Høy oppløsning Live-Imaging of Cell Behavior i utviklingsland Neuroepithelium

Summary

Imaging embryonale vev i sanntid er utfordrende over lange perioder. Her presenterer vi en analyse for overvåking cellulære og sub-cellulære endringer i chick ryggmargen for lange perioder med høy romlig og tidsmessig oppløsning. Denne teknikken kan tilpasses for andre regioner i nervesystemet og utvikling av embryo.

Abstract

Den embryonale Ryggmargen består av sykling nevrale stamceller som gir opphav til en stor andel av de nevrale og gliaceller i sentralnervesystemet (CNS). Selv om mye er kjent om de molekylære mekanismene som mønster ryggmargen og framprovosere neuronal differensiering ^{1, 2,} mangler vi en dyp forståelse av disse tidlige hendelser på nivået av cellen oppførsel. Det er derfor viktig å studere oppførselen til nevrale stamceller i sanntid som de gjennomgå neurogenesis.

I det siste, sanntids avbildning av tidlig embryoutvikling vev har vært begrenset av celle / vev levedyktighet i kultur samt fototoksiske effektene av fluorescerende bildebehandling. Her presenterer vi en ny test for bildebehandling slikt vev i lange perioder, bruk en roman ex vivo skive kultur protokoll og bredt felt fluorescens mikroskopi (Fig. 1). Denne tilnærmingen oppnår langsiktig time-lapse overvåking av chick embryonale sPinal ledningen stamceller med høy romlig og tidsmessig oppløsning.

Denne analysen kan modifiseres til bilde en rekke embryonale vev ^{3, 4} I tillegg til observasjon av cellulære og sub-cellulær atferd, utvikling av romanen og svært sensitive journalister for genaktivitet (for eksempel Notch signalering ⁵⁾ gjør denne analysen et kraftig verktøy til å forstå hvordan signaliserer regulerer celle oppførsel under embryonal utvikling.

Protocol

1. Dish Forberedelse

1. Retter som brukes til skive kultur er glass-bunn (med en dekkglass som base) (WillCo retter). Disse er plassert på objektivet vev i en 6 cm vevskultur rett til å holde glasset bunnen ren.
2. På dagen før forsøket, tilsett 2 ml 0,1% poly-L-lysin løsning på glassbunn rett og inkuber 5min ved romtemperatur slik at poly-L-lysin å belegge glassbunn.
3. Fjern poly-L-lysin løsning og skyll tre ganger i avionisert vann, og deretter en gang i 70% etanol.
4. La det tørke over natten. Rettene kan også tørkes ved forsiktig oppvarming i mikrobølgeovn på lav effekt i 30-45 sekunder.

2. Embryo electroporation

1. Inkuber egg ved 37 ° C til Hamburger-Hamilton (HH) stadium 10 (~~~HEAD=NNS 36 timer) (eller annen ønsket scene).
2. Før du begynner å forberede glass nåler (vi bruker en Flaming / Brown modell p87 microcapillary puller) og brekker av spissen av needle med en fin pinsett under et dissekere mikroskop. Slutten av nålen skal være skarp nok til å pierce embryo samtidig ikke være så smal at den hindrer injeksjon av DNA løsningen.
3. Vindu egg og sted elektroder (5mm mellomrom) på hver side av embryoet
4. Injiser DNA (~ 0,025 til 0,5 mg / mL i avionisert vann farget med en liten mengde rask grønn) i nevralrøret.
5. Påfør gjeldende - 12-17 V tre ganger, 50ms puls lengde med 950 ms mellom pulser.
6. Vi bruker lave konsentrasjoner av DNA og lave electroporation spenninger for å oppnå mosaikk uttrykk, slik at vi kan følge individuelle celler.
7. Dekk vindu i eggeskallet med cellotape og sørg for at den er forseglet.
8. Tillat embryoer til å gjenopprette i 3-4 timer eller over natten ved 37 ° C.

3. Kollagen og Slice kultur medium Forberedelse

1. Forbered kollagen mix og skive kultur medium omtrent en time før du skjærer.
2. Til 300 mL type en kollagen tilsett 100 mL 0,1% eddiksyreløsning og 100 mL 5 x L15 medium. Vortex grundig etter hvert tillegg. Løsningen bør bli gul.
3. Nå legger 15-20 mL 7,5% natriumbikarbonat og grundig virvle. Løsningen bør bli litt rosa, og volumet av natriumbikarbonat nødvendig for at denne kan variere. Hold på is og fyll opp frisk hver gang.
4. Til 10 ml neurobasal medium legge B-27 supplement og Glutamax, til en 1 x endelig konsentrasjon og 10 mL Gentamicin løsning.
5. Plasser medium i en 37 ° C inkubator bufret med 5% CO _2. La toppen av beholderen løs for å tillate det å stabilisere seg med CO _2.

4. Slice Kultur

1. Fjern embryoer fra egg og vask i L15 medium.
2. Plasser i en vevskultur tallerken med et lag av sylgard nederst og pin dem ut gjennom de omkringliggende ekstra embryonale membraner, slik at de er strukket stramt.
3. Bruke en microknife, sklie embryo så rett som mulig gjennom regionen av interesse. For ryggmargen, bør skivene være mellom 1-2 somites tykke. La skiver festet til embryoet mens du skjære andre embryoer slik at du ikke mister dem.
4. Forbered en 200 mL mikropipette tips ved å kutte ~ 1 mm av spissen og feste dette til en P2 eller P10. Dette tipset vil bli brukt til å overføre ryggmarg skiver til glassbunn fatet. En 10 mL tips er ikke bred nok til å plukke opp skiver.
5. Coat innsiden av tuppen med kollagen ved pipettere 1 mL kollagen mix forberedt tidligere. Permisjon for 1-2 minutter og skyll med L15 medium. Dette vil forhindre at vev fester seg til innsiden av tips.
6. Koble skive fra embryo ved hjelp av en microknife og fjerne fra fatet med en P2 eller P10 er utstyrt med en 200 mL tips og satt til 1 mL. Prøv å ta opp så lite medium som mulig.
7. Vortex kollagen mix og slipp 5-8 mL av dette videre til poly-L-lysin belagt parabolen.
8. ImmediaHeldigvis satt embryo skive i kollagen og posisjon på plass med et par fine tang. Skiver bør plasseres slik at den siden som skal avbildes er i flukt med dekkglass. Vevet bør forholde seg til poly-L-lysin belegg på dekkglass.
9. Gjenta dette til du har flere skiver på dekkglass. Vi kan vanligvis plassere 6-9 skiver på en tallerken.
10. Når alle skivene er på plass, dekk fatet og la kollagen å stille i 20 minutter. Noen av de tidligste plassert kollagen kan allerede ha begynt å tørke ut. For å forhindre dette legge en liten mengde L15 til disse før tildekking.
11. Når det er satt, tilsett forsiktig 2ml skive kultur medium som har vært likevekt i 5% CO ₂ ved 37 ° C i minst en time. Det må tas for å ikke løsne kollagen fra dekkglass.
12. Plasser i en 37 ° / 5% CO ₂ inkubator og la skiver å utvinne minst 3 timer før bildebehandling. Hvis det ikke er fuktighet, sted rett i en plexi box witha litt fuktig papir i det ene hjørnet.

5. Imaging embryo Slices

1. Vi bruker en DeltaVision Core-wide-feltet mikroskop utstyrt med en værstasjon miljø kammer til bilde skiver. Kammeret er konstant på 37 ° C, med en CO ₂ perfusjon apparat for å opprettholde mikroskopet scenen på 5% CO _2/95% luft.
2. Imaging utføres normalt ved hjelp av en 40 x / 1,30 NA oljeneddyp linse og bildene er tatt med en CoolSnap HQ2 avkjølt CCD-kamera.
3. Z-seksjoner blir fanget hvert 1,5 mikrometer gjennom 45 mikrometer vev. Eksponeringstid bør holdes så lav som mulig. Vi har normalt utsette for 5-50 ms for hver Z-seksjon. Bildene er tatt hvert 7. minutt og opptil 9 skiver kan besøkes med DeltaVision systemets nøyaktige punktet besøke funksjon.

6. Representative Resultater

Et eksempel time-lapse sekvens av en ryggmarg stamceller ervist i fig. 2a og tilsvarende Movie 1. Imaging ble startet på en ryggmarg skive fra en to-dager gamle (HH stadium 12) embryo. Denne cellen ble tilført med en konstruksjon som uttrykker GFP-αTubulin. I løpet av denne tidlige fasen, nevrale stamceller gjennomgår hovedsakelig stamfar-progenitor modus divisjoner der cellene deler for å generere ytterligere to sykling stamceller. Fig. 2b og tilsvarende Movie 2 viser en celle tilført med GFP-GPI (GPI forankret GFP), merking cellemembranen. Denne cellen gjennomgår en divisjon der den basale prosessen deles i to og er like arvet av datterceller.

Figur 1. Slice kultur protokoll for time-lapse imaging.

Figur 2. Cell behavior under normal ryggmargen utvikling. (a) Utvalgte bilder fra Movie 1. Cell uttrykker GFP-tubulin deler med en cleavage fly som er vinkelrett på den apikale overflaten (2 t 20 min), genererer to datterceller som deler igjen (24 t 23 min og 25 t 54 min). (B) Utvalgte bilder fra Movie 2. Cell tilført med GFP-GPI gjennomgår celledeling hvor den basale prosessen er delt (hvite piler) og like arvet av datterceller.

Movie 1. Klikk her for å vise film .

Movie 2. Klikk her for å vise film .

Discussion

Vi presenterer her en roman time-lapse bildebehandling analysen å overvåke celle atferd i kylling embryonale skive kultur. Denne analysen gir høy oppløsning av levende vev for opptil 70 timer, selv om tidsrammer mellom 24-48 timer er lettere å fange. Bruken av en høy NA olje objektiv og relativt korte intervaller mellom tid-poeng gjør at bildet oppkjøpet i høy oppløsning, samt at vi kan overvåke celle atferd som ofte skjer raskt, og kan lett overses ved konvensjonell time-lapse avbildning ved hjelp confocal mikroskopi.

Den store fordelen med denne analysen er evnen til bildet celler over lange perioder. Bruk av brede felt ⁶ i stedet for confocal laserskanning ⁷ mikroskopi er kritisk for dette. Konfokalmikroskopi har tradisjonelt tilbudt flere fordeler fremfor bredt felt mikroskopi, inkludert muligheten til å ta optiske seksjoner og eliminere ut av fokus informasjon direkte 8, unntatt en betydelig mengde informasjon, og nødvendiggjør lengre eksponeringstider. Wide-field mikroskopi, derimot, bruker full felt belysning og alt lyset som passerer gjennom målet er sendt til detektoren. Dette kombinert med en høy Quantum effektiviteten avkjølt kombinert enhet (CCD) kamera sørger bildebehandling med høy signal til støyforhold i forhold til konfokalmikroskopi ^9, med svært raske eksponeringstider. I søknaden vår, må vi bilde i lange perioder, ta opp 3D stabler og til slutt løse små nær-diffraksjon begrensede strukturer. Selv konfokalmikroskopi hindrer ut-av-fokus lys fra noensinne å nå detektoren og dermed reduserer bakgrunn i tykke, tette-merket prøver ^{7, 8,} oppnår det bare en brukbar signal-til-støy-forhold med mye større lys inngang enn bred- felt mikroskopi ^10. For veldig lysømfintlig sparsely-merket prøvene som våre electroporated ryggmarg skiver, derfor utfører bredt felt mikroskopi bedre enn konfokalmikroskopi. Når det kombineres med bilde restaurering av deconvolution, fjerner noe ut av fokus informasjon og forbedrer kontrasten, wide-feltet er så spesielt bra for påvisning av små, dim gjenstander ^11. Selv om ikke egnet for alle vev avbildning eksperiment, har denne tilnærmingen vært svært effektive for vår live celle bildebehandling søknad.

Valget av fluorescerende protein er en viktig faktor som kan påvirke celle overlevelse. Vi finner at de beste resultatene er hentet fra konstruksjoner som bruker grønn fluorescerende protein (GFP) ¹² som en markør. Vi vurderer for tiden en rekke røde fluorescerende proteiner som kan brukes effektivt i kombinasjon med GFP for dual channel time-bortfaller. Det finnes en rekke slike proteiner tilgjengelige ^13. Selv om mange proteiner er stabilt som fusjoner med et fluorescerende proteinKan noen proteiner gjengis ustabil ved fusjon, noe som resulterer i redusert celle levedyktighet. I slike tilfeller er bruk av konstruksjoner som inneholder en intern ribosomet oppføring hotellet (IRES) nyttig å skille protein av interesse fra fluorescerende protein.

Når bildebehandling ryggmarg skiver, må man sørge for å minimere eksponering for fluorescerende lys. Mikroskopet okularer må bare brukes med overført lys (lysfelt) for å finne og posisjon skiver. Fluorescent bilder bør alltid være anskaffet ved hjelp av mikroskop programvaren ved hjelp av minimal eksponering ganger. Disse bør oppbevares i størrelsesorden 5-50 ms og bruk av nøytral tetthet filter bør eksperimentert med. Selv lengre eksponeringstider kan i utgangspunktet produsere klarere bilder, kan fototoksiske effektene av fluorescerende lys eksponering føre til celledød. De første 5-10 mikrometer i vev som er nærmest dekkglass bør ikke avbildes som denne regionen inneholder vev som kan ha blitt skadet underkutting.

Selv om eksemplene som presenteres her er av embryoer electroporated ved HH scene 10 og avbildes 6-7 timer senere, kan denne metoden benyttes for embryoer opp til HH scenen 18. Ved senere stadier, er ryggmargen vev mye større og så er vanskelig å skjære for hånd. I disse tilfellene kan bygge embryoene i lavt smeltepunkt agarose og seksjonering med en vibratome gi bedre resultater. Selv om vi presentere denne analysen som en metode for imaging celler i utviklingsland ryggmargen, har denne tilnærmingen også blitt modifisert til å ta bilder andre embryonale vev, inkludert den sensoriske placodes ^tre.