Summary
प्राथमिक hepatocytes के physiologically प्रासंगिक प्रयोगात्मक प्रणाली में जैव रासायनिक, आणविक, और चयापचय कार्यों का मूल्यांकन करने के लिए एक मूल्यवान उपकरण प्रदान करते हैं. हम सीटू जिगर छिड़काव, जो लगातार to1.0 × 10 के ऊपर व्यवहार्य hepatocytes उत्पन्न में चूहे के लिए एक विश्वसनीय प्रोटोकॉल का वर्णन
Abstract
प्राथमिक hepatocyte संस्कृति एक महत्वपूर्ण उपकरण है कि बड़े पैमाने पर किया गया है जिगर समारोह, रोग, औषध विज्ञान, pathophysiology और अन्य संबंधित विषयों के बुनियादी अनुसंधान में प्रयोग किया जाता है. Collagenase छिड़काव के लिए दो कदम बरकरार hepatocytes के अलगाव पर आधारित विधि पहले 1969 1 में बेरी और मित्र के द्वारा शुरू किया गया था और तब से, कई संशोधनों आया है. सबसे अधिक इस्तेमाल किया तकनीक 1976 Seglenin 2 द्वारा वर्णित किया गया था. मूलतः, hepatocytes के पोर्टल शिरा के माध्यम से एक गैर - रीसर्क्युलेटिंग Collagenase छिड़काव द्वारा संवेदनाहृत वयस्क चूहों से अलग कर रहे हैं. अलग कोशिकाओं तो एक 100 माइक्रोन रोमकूप आकार जाल नायलॉन फिल्टर के माध्यम से फ़िल्टर्ड रहे हैं, और प्लेटों पर सभ्य है. 4 घंटे की संस्कृति के बाद, सीरम युक्त या सीरम मुक्त मध्यम, संस्कृति के लिए अतिरिक्त समय के लिए जैसे HepatoZYME SFM, मध्यम के साथ बदल दिया है. इन प्रक्रियाओं शल्य चिकित्सा और बाँझ संस्कृति कदम है कि बेहतर पाठ द्वारा की तुलना में वीडियो द्वारा प्रदर्शन किया जा सकता है की आवश्यकता होती है. एचअरे, हम दोनों वीडियो और लिखा है, प्रोटोकॉल, जो बड़ी संख्या में व्यवहार्य hepatocytes की पीढ़ी में लगातार अनुमति देते हैं द्वारा इन प्रक्रियाओं के लिए विस्तृत कदम दस्तावेज़.
Protocol
1. तैयारी
सभी buffers के हौसले बाँझ तकनीक का उपयोग कर तैयार कर रहे हैं और फिल्टर एक Corning है .22 माइक्रोन फिल्टर का उपयोग निष्फल.
- परफ्यूज़न तैयार मैं हांक संतुलित नमक समाधान के लिए निम्नलिखित जोड़ने के द्वारा बफर (HbSS, Ca बिना 2 और 2 मिलीग्राम + तालिका 1 देखें): 0.9 मिमी, EDTA 0.5 मिमी, और HEPES के 25 मिलीग्राम 2 + (MgCl 2) के मिमी.
- HbSS के लिए निम्नलिखित जोड़ने (परफ्यूज़न बफर द्वितीय तैयार सीए के साथ 2 और 2 मिलीग्राम + 25 मिमी HEPES: तालिका 1) देखें.
- परफ्यूज़न बफर II प्लस collagenaseII के तैयार: Collagenase II (1000 यू) के 300 मिलीलीटर परफ्यूज़न बफर द्वितीय के साथ भंग करने और समाधान गर्म पानी के स्नान में छिड़काव से पहले रखना. इस 30 मिनट के भीतर समाधान इस्तेमाल किया जाना चाहिए क्योंकि Collagenase द्वितीय की गतिविधि समय के साथ कम.
- विलियम पूरा मध्यम तैयार: निम्नलिखित जोड़ेंकरने के लिए इंसुलिन 100 एनएम, dexamethasone के लिए 100 एनएम, पेनिसिलिन 100 से IU / मिलीलीटर और स्ट्रेप्टोमाइसिन 100 मिलीग्राम / एमएल एल glutamine के 2 मिमी, भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) 5% के लिए: 'विलियम्स मध्यम ई में.
- इन buffers 42 में नहाने के पानी में 30 मिनट के लिए गर्म किया जाना चाहिए डिग्री सेल्सियस, 37 के प्रवेशनी पर एक दुकान के तापमान के लिए एक इष्टतम इसी तापमान डिग्री सेल्सियस
2. लिवर अलगाव के लिए चूहा परफ्यूज़न
- छिड़काव प्रणाली पंप, autoclavable silastic टयूबिंग और एक पानी स्नान (चित्र 1 देखें) के होते हैं. पूर्व निर्धारित क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला छिड़काव पंप का प्रवाह 10 मिलीग्राम / मिनट की दर.
- Intraperitoneal (आईपी) (87 शरीर के वजन मिलीग्राम / किग्रा) ketamine प्लस xylazine (13 मिलीग्राम / किग्रा) के साथ एक वयस्क चूहे (300 ग्राम शरीर के वजन) असंवेदनता उत्पन्न करना. संज्ञाहरण की गहराई पैर की अंगुली चुटकी द्वारा निगरानी की जानी चाहिए. जब चूहा नहीं रह हानिकारक उत्तेजना का जवाब है, दाढ़ी पेट बाल और betadine और इथेनॉल के साथ पेट प्रस्तुत करने का. एक midline चीरा के माध्यम से दर्ज करें.
- बेनकाबध्यान उदर गुहा के बाहर सही करने के लिए आंत चलती है, और यकृत पोर्टल शिरा (चित्रा 1 देखें) में एक 18 गेज angiocath के सम्मिलित यकृत पोर्टल शिरा.
- सुई से कनेक्ट perfusate टयूबिंग और पूर्व गर्म (सी ° 37) परफ्यूज़न बफर मैं के साथ एक कम प्रवाह दर (10 मिलीग्राम / मिनट) पर बगल में जलसेक आरंभ.
- अगर ठीक से प्रदर्शन, जिगर तुरन्त रंग उड़ जाना करने के लिए शुरू करना चाहिए. एक बार सफल केन्युलेशन की पुष्टि की है, अवर रग Cava (IVC) में कटौती तपका (चित्र 1) की अनुमति देने के लिए कर सकते हैं. सफल केन्युलेशन के लिए एक और परीक्षण IVC के पर बाँझ झाड़ू के साथ प्रकाश दबाव लागू करने के द्वारा किया जा सकता है, जिगर के सभी खंडों को जल्दी से प्रफुल्लित करने के लिए शुरू करना चाहिए.
- प्रवाह के 25 मिलीग्राम / मिनट की दर बढ़ाएँ. जिगर रंग में पीला हो जाना चाहिए.
- एक अतिरिक्त 6 मिनट के लिए प्रवाह की कोई रुकावट के साथ छिड़काव परफ्यूज़न बफर द्वितीय प्लस Collagenase द्वितीय समाधान स्विच. <ली समय समय पर> (पाचन के दौरान 5-10 बार) 5 सेकंड के अंतराल के लिए IVC के लिए झाड़ू के साथ दबाव लागू होते हैं. जिगर प्रफुल्लित करने के लिए, बढ़ाया यकृत सेल हदबंदी के लिए अग्रणी, बदले में कुल पाचन समय को कम करने, और अंतिम उपज में वृद्धि होगी.
- Collagenase छिड़काव के बाद, जिगर के लिए भावुक लग शुरू करना चाहिए. मुक्त जिगर, 20 मिली विलियम पूरा मध्यम के साथ एक पूर्व ठंडा बाँझ बीकर में जगह काटना, और तब यह ऊतक सेल संस्कृति हुड के लिए ले.
3. Hepatocyte सेल अलगाव
- सेल संस्कृति हुड के भीतर, एक सेल खुरचनी का उपयोग करने के लिए धीरे विलियम पूरी मध्यम में एक बाँझ पेट्री डिश के भीतर कोशिकाओं को फैलाने के लिए.
- एक 50 मिलीलीटर चोटीदार ट्यूब में एक 100 माइक्रोन रोमकूप आकार के सेल झरनी के माध्यम से सेल फैलाव फ़िल्टर क्रम में संयोजी ऊतक और अव्यवस्थित है ऊतक के टुकड़े को दूर करने के लिए.
- 40 मिलीलीटर विलियम पूरा मध्यम और अपकेंद्रित्र में कोशिकाओं 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 50 XG को निलंबित करें
- सतह पर तैरनेवाला महाप्राण (व्यंजन), औरधीरे 40 मिलीग्राम ठंड विलियम पूरा मध्यम में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करने के लिए कोशिकाओं को धोने. Centrifugation दोहराएँ.
- सतह पर तैरनेवाला महाप्राण (व्यंजन), और धीरे से 25 मिलीलीटर विलियम पूरा मध्यम के साथ फिर से निलंबित कोशिकाओं. ट्यूब में 25 मिलीलीटर की 90% पीबीएस में Percoll समाधान जोड़ें और धीरे मिश्रण.
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 200 XG पर अपकेंद्रित्र ढाल के ऊपर से मृत कोशिकाओं को महाप्राण (व्यंजन) क्योंकि व्यवहार्य कोशिकाओं Percoll ढाल के नीचे रहते हैं.
- 30 मिलीलीटर गर्म विलियम पूरा मध्यम में सेल गोली स्थगित और फिर centrifugation दोहराना और 20 मिली गर्म विलियम पूरा मध्यम में सेल गोली फिर से निलंबित.
- सेल निलंबन के भीतर एक hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं गिनती और trypan नीले धुंधला द्वारा सेल व्यवहार्यता का निर्धारण.
4. Hepatocyte संस्कृति
- गर्म विलियम पसंदीदा एकाग्रता को पूरा मध्यम के साथ कोशिकाओं पतला, 2.5 जैसे x 10 5 कोशिकाओं / एमएल. वांछित मात्रा में सेल संस्कृति प्लेटों पर थाली कोशिकाओं, जैसे. 5 एक्स 5 10 कोशिकाओं / 2 मिलीलीटर अच्छी तरह /, 6 कुओं / थाली, या 2.5 x 10 5 कोशिकाओं / 1.5 मिलीग्राम / 12, कुओं / प्लेट. अन - लेपित प्लेट यकृत सेल संस्कृतियों के लिए ठीक है.
- > 85% व्यवहार्य कोशिकाओं के साथ एक ठेठ प्रस्तुत करने में, सेल घनत्व 60-70% लगभग संगम है, जो सेल सेल संपर्क के लिए अनुमति देता है तक पहुँचने जबकि hepatocytes के अपने पूर्ण सेल आकार को विकसित करने के लिए और अंतिम संगम उपज के लिए पर्याप्त जगह बनाए रखने चाहिए 90-95%.
- Hepatocytes के क्रम में एक भी monolayer बनाने के लिए, दूसरे शब्दों में, अच्छी तरह से केंद्रीय क्षेत्र में कुल के लिए कोशिकाओं के लिए की प्रवृत्ति को कम करने (सबसे संभावना सेल इनक्यूबेटर के अंदर हवा प्रवाह के कारण), प्लेट के अंदर रहने के लिए अनुमति उन्हें एक इनक्यूबेटर में रखने से पहले 30 मिनट के लिए सेल संस्कृति हुड.
- संस्कृति 37 ° 95% हवा और 5% सीओ 2 के एक humidified वातावरण में सी में कोशिकाओं. 4 घंटे संस्कृति के बाद, कोशिकाओं या तो युक्त एक ही मध्यम सीरम में रह सकता है या सीरम - च के साथ मध्यम की जगहree मध्यम, जैसे HepatoZYME SFM (देखें तालिका 1). मध्यम सीरम मुक्त हार्मोन से कोई प्रतिकूल प्रभाव जब एक सीरम मुक्त मध्यम प्रयोग किया जाता है के साथ सेल आकारिकी बनाए रखने में मदद करता है.
- कोशिकाओं को ठीक करने के लिए और कम से कम रात भर बढ़ने के प्रयोग के लिए पूर्व अनुमति दें. हम 24 घंटे के भीतर परीक्षण के लिए कोशिकाओं का उपयोग करने की सलाह देते हैं क्योंकि इस महत्वपूर्ण एंजाइम (जैसे, P450s) के समारोह को बनाए रखने में मदद कर सकते हैं.
- 2 दिन के अंतराल पर मध्यम विकास बदलें, अगर जरूरत है.
5. प्रतिनिधि परिणाम
शर्तों में वर्णित नियमित रूप से एक चूहा जिगर से 1.0 x 10 8 तैयारी प्रति कोशिकाओं के सेल फसल उत्पन्न. trypan नीला अपवर्जन द्वारा मापा hepatocytes की व्यवहार्यता 88 ~ 96% की सीमा के भीतर लगातार था.
चित्रा 2, hepatocytes और 4 घंटा बोने के बाद प्रपत्र क्लस्टर कुल में दर्शाया है. सबसे अलग कोशिकाओं को समतल और ठेठ monolayer विकास में फैल. 24 घंटा, कोशिकाओं के किनारों में परिभाषित कर रहे हैं, कोशिकाओं की सतह काफी चिकनी है, और लिपिड बूंदों दिखाई दे रहे हैं. कोशिकाओं 02:59 nucleoli, जो गोल कर रहे हैं कोशिकाओं के केंद्र में स्थित है, और कोशिकाओं के बीच नाभिक प्रदर्शन लगातार आकार (चित्रा 2) है.
चित्रा 1 जिगर छिड़काव का एक चित्र. एक 18 गेज angiocath के जिगर के पोर्टल नस में डाला जाता है, तो एक perfusate टयूबिंग सुई से जुड़ा है. एक बार सफल केन्युलेशन की पुष्टि की है, अवर रग Cava (IVC) में कटौती तपका अनुमति देने के लिए कर सकते हैं.
चित्रा 2 समय के साथ सुसंस्कृत hepatocytes (4 घंटा 24 घंटे), बढ़ाई x 200 का आकृति विज्ञान. के बाद 24 घंटे के लिए सभ्य कोशिकाओं ठेठ monolayer विकास में फैला है, और कोशिकाओं के बीच जंक्शनों रैखिक रहे हैं.
| अभिकर्मक का नाम | कंपनी | सूची संख्या |
| HbSS (2 सीए के बिना, और मिलीग्राम + 2) | Invitrogen | 14,174 |
| HbSS (2 सीए, और 2 मिलीग्राम के साथ +) | Invitrogen | 14,025 |
| विलियम्स मध्यम ई | Invitrogen | 12551-032 |
| Collegenase द्वितीय | वर्थिंगटन | LS004176 |
| सेल झरनी (100 माइक्रोन) | बी.डी. | 352,360 |
| HepatoZYME - SFM | Invitrogen | १७७०५ |
| Percoll | सिग्मा | P4937 |
| Angiocath (18 गेज) | बी.डी. | ३,८१,७०५ |
तालिका 1.
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Discussion
Hepatocytes की प्राथमिक संस्कृति इन विट्रो मॉडल में एक व्यापक रूप से जिगर शरीर विज्ञान और विकृति विज्ञान के विभिन्न पहलुओं का अध्ययन किया है. उदाहरण के लिए, प्राथमिक संस्कृति अभिव्यक्ति और दवा metabolizing एंजाइमों की P450 cytochromes, दवा चयापचय, दवा दवा बातचीत, और cytotoxicity और 3-7 genotoxicity है के तंत्र सहित समारोह का आकलन करने के लिए प्रयोग किया जाता है. अलगाव और चूहा यकृत कोशिकाओं के संस्कृति का वर्णन प्रोटोकॉल Aiken एट अल की पिछली रिपोर्टों से अनुकूलित है 8., और अन्य संशोधनों के साथ 2,9,10. शर्तों में वर्णित लगातार व्यवहार्य hepatocytes के ऊपर 1,0 x 10 8 88 ~ 96% के बीच सेल व्यवहार्यता के साथ तैयारी प्रति कोशिकाओं. निम्नलिखित अन्य महत्वपूर्ण कदम हैं:
- किसी भी सेल संस्कृति प्रोटोकॉल का वर्णन के साथ के रूप में, सबसे महत्वपूर्ण पहलू सख्त सड़न रोकनेवाला तकनीक 11 का उपयोग करके बैक्टीरिया या कवक रोगज़नक़ों से संक्रमण से बचने के लिए है.
- Desmosome, भी मैक्युला adherens रूप में जाना जाता है, एक सेल सेल करने वाली कोशिका आसंजन के लिए विशेष संरचना है. desmosome की अखंडता कैल्शियम की आवश्यकता है, और यह नीचे EDTA और कैल्शियम मुक्त मीडिया से टूट गया है. एंजाइमों Collagenase desmosome अलग कर देना, अलगाव यकृत की कोशिकाओं के लिए अग्रणी कर सकते हैं. इसलिए, छिड़काव 2 सीए का उपयोग करता है + मुक्त मध्यम और बाद में 2 Ca + अमीर मध्यम 2 Ca युक्त + पाचन के लिए निर्भर Collagenase.
- उपयुक्त Collagenase इलाज पूरी तरह से hepatocyte तैयारी के लिए महत्वपूर्ण है. द्वितीय Perfussion बफर द्वितीय प्लस collegenase के प्रवाह दर के 25 मिलीग्राम / मिनट पर रखा जाना चाहिए. असफल hepatocyte संस्कृति की आम कारणों में शामिल हैं: 1) गरीब सेल हदबंदी, जो अपर्याप्त छिड़काव 37 डिग्री सेल्सियस और या धीमी का छिड़काव गति / गरम बफ़र्स के कारण हो सकता है, कोशिका मृत्यु और 2) जो coulघ अत्यधिक Collagenase पाचन के कारण हो.
- सावधान रहो, जब पहली संस्कृति 4 घंटे के बाद मीडिया बदल रहा है, के रूप में hepatocytes के अभी भी अपेक्षाकृत कमजोर और आसानी से क्षतिग्रस्त किया जा सकता है या सीधे संपर्क से बाधित है, केवल अच्छी तरह से पक्ष नीचे विंदुक, सीधे कोशिकाओं के शीर्ष पर है और कभी नहीं.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
लेखकों के लिए तकनीकी सहायता के लिए श्री जोश Basford और डॉ. जिओ मिनट ली को धन्यवाद देना चाहूंगा. इस काम के हिस्से में को एनआईएच अनुदान (DK70992 और DK92779 एमएल) द्वारा समर्थित किया गया था.
References
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