Summary
Hepatocytes ראשיים מספקים כלי רב ערך כדי להעריך ביוכימיים, פונקציות מולקולרית, ואת חילוף החומרים במערכת ניסיונית רלוונטי מבחינה פיזיולוגית. אנו מתארים פרוטוקול אמין עכברוש זלוף הכבד באתרו, אשר באופן עקבי יוצר hepatocytes קיימא עד to1.0 × 10
Abstract
תרבות hepatocyte העיקרית היא כלי רב ערך, שבו נעשה שימוש נרחב במחקר בסיסי של תפקודי כבד, מחלת פתופיזיולוגיה, פרמקולוגיה ונושאים קשורים אחרים. השיטה מבוססת על טפטוף שני שלבים collagenase עבור בידוד של hepatocytes שלמים הוצג לראשונה בשנת 1969 על ידי ברי 1 חברים ', ומאז עבר שינויים רבים. הטכניקה הנפוצה ביותר תוארה על ידי Seglenin 1976 2. בעיקרו של דבר, hepatocytes הם ניתק מן חולדות בוגרות הרדים ידי טפטוף בלתי הסירקולציה המחודשת collagenase דרך וריד השער. בתאים מבודדים מסוננים מכן דרך המסנן 100 מיקרומטר גודל הנקבוביות רשת ניילון, ותרבותיים על גבי צלחות. אחרי התרבות של 4 שעות, בינוני מוחלף בינוני סרום המכיל או בסרום ללא, למשל HepatoZYME-SFM, בפעם נוספת לתרבות. נהלים אלה מחייבים צעדים תרבות כירורגית סטרילית שיכולה לבוא לידי ביטוי טוב יותר מאשר טקסט ווידאו. Hפה, אנחנו מתעדים את השלבים מפורטים נהלים אלה של וידאו וגם פרוטוקול כתוב, אשר באופן עקבי לאפשר את הדור של hepatocytes קיימא במספרים גדולים.
Protocol
1. הכנה
כל מאגרים מוכנים עתה באמצעות טכניקה סטרילית ולסנן עיקור באמצעות מסנן 0.22 קורנינג מיקרומטר.
- הכן זלוף חיץ אני ידי הוספת שלהלן כדי תמיסת מלח מאוזן של האנק (HBSS, ללא Ca 2 + ו - Mg 2 +, ר 'טבלה 1): Mg 2 + (MgCl 2) ל 0.9 מ"מ, EDTA ל 0.5 מ"מ, HEPES עד 25 מ"מ.
- הכינו מאגר זלוף II על ידי הוספת שלהלן כדי HBSS (עם Ca 2 + ו - Mg 2 +, ראה לוח 1): HEPES 25 מ"מ.
- הכינו מאגר זלוף II בתוספת collagenaseII: ממיסים collagenase II (1000 U) עם 300 מ"ל זלוף חיץ השנייה ולשמור פתרון חם באמבט מים לפני זלוף. פתרון זה יש להשתמש תוך 30 דקות, כי הפעילות של collagenase השנייה ירד עם הזמן.
- הכן בינוני מלאה של ויליאם: הוסף הבאהל E בינוני "וויליאמס: L-גלוטמין ל 2 מ"מ, סרום שור עוברית (FBS) 5%; אינסולין ל -100 ננומטר, dexamethasone עד 100 ננומטר, פניצילין עד 100 IU / mL וסטרפטומיצין עד 100 מ"ג / מ"ל.
- מאגרים אלה יש לחמם במשך 30 דקות באמבט מים על 42 מעלות צלזיוס, טמפרטורה אופטימלית המתאים לטמפרטורה מוצא את הצינורית של 37 ° C.
2. עכברוש זלוף לבידוד כבד
- מערכת טפטוף מורכבת משאבה, צינורות silastic autoclavable ואמבט מים (ראה איור 1). מראש להגדיר את קצב הזרימה של המשאבה זלוף peristaltic ל 10 מ"ל / דקה.
- להרדים חולדה בוגרת (300 גרם משקל גוף) עם intraperitoneal (IP) קטמין (87 מ"ג / ק"ג משקל גוף) בתוספת xylazine (13 מ"ג / ק"ג). עומק ההרדמה צריך להיות פיקוח על ידי קורט הבוהן. כאשר חולדה כבר לא מגיב לגירוי מזיק, לגלח שיער בטן הכנה הבטן בבטאדין ואתנול. הזן דרך חתך קו האמצע.
- לחשוףוריד שער הכבד על ידי בקפידה העברת הקרביים החוצה את זכותם של חלל הבטן, והכנס angiocath 18-מד לווריד הכבד הפורטל (ראה איור 1).
- חבר את צינורות perfusate למחט וליזום עירוי באתרו בקצב זרימה נמוכה (10 mL / min) עם מחומם מראש (37 ° C) מאגר זלוף אני.
- אם ביצע כראוי, כבד צריך מיד להתחיל מחוויר. לאחר cannulation מוצלח הוא אישר, לעשות חתך ב נחות הווריד הנבוב (IVC) על מנת לאפשר בזרימת (איור 1). בדיקה נוספת cannulation מוצלח יכול להתבצע על ידי הפעלת לחץ קל עם ספוגית סטרילית IVC: כל אונות הכבד צריך להתחיל להתנפח במהירות.
- להגביר את קצב הזרימה 25 מ"ל / דקה. הכבד צריך להיות בצבע בהיר.
- לעבור את הפתרון למאגר זלוף זלוף II בתוספת collagenase II ללא הפרעה של זרימת למשך 6 דקות נוספות. <li> מעת לעת (פי 5-10 במהלך העיכול) להפעיל לחץ עם ספוגית כדי IVC עבור 5 שניות במרווחים. הכבד יהיה להתנפח, מה שמוביל משופרת בתא הכבד דיסוציאציה, בתורו צמצום זמן עיכול הכולל, והגדלת התשואה הסופית.
- לאחר זלוף collagenase, כבד צריך להתחיל לחפש רגשני. לנתח הכבד חינם, במקום בכוס מראש צונן סטרילית עם המדיום 20 מ"ל מלאה של ויליאם, ולאחר מכן לקחת אותו מכסה המנוע לתא הרקמה התרבות.
3. תא בידוד hepatocyte
- בתוך מכסה המנוע תרבית תאים, השתמש מגרד התא בעדינות כדי לפזר את התאים לתוך בינוני מלאה של ויליאם בתוך צלחת פטרי סטרילית.
- סנן פיזור התא דרך 100 מיקרומטר נקבוביות מסננת בגודל התא לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל כדי להסיר רקמות החיבור ושברי רקמות מעוכלים.
- להשעות את התאים בינוני 40 מ"ל מלאה של ויליאם צנטריפוגות ב XG 50 דקות 3 ב 4 ° C.
- Aspirate supernatant, ובעדינות מחדש להשעות תאים בינונית מלאה 40 מ"ל קר של ויליאם לשטוף את התאים. חזור על צנטריפוגה.
- Aspirate supernatant, בעדינות מחדש תאים עם להשעות בינוני 25 מ"ל מלאה של ויליאם. הוסף 25 מ"ל פתרון Percoll 90% ב PBS לתוך הצינור בעדינות לערבב.
- סרכזת ב XG 200 דקות 10 ב 4 ° C. לשאוב את התאים המתים מן החלק העליון של שיפוע כי התאים קיימא להישאר בחלק התחתון של מדרון Percoll.
- להשעות את התא גלולה ב בינוני 30 מ"ל חמה מלאה של ויליאם, ולאחר מכן חזור צנטריפוגה מחדש להשעות את התא גלולה ב בינוני 20 מ"ל חמה מלאה של ויליאם.
- לספור את התאים בתוך התא באמצעות השעיית hemocytometer ולקבוע כדאיות התא על ידי צביעה בכחול trypan.
4. Hepatocyte תרבות
- לדלל עם תאים בינוני מלאה של ויליאם חם לריכוז מועדפת, כגון: 2.5 x 10 5 תאים למ"ל. צלחת תאים בהיקף הרצוי על צלחות תרבית תאים, למשל. 5 x 10 תאים 5/2 מ"ל / 6, גם בארות / צלחת, או 2.5 x 10 תאים 5 / 1.5 מ"ל / 12, גם בארות / צלחת. בלתי מצופה הצלחת בסדר עבור תרביות תאים בכבד.
- ב הכנה טיפוסי עם תאים קיימא> 85%, צפיפות התאים צריך להגיע כ 60-70% המפגש, המאפשר קשר תאים תאים, תוך שמירה על מרחב מספיק hepatocytes לגדול לגודל התא מלא שלהם להניב המפגש האחרון של 90-95%.
- על מנת ליצור monolayer אפילו hepatocytes, במילים אחרות, כדי למזער את הנטייה של תאים כדי לצבור באזור המרכז הבאר (ככל הנראה עקב זרימת אוויר בתוך תא החממה), לאפשר הצלחות להישאר בפנים תרבית תאים מכסה המנוע במשך 30 דקות לפני הכנסתם חממה.
- התרבות התאים ב 37 ° C באווירה humidified של אוויר 95% ו 5% CO 2. אחרי התרבות 4-H, התאים יכול גם להישאר בינוני סרום המכיל אותו או להחליף בינוני עם סרום-fבינוני רי, למשל HepatoZYME-SFM (ראה לוח 1). בינוני סרום ללא עוזר לשמור על מורפולוגיה תאים ללא תופעות לוואי של ההורמונים, כאשר מדיום סרום ללא משמש.
- אפשר תאים להתאושש ולצמוח לפחות לילה לפני ניסויים. אנו ממליצים להשתמש בתאי עבור הבדיקה בתוך 24 שעות, כי זה עשוי לעזור לשמר את תפקוד האנזימים קריטיים (למשל, P450s).
- החלף בינוני הצמיחה ב 2 מרווחי יום, אם יש צורך.
5. נציג תוצאות
התנאים שתוארו באופן קבוע להפיק יבולים התא של 1.0 x 10 8 תאים בכל הכנה מהכבד 1 חולדה. הכדאיות של hepatocytes נמדד על ידי הרחקה כחול trypan היה באופן עקבי בטווח של 88 ~ 96%.
כמתואר באיור 2, כולל hepatocytes ואשכול בצורה לאחר זריעת 4 שעות. תאים בודדים ביותר לשטח ולהפיץ בצמיחה monolayer טיפוסי . עד שעה 24, את הקצוות של תאים מוגדרות, פני השטח של תאים חלקה למדי, טיפות השומנים גלויים. התאים יש אחד עד שלושה nucleoli, שהם עגולים, הממוקם במרכזה של התאים, וכן תצוגה גרעינים גודל עקבי בין התאים (איור 2).
איור 1. דיאגרמה של זלוף הכבד. Angiocath 18-מד מוכנס לתוך הווריד הפורטל של הכבד, ואז צינורות perfusate מחוברת המחט. לאחר cannulation מוצלח הוא אישר, לעשות חתך ב נחות הווריד הנבוב (IVC) על מנת לאפשר בזרימת.
איור 2. מורפולוגיה של hepatocytes בתרבית לאורך זמן (4 שעות עד 24 שעות), הגדלה x 200. לאחר תרבותי עבור שעה 24, התאים להתפשט הצמיחה monolayer טיפוסי, הצמתים בין התאים ליניארית.
| שם מגיב | חברה | מספר קטלוגי |
| HBSS (ללא Ca 2 +, ו - Mg 2 +) | Invitrogen | 14174 |
| HBSS (עם Ca 2 +, ו - Mg 2 +) | Invitrogen | 14025 |
| E בינוני של וויליאמס | Invitrogen | 12551-032 |
| Collegenase II | וורטינגטון | LS004176 |
| תא מסננת (100 מיקרומטר) | BD | 352360 |
| HepatoZYME-SFM | Invitrogen | 17705 |
| Percoll | סיגמא | P4937 |
| Angiocath (18 מד) | BD | 381705 |
טבלה 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
התרבות העיקרית של hepatocytes הוא במודל חוץ גופית בשימוש נרחב ללמוד היבטים שונים של הכבד הפיזיולוגיה והפתולוגיה. לדוגמה, תרבות העיקרית שנועדה לבחון את הביטוי והתפקוד של סמים בחילוף חומרים אנזימים כולל cytochromes P450, מטבוליזם התרופה, אינטראקציות בין תרופתיות, ואת המנגנונים של cytotoxicity ו genotoxicity 3-7. פרוטוקול המתאר בידוד והתרבות של תאים בכבד חולדה מותאמת הדיווחים הקודמים של אייקן et al. 8, ואחרים 2,9,10 עם שינויים. התנאים שתוארו באופן עקבי לייצר hepatocytes קיימא עד 1.0 x 10 8 תאים בכל הכנה עם כדאיות התא בין 88 ~ 96%. להלן צעדים קריטיים אחרים:
- כמו עם כל פרוטוקול המתאר תרבית תאים, ההיבט הקריטי ביותר הוא למנוע זיהום חיידקי או פטרייתי פתוגנים באמצעות טכניקות אספטיים קפדניים 11.
- Desmosome, הידוע גם בשם adherens המקולה, היא מבנה התא התמחה במשך הידבקות התא אל התא. שלמות desmosome דורש סידן, והוא מתפרק על ידי EDTA וסידן ללא התקשורת. Collagenase אנזימים יכול לנתק desmosome, המוביל את התאים בכבד בידוד. לכן, זלוף משתמש Ca 2 + בינוני חינם ולאחר מכן Ca 2 + בינוני עשירה המכילה Ca 2 + collagenase תלויה, לעיכול.
- הטיפול collagenase המתאים הוא חיוני לגמרי להכנת hepatocyte. קצב זרימת Perfussion המאגר השני בתוספת השנייה collegenase יש לשמור במהירות של 25 מ"ל / דקה. גורמים שכיחים בתרבות hepatocyte מוצלח כוללים: 1) תא עניים דיסוציאציה, אשר יכול להיות בגלל מאגרים זלוף שחיממו כראוי כדי 37 מעלות צלזיוס ו / או מהירות איטית זלוף, ו 2) מוות של תאים, אשר coulד לנבוע העיכול collagenase מוגזמת.
- היה זהיר בעת שינוי בתקשורת אחרי התרבות 4-H 1, כפי hepatocytes הם עדיין שברירי יחסית והוא יכול להיפגע בקלות או שיבשו על ידי מגע ישיר, פיפטה רק את הצד של הבאר, ולא ישירות על גבי התאים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגוד עניינים הצהיר.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות למר ג'וש Basford וד"ר שיאו-min לי בבקשה לסיוע טכני. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מענקים NIH (DK70992 ו DK92779 ל ML).
References
- Berry, M. N., Friend, D. S. High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: a biochemical and fine structural study. J. Cell Biol. 43, 506-520 (1969).
- Seglen, P. O. Preparation of isolated rat liver cells. Methods Cell Biol. 13, 29-83 (1976).
- Saito, K., Kobayashi, K., Mizuno, Y., Fukuchi, Y., Furihata, T., Chiba, K., Schmidt, M., Schmitz, H. J., Baumgart, A., Guedon, D. Peroxisome proliferator-activated receptor alpha (PPARalpha) agonists induce constitutive androstane receptor (CAR) and cytochrome P450 2B in rat primary hepatocytes. Drug Metab. Pharmacokinet. 25, 108-111 (2010).
- Gomez-Lechon, M. J., Donato, M. T., Castell, J. V., Jover, R. Human hepatocytes in primary culture: the choice to investigate drug metabolism in man. Curr. Drug Metab. 5, 443-462 (2004).
- Goncalves, L. A., Vigario, A. M., Penha-Goncalves, C. Improved isolation of murine hepatocytes for in vitro malaria liver stage studies. Malar. J. 6, 169 (2007).
- Bu, S. Y., Mashek, D. G. Hepatic long-chain acyl-CoA synthetase 5 mediates fatty acid channeling between anabolic and catabolic pathways. J. Lipid Res. 51, 3270-3280 (2010).
- Aiken, J., Cima, L., Schloo, B., Mooney, D., Johnson, L., Langer, R., Vacanti, J. P. Studies in rat liver perfusion for optimal harvest of hepatocytes. J. Pediatr. Surg. 25, 140-144 (1990).
- Jauregui, H. O., McMillan, P. N., Hevey, K., Naik, S. A quantitative analysis of lectin binding to adult rat hepatocyte cell surfaces. In Vitro Cell. 24, 401-412 (1988).
- Klaunig, J. E., Goldblatt, P. J., Hinton, D. E., Lipsky, M. M., Trump, B. F. Mouse liver cell culture. II. Primary culture. In Vitro. 17, 926-934 (1981).
- Hay, R. J. Operator-induced contamination in cell culture systems. Dev. Biol. Stand. 75, 193-204 (1991).
