл.
5. Эти буферы должны быть прогреты в течение 30 минут на водяной бане при 42 ° C, оптимальная температура, соответствующая температура на выходе канюля 37 ° C.

2. Крысы перфузии печени изоляции

1. Перфузии Система состоит из насоса, автоклавируемый силиконовые трубки и на водяной бане (см. Рисунок 1). Предварительно установите расход перистальтического насоса перфузии до 10 мл / мин.
2. Обезболить взрослой крысы (300 г массы тела) с внутрибрюшинно (IP), кетамин (87 мг / кг массы тела), а также ксилазина (13 мг / кг). Глубина анестезии должны быть проверены на ноги шнура. Когда крыса больше не реагирует на болевые раздражители, бритье волос и брюшной подготовительные живот бетадин и этанола. Введите через срединный разрез.
3. Подвергатьпеченочной воротной вены тщательно перемещение внутренних органов вправо за пределы брюшной полости, и вставить 18 калибра angiocath в печеночной воротной вены (см. Рисунок 1).
4. Подключите перфузат трубки с иглой и начать вливания в местах с низкой скоростью потока (10 мл / мин) с предварительно нагретым (37 ° C) перфузии буфера я.
5. Если выполняется должным образом, печень должна немедленно начинают выгораживать. После успешной катетеризации подтвердится, сделать разрез в нижней полой вены (НПВ), чтобы отток (рис. 1). Еще один тест для успешной катетеризации может осуществляться путем применения давления света стерильным тампоном на IVC, все доли печени следует быстро начинают набухать.
6. Увеличение скорости потока 25 мл / мин. Печень должна стать бледным цветом.
7. Включите перфузии решение перфузии буфер II плюс коллагеназы II без прерывания потока на 6 дополнительных минут.
<LI> Периодически (5-10 раз в процессе пищеварения) давление с тампоном IVC для 5-секундным интервалом. Печень увеличится, что приведет к повышению печеночных клеток диссоциации, в свою очередь, уменьшает общее время пищеварения, а также увеличение конечного выхода.
8. После того, как коллагеназа перфузии печени следует начинать искать мягкий. Проанализируйте печени бесплатно, место в предварительно охлажденный стерильный стакан с 20 мл полной среды Уильям, а затем принять его на ткань капот культуре клеток.

3. Гепатоцитов изоляторе

1. В капоте культуре клеток, с помощью мобильного скребок, чтобы мягко рассеивают клеток в полной средней Уильяма в стерильные чашки Петри.
2. Фильтр клетки дисперсии через поры 100 мкм сито размером ячейки в 50 мл коническую трубку для удаления соединительных тканей и непереваренных фрагментов ткани.
3. Приостановить клеток в 40 мл полной среды Уильям и центрифуги в 50 мкг в течение 3 мин при 4 ° C.
4. Аспирируйте супернатант, имягко повторно приостанавливать клетки в полной среде 40 мл холодной Уильяма мыть клетки. Повторите центрифугирования.
5. Аспирируйте супернатант и осторожно повторно приостанавливать клеток с 25 полных средних мл Уильяма. Добавить 25 мл 90% раствора в Перколла PBS в трубу и аккуратно перемешать.
6. Центрифуга 200 мкг в течение 10 мин при 4 ° C. Аспирируйте мертвые клетки сверху градиент, так как жизнеспособные клетки остаются в нижней части градиента Перколла.
7. Приостановить осадок клеток в 30 мл теплой полной средней Уильяма, а затем повторите центрифугирование и повторно приостанавливать осадок клеток в 20 мл теплой полной средней Уильяма.
8. Подсчитайте клеток в суспензии клеток помощью гемоцитометра и определения жизнеспособности клеток окрашиванием трипанового синего.

4. Гепатоцитов культуры

1. Развести клетки с полной средней теплый Уильяма предпочтительные концентрации, например, 2,5 х 10 ⁵ клеток / мл. Пластина клеток в нужном объеме на пластинах культуре клеток, например,. 5 х 10 ⁵ клеток / 2 мл / а, 6 скважин / плита, или 2,5 х 10 ⁵ клеток / 1,5 мл / и 12 скважин / пластины. Un покрытие пластин подходит для культур печеночных клеток.
2. В типичной подготовительные с> 85% жизнеспособных клеток, плотность клеток должна составить около 60-70% слияния, что позволяет межклеточных контактов, сохраняя при этом достаточно места для гепатоцитов вырастет до их полного размера ячейки и дают окончательное слияние 90-95%.
3. В целях формирования монослоя даже гепатоцитов, другими словами, чтобы свести к минимуму тенденцию клетки собираться в центральной части и (скорее всего, за счет потока воздуха внутри клетки инкубатор), позволяют пластины остаются внутри капот культуре клеток в течение 30 минут прежде, чем поместить их в инкубатор.
4. Культура клеток при 37 ° C во влажной атмосфере 95% воздуха и 5% CO _2. После 4-х культуры, клетки могут либо оставаться в той же сыворотки среде, содержащей или заменить среде с сывороткой-еРЗЭ среды, например HepatoZYME-SFM (см. Таблицу 1). Бессывороточной среде способствует поддержанию морфологии клеток, без побочных эффектов от гормонов, когда бессывороточной среде используется.
5. Позвольте клеток для восстановления и роста по крайней мере, ночью до экспериментов. Мы рекомендуем использовать клетки для тестирования в течение 24 часов, потому что это может помочь сохранить функцию критической ферментов (например, Р450).
6. Замените рост средней на 2-дневными интервалами, если это необходимо.

5. Представитель Результаты

Условиях, описанных регулярно генерировать клетки урожаи 1,0 х 10 ⁸ клеток на подготовку одного печени крыс. Жизнеспособность гепатоцитов измеряется путем исключения трипановым синим был постоянно в пределах 88 ~ 96%.

Как показано на рисунке 2, гепатоциты совокупности и образуют кластер, после 4 часов посева. Большинство изолированных клеток выравнивать и распространять в типичных рост монослоя. К 24 ч, по краям клетки определяется, поверхности клеток довольно гладко, и липидные капли видны. В камерах 2:59 ядрышки, которые имеют круглую форму, расположен в центре клетки и ядра дисплея соответствует размеру среди клеток (рис. 2).

Рисунок 1. Схема печени перфузии. 18 калибра angiocath вставляется в портальную вену печени, то перфузат трубка подключена к игле. После успешной катетеризации подтвердится, сделать разрез в нижней полой вены (НПВ), чтобы истечение.

Рисунок 2. Морфология культуре гепатоцитов с течением времени (4 ч до 24 ч), увеличение х 200. После культивировали в течение 24 часов, клетки распространяются в типичных рост монослоя, а переходы между клетками являются линейными.

Название реагента	Компания	Номер в каталоге
HBSS (без Са 2 + и Mg 2 +)	Invitrogen	14174
HBSS (с Са 2 + и Mg 2 +)	Invitrogen	14025
Средний Уильямс E	Invitrogen	12551-032
Collegenase II	Уортингтон	LS004176
Сотовые фильтр (100 мкм)	BD	352360
HepatoZYME-SFM	Invitrogen	17705
Перколла	Сигма	P4937
Angiocath (18 калибра)	BD	381705

Таблица 1.

Discussion

Первичная культура гепатоцитов в пробирке модель широко используется для изучения различных аспектов печени физиологии и патологии. Например, основной культуры используется для оценки выражения и функции наркотиков метаболизм ферментов, в том числе цитохрома Р450, метаболизм лекарственных препаратов, лекарственных взаимодействий и механизмов цитотоксичности и генотоксичности ^3-7. Протокол описания изоляции и культуре клеток крыс печеночный заимствован из предыдущих докладов Aiken соавт. ^8, и другие ^2,9,10 с изменениями. Условиях, описанных постоянно генерировать жизнеспособные гепатоциты до 1,0 х 10 ⁸ клеток на препарат с жизнеспособность клеток от 88 ~ 96%. Ниже приводятся другие важные шаги:

1. Как и любой протокол описания клеточной культуры, наиболее важным аспектом является то, чтобы избежать загрязнения от бактериальных и грибковых патогенов с помощью строгой асептики ^11.
2. Десмосом, также известный как пятно adherens, является клеточная структура специализируется на клетки к клеточной адгезии. Целостность десмосом требуется кальций, и в разбивке по ЭДТА и кальция свободных средств массовой информации. Ферменты коллагеназы могут диссоциировать десмосом, что привело к изоляции клеток печени. Таким образом, перфузии используется Ca ^{2 +} свободная среда, а затем Са ^{2 +} богатой средой, содержащей Са ^{2 +} зависимый коллагеназа, для пищеварения.
3. Соответствующее обращение коллагеназы имеет решающее значение для подготовки гепатоцитов. Расход Perfussion буфер II плюс collegenase II следует хранить при 25 мл / мин. Общие причины неудачного культуре гепатоцитов относятся: 1) плохой клеточная диссоциация, которая может быть связано с недостаточной перфузии буферов нагревают до 37 ° C и / или медленной скорости перфузии и 2) гибель клеток, которые Коулаг быть связано с чрезмерной пищеварения коллагеназы.
4. Будьте осторожны при изменении СМИ после первых 4-х культуры, как гепатоциты все еще относительно хрупкие и могут быть легко повреждены или разрушены в результате прямого контакта, пипетки только вниз сторона так и не непосредственно на клетки.