Met een hoge resolutie Live-Imaging van cel gedrag in de ontwikkelingslanden Neuroepithelium

Summary

Imaging embryonaal weefsel in real-time is een uitdaging gedurende een lange periode van tijd. Hier presenteren we een test voor het toezicht cellulaire en sub-cellulaire veranderingen in de chick ruggenmerg gedurende lange perioden met een hoge ruimtelijke en temporele resolutie. Deze techniek kan worden aangepast voor andere gebieden van het zenuwstelsel en zich ontwikkelende embryo.

Abstract

De embryonale ruggenmerg bestaat uit fietsen neurale stamcellen die aanleiding geven tot een groot percentage van de neuronale en gliale cellen van het centrale zenuwstelsel (CZS). Hoewel veel bekend is over de moleculaire mechanismen die patroon het ruggenmerg en uitlokken neuronale differentiatie ^{1, 2,} missen we een diep begrip van deze vroege gebeurtenissen op het niveau van cel gedrag. Het is derhalve essentieel om het gedrag van neurale voorlopercellen in real time bestuderen zij ondergaan neurogenese.

In het verleden, real-time beeldvorming van de vroege embryonale weefsel is beperkt door cel / levensvatbaarheid van het weefsel in de cultuur en de fototoxische effecten van fluorescerende beeldvorming. Hier presenteren we een nieuwe test voor het afbeelden van dergelijke weefsels voor langere tijd, met behulp van een nieuwe ex vivo slice cultuur-protocol en wide-field fluorescentie microscopie (afb. 1). Deze aanpak bereikt op lange termijn time-lapse monitoring van kuiken embryo'sPinal koord progenitorcellen met een hoge ruimtelijke en temporele resolutie.

Deze test kan worden gewijzigd op het beeld een reeks embryoweefsel ^{3, 4} naast de waarneming van cellulaire en subcellulaire gedrag de ontwikkeling van nieuwe en gevoelige reporters voor genactiviteit (bijvoorbeeld Notch signalering ⁵⁾ dit assay een krachtig instrument om te begrijpen hoe het signaleren reguleert cel gedrag tijdens de embryonale ontwikkeling.

Protocol

1. Schotel Voorbereiding

1. Schotels voor slice cultuur zijn glazen bodem (met een dekglaasje aan als de basis) (Willco gerechten). Deze worden geplaatst op de lens weefsel in een 6 cm weefselkweek schotel te houden van de glazen bodem schoon.
2. Op de dag voor de proef 2 ml 0,1% poly-L-lysine oplossing van het glazen bodem schaal en incubeer 5min bij kamertemperatuur om de poly-L-lysine het bekleden van de glazen bodem.
3. Verwijder poly-L-lysine oplossing en spoel drie keer in gedemineraliseerd water bij en dan een keer in 70% ethanol.
4. Laat een nacht drogen. Gerechten kunnen ook worden gedroogd door voorzichtige verwarming in een magnetron op laag vermogen gedurende 30-45 seconden.

2. Embryo Elektroporatie

1. Incubeer eieren bij 37 ° C Hamburger-Hamilton (HH) fase 10 (~ 36 uur) (of andere gewenste stap).
2. Alvorens te beginnen met de voorbereiding glas naalden (wij gebruik van een Flaming / bruin model P87 microcapillaire trekker) en breek het topje van de needle met een fijne pincet onder een stereomicroscoop. Het einde van de naald scherp genoeg zijn om doorboren embryo hoewel niet zo nauw, dat het injecteren van de DNA-oplossing belemmert.
3. Raam eieren plaats elektroden (5mm elkaar) aan weerszijden van de embryo
4. Injecteer DNA (~ 0,025 tot 0,5 pg / pl in gedeïoniseerd water gekleurd met een kleine hoeveelheid Fast Green) in de neurale buis.
5. Breng de huidige - 12-17 V drie keer, 50ms pulslengte met 950 ms tussen pulsen.
6. We maken gebruik van lage concentraties van DNA-en laag elektroporatie spanningen te mozaïek expressie te komen, zodat we kunnen volgen individuele cellen.
7. Bedek venster in de eierschaal met plakband en zorg ervoor dat wordt verzegeld.
8. Laat embryo's 3-4 uren of herstellen bij 37 ° C.

3. Collageen en Slice Cultuur Medium Voorbereiding

1. Bereid collageen mix en plak kweekmedium ongeveer een uur alvorens te snijden.
2. Aan 300 pi type 1 collageen voeg 100 ul 0,1% azijnzuur en 100 ul 5 x L15 medium. Vortex grondig na elke toevoeging. De oplossing moet geel.
3. Nu Voeg 15-20 ul 7,5% natriumbicarbonaat en grondig vortex. De oplossing moet lichtroze en het volume van natriumbicarbonaat voor deze verschillen. Houd op het ijs en make-up verse per keer.
4. Aan 10 ml neurobasal medium toe te voegen B-27 supplement en Glutamax, op een 1 x eindconcentratie en 10 ul Gentamicine oplossing.
5. Plaats medium in een 37 ° C incubator gebufferd met _5% CO2. Laat de bovenkant van de houder los zodat het equilibreren van de _CO2.

4. Slice Cultuur

1. Verwijder de embryo's van ei en wassen in L15 medium.
2. Plaats in een weefselkweek schotel met een laag Sylgard onderaan en pen ze door het omringende extra-embryonale membranen zodat deze bespannen.
3. Met behulp van een microfoonroknife, slice embryo zo recht mogelijk door regio van belang. Voor het ruggenmerg, moet plakken zijn tussen 1-2 somieten dik. Laat plakken aan embryo's, terwijl je slice andere embryo's, zodat je niet verliezen.
4. Bereid een 200 ul micropipet tip door het afsnijden ~ 1 mm van de punt en verbonden naar een p2 of p10. Dit uiteinde zal worden gebruikt om het ruggenmerg segmenten dragen aan de glazen onderste schaal. Een 10 ul tip is niet breed genoeg is op te halen plakjes.
5. Smeer de binnenkant van de tip met collageen door pipetteren 1 pi collageen mix eerder voorbereid. Laat gedurende 1-2 minuten en spoel het daarna met L15 medium. Dit voorkomt het weefsel hechten aan de binnenzijde van de tip.
6. Maak slice van embryo met behulp van een microknife en haal hem uit de schotel met een P2 of P10 uitgerust met een 200 ul tip en ingesteld op 1 pl. Probeer om zo weinig medium mogelijk.
7. Vortex de collageen mix en drop 5-8 pi van dit op de poly-L-lysine gecoate schaal.
8. Defimediately zet embryo snij ze in collageen en positie op zijn plaats met een paar fijne pincet. Slices moet worden geplaatst, zodat de kant af te beelden is gelijk met de dekglaasje aan. Het weefsel moet voldoen aan de poly-L-lysine coating op het dekglaasje.
9. Herhaal dit tot je een paar plakken op het dekglaasje aan. We kunnen gewoonlijk plaats 6-9 plakjes op een schotel.
10. Als alle plakken op hun plaats, bedek de schotel en laat het collageen in te stellen gedurende 20 minuten. Enkele van de vroegste geplaatst collageen misschien al begon op te drogen. Om te voorkomen dat een kleine hoeveelheid L15 aan deze voor bekleding.
11. Eenmaal ingesteld, zorgvuldig toe te voegen 2 ml slice kweekmedium dat is geëquilibreerd in _5% CO2 bij 37 ° C gedurende ten minste een uur. Er moet worden genomen om niet verdrijven het collageen van de dekglaasje aan.
12. Plaats in een 37 ° / _5% CO2 incubator en laat plakjes tot tenminste 3 uren herstellen voordat beeldvorming. Als er geen vochtigheid, de schotel in een perspex box witha beetje vochtig vloeipapier in een hoek.

5. Imaging Embryo Slices

1. We gebruiken een DeltaVision Core wide-field microscoop uitgerust met een Weerstation klimaatkamer om de afbeelding te plakken. De kamer wordt constant op 37 ° C met _een CO2 perfusie de toestel microscooptafel handhaven op _5% CO2 / 95% lucht.
2. Imaging wordt normaal gesproken uitgevoerd met een 40 x / 1,30 NA olie-immersie lens en de beelden worden vastgelegd met een CoolSNAP HQ2 gekoeld CCD-camera.
3. Z-profielen zijn vastgelegd om 1,5 pm tot 45 pm weefsel. Sluitertijd moet zo laag mogelijk. We normaal gesproken bloot voor 5-50 ms voor elk Z-sectie. Beelden worden vastgelegd om de 7 minuten en maximaal 9 plakjes kan worden bezocht via het DeltaVision systeem precieze punt bezoek functie.

6. Representatieve resultaten

Een voorbeeld time-lapse sequentie van een ruggenmerg progenitor celFig. 2a en bijbehorende Movie 1. Imaging is gestart op een ruggenmerg plak van een twee dagen oude (HH stadium 12) embryo. Deze cel getransfecteerd met een construct tot expressie GFP-αTubulin. In dit vroege stadium, neurale stamcellen ondergaan voornamelijk progenitor-voorlopercellen mode divisies waarin de cellen zich delen twee extra fietsen stamcellen te genereren. Fig. 2b en bijbehorende film 2 toont een cel getransfecteerd met GFP-GPI (GPI verankerd GFP) het markeren van de celmembraan. Deze cel ondergaat een divisie waarin de basale proces splitst in twee en is eveneens overgenomen door de dochter cellen.

Figuur 1. Slice cultuur protocol voor time-lapse imaging.

Figuur 2. Cell behavior tijdens de normale ontwikkeling van het ruggenmerg. (a) Geselecteerde frames van Movie 1. Cell expressie GFP-tubuline verdeelt een splitsing vlak loodrecht op de apicale oppervlak (2 h 20 min), het opwekken van twee dochtercellen die delen weer (24 h 23 min en 25 h 54 min). (B) Geselecteerde frames van Movie 2. Cel getransfecteerd met GFP-GPI ondergaat de celdeling gedurende welke de basale proces wordt gesplitst (witte pijlen) en ook overgenomen door de dochter cellen.

Movie 1. Klik hier om film te bekijken .

Movie 2. Klik hier om film te bekijken .

Discussion

We presenteren hier een nieuwe time-lapse imaging test naar cel gedrag in kip embryonale slice cultuur te bewaken. Deze test zorgt voor een hoge resolutie beeldvorming van levend weefsel tot 70 uur, hoewel de tijd frames tussen 24-48 uur zijn gemakkelijker te vangen. Het gebruik van een hoge NA olie objectief en relatief korte intervallen tussen de tijdstippen maakt beeldacquisitie met een hoge resolutie, maar ook zodat we cel gedrag dat vaak voorkomt snel volgen, en kan gemakkelijk worden gemist tijdens de conventionele time-lapse imaging met behulp van confocale microscopie.

Het grote voordeel van deze test is de mogelijkheid om beeld cellen gedurende lange perioden. Het gebruik van wide-field ^{6 in} plaats van confocale laser scanning microscopie ⁷ is van cruciaal belang voor deze. Confocale microscopie is van oudsher aangeboden een aantal voordelen ten opzichte van breed-veld microscopie, inclusief de mogelijkheid om optische secties te nemen en te elimineren onscherp informatie direct 8, zonder een aanzienlijke hoeveelheid informatie, en noodzaak langere belichtingstijden. Brede microscopie, anderzijds, gebruikt vol-belichting en al het licht door het objektiefstelsel wordt naar de detector. In combinatie met een hoog kwantumrendement afgekoeld coupled device (CCD) camera zorgt beeldvorming met een hoge signaal-ruisverhouding ten opzichte van confocale microscopie ⁹ zeer snel belichtingstijden. In onze toepassing, moeten we de afbeelding voor een langere tijd, record 3D-stapels en uiteindelijk op te lossen kleine-bijna-diffractie beperkte structuren. Hoewel confocale microscopie voorkomt out-of-focus licht ooit op de detector en dus vermindert de achtergrond in de dikke, dicht-gelabelde monsters ^{7, 8,} levert hij slechts een bruikbaar signaal-ruis-verhouding met een veel grotere lichtinval dan breed- microscopie ^10. Voor zeer lichtgevoelige sparsely-gelabelde monsters zoals onze geëlektroporeerde ruggenmerg plakken, daarom breed-veld microscopie beter presteert dan confocale microscopie. In combinatie met beeld restauratie door deconvolutie, die verwijdert onscherp informatie en verbetert contrast, wide-field is dan bijzonder goed voor de detectie van kleine, afm voorwerpen ^11. Hoewel niet geschikt is voor elk weefsel imaging experiment, heeft deze aanpak zeer effectief voor onze live cell imaging-toepassing.

De keuze van fluorescerend eiwit is een belangrijke factor celoverleving kunnen beïnvloeden. We merken dat de beste resultaten worden verkregen constructen die green fluorescent protein (GFP) ¹² als een marker. We zijn momenteel de beoordeling van een aantal rode fluorescerende eiwitten die effectief kan worden gebruikt in combinatie met GFP voor het dual channel tijd vervalt. Er zijn een verscheidenheid aan eiwitten beschikbaar ^13. Hoewel vele eiwitten stabiel fusies met een fluorescerend eiwitKunnen sommige eiwitten worden gemaakt instabiel door de fusie, wat resulteert in een verminderde levensvatbaarheid van de cellen. In dergelijke gevallen is het gebruik van constructen met een interne ribosomale toegangsplaats (IRES) is nuttig om het eiwit van belang te scheiden van de fluorescent eiwit.

Bij beeldvorming ruggenmerg plakken, moeten maatregelen genomen worden om blootstelling aan TL-licht te minimaliseren. De microscoop oculairs mag alleen worden gebruikt met doorvallend licht (helderveld) te lokaliseren en positie plakjes. TL-beelden moeten altijd worden verworven met behulp van de microscoop software met behulp van minimale blootstelling tijden. Deze moeten worden bewaard in de range van 5-50 ms en het gebruik van grijsfilters moet worden geëxperimenteerd. Hoewel de langere belichtingstijden kan in eerste instantie produceren scherpere beelden, kunnen de fototoxische effecten van TL-licht blootstelling leiden tot celdood. De eerste 5-10 um van weefsel dat het dichtst bij het dekglaasje mag niet worden afgebeeld, omdat dit gebied bevat weefsel die zijn beschadigd tijdenssnijden.

Hoewel de voorbeelden hier gepresenteerde zijn van embryo's geëlektroporeerd bij HH stadium 10 en verbeelde 6-7 uur later, kan deze methode worden gebruikt om embryo's tot stadium 18 HH. In latere stadia, het ruggenmerg weefsel is veel groter en dus is moeilijk te snijden met de hand. In deze gevallen kan het inbedden van de embryo's in laag-smeltpunt agarose en snijden met een vibratome betere resultaten. Hoewel we deze assay presenteren als een werkwijze voor beeldvorming cellen in het ontwikkelende ruggenmerg is deze benadering ook aangepast aan andere afbeelding embryonale weefsel, inclusief de sensorische placodes ^3.