Summary
敗血症は、細菌感染に起因する全身性炎症反応症候群を指し、盲腸結紮穿刺（CLP）と呼ばれる手術法によってシミュレートすることができます。ここでは、治療薬のために薬草をスクリーニングするためのCLP-誘導動物モデルを使用する方法を説明します。
Abstract
敗血症は、細菌感染に起因する全身性炎症反応症候群を指します。これは、外因性の細菌毒素（エンドトキシン）や細菌（菌）を注入するだけでなく、盲腸結紮穿刺（CLP）1-3で盲腸の手術の穿孔を含むいくつかの技術によって動物に日常的にシミュレートされています。 CLPは、穿孔性虫垂炎や憩室炎のヒト臨床疾患を模倣し、細菌の流出と腹腔の糞便汚染することができます。敗血症の重症度は、最終的な死亡率で反映されるように、盲腸穿刺2で使用する針の大きさを変化させることにより、外科的に制御することができます。人間の敗血症3の臨床経過中に観察された動物では、CLPは、心血管代謝、免疫応答と同様に、二相性の血行動態を誘導する。したがって、CLPのモデルは1-3実験的敗血症のための最も臨床的に関連するモデルの一つとして考えられている。</ P>
様々な動物モデルは、実験的敗血症の病態の根底にある複雑なメカニズムを解明するために使用されている。敗血症の致死結果は4-6と後期炎症性メディエーター（例えば、HMGB1）7（例えば、TNF、IL-1およびIFN-γなど）は初期のサイトカインの過剰な蓄積に一部起因している。初期の炎症性サイトカインと比較して、後期に作用するメディエーターは、臨床応用の広い治療のウィンドウを持っています。たとえば、CLP 後 24時間を開始するHMGB1中和抗体の遅延政権は、まだ致命的な敗血症の後期メディエーターとしてHMGB1を確立し、致死率8,9からマウスを救出。後期に作用するメディエーターとしてのHMGB1の発見は、伝統的な漢方薬を用いた敗血症治療法の開発のための調査の新しい分野を開始しました。本稿では、HMのために漢方薬をスクリーニングすることでCLP-誘発敗血症の手順を説明し、その使用治療をGB1標的。
Protocol
1。敗血症の動物モデルの確立
- マウスは、ケタミン（75 mg / kg体重、筋肉内、IM）とキシラジン（10 mg / kgを、IM）で麻酔し、仰臥位に置かれます。
- 安定した位置を確保するためにテープでマウスの足を固定します。
- betadineまたは他の皮膚の消毒剤とアルコールの3を交互にスクラブで腹部をきれいにします。その後、盲腸を露出する15ミリメートル正中切開を行います。
- 盲腸の先端から約5.0 mmの4から0絹縫合糸で、盲腸を結紮し、一度22ゲージ針で穿刺結紮盲腸切り株のスツールの押出成形を可能にする。
- 盲腸は、すぐに通常の腹腔内の位置に戻し置換されます。
- 第一吸収性縫合糸で腹部の筋肉を閉鎖し、創傷クリップまたは非吸収性縫合糸で皮膚を閉じることによって、2層の切開部位を閉じます。
- 0.5ミリリットル生理食塩水の操作を行い、単一でマウスを復活させるすぐに手術が完了した後イミペネムのSE（皮下には0.5 mg /マウス）。
- 食料と水に自由にアクセスしてクリーンなケージに戻ってマウスを返します。
- 様々な時点でポストCLPで、ハーブの抽出物または成分が腹腔内に投与される。
- 動物の生存率は2週間以上監視されています。立って困難、末期呼吸、重度の筋萎縮症と出血が止まらを示す瀕死の動物は、過剰の二酸化炭素吸入により安楽死させなければなりません。
- 循環サイトカインのレベルはこれらの研究における重要なパラメータであることに注意することが重要です。さまざまな鎮痛薬は、サイトカイン放出や活動に影響を与えることが示されているため、意図的に術後のケアに回避されている。
2。ハーブエキスの調製
- 1〜4時間（葉のために1時間、根のために4時間）にお湯（85℃）でハーブを抽出します。
- 水そうを遠心不溶性粒子を除去するluble画（3300グラム、20分、4°C）。
- ろ液を0.2μmのフィルターを介して上清画分。
- 透明な水溶性のろ液画分は、その後プレップYM-10遠心式フィルター（カタログ番号4305、Millipore）を用いて限外ろ過により分画している。
- 結果、低い（<10 kDa）と高い（> 10 kDa）の分子量分画（MWF）がマクロファージ培養物を使用してHMGB1阻害活性についてスクリーニングされています。
- 24時間後のCLPでHMGB1阻害ハーブエキスやコンポーネントの腹腔内投与は、治療効果を評価します。
3。腹腔マクロファージの単離
- チオグリコール酸培地（4％、2.0ミリリットル）を通常のマウスに腹腔内に投与されています。
- 原発性腹膜マクロファージは、前述の10と3日で収穫されています。
- マクロファージは、1を添加したDMEM培地（Gibco BRL、ニューヨーク州グランドアイランド）で前培養します。0パーセントウシ胎児血清（FBS）、2ミリモル/ Lグルタミン、1％ペニシリン。
- 接着性のマクロファージは穏やかに洗浄した後、中で培養し、細菌のエンドトキシン（リポポリサッカライド、LPS は、大腸菌0111：B4、Sigma-Aldrich）を持つ2つの時間の刺激の前に無血清OPTI-MEM I培地されています。
- LPS刺激後16時間後に、培地中のHMGB1のレベルは、ウエスタンブロット分析11によって決定されます。
- 相対バンド強度は、精製したHMGB1で生成された標準曲線を参照してHMGB1レベルを決定するためにNIHイメージ1.59ソフトウェアを使用して定量した。
4。代表的な結果
1。 CLPは、全身および局所の炎症を誘発する。
CLP手術の数時間以内に、動物は、立毛、嗜眠、拠り所、食べ物や水の摂取量の減少を含む敗血症の臨床徴候を示す。連続した全身の重度の腹膜炎を開発した動物96時間 - 感染症は通常48時間以内に死ぬ。しかしながら、年齢、性別、遺伝的背景をマッチさせた動物は、実験的敗血症の過程で識別可能な方法で手術をCLPに対応することができます。いくつかの動物が瀕死の状態（ 図1で定義されている）に近づいたかもしれないが、例えば、48時間後にCLPで、他は非瀕死の状態で残ることがあります。
循環サイトカインの包括的な調査では、瀕死の非瀕死の状態（ 図1）のマウス12との間にいくつかのサイトカインのレベルの劇的な違い（例えば、IL-6、KC、MIP-2、sTNFR1）を明らかにした。彼らの血中濃度が12から14の実験や臨床敗血症15の致命的な結果の信頼性の高い予測因子であるため、特に、これらの炎症性メディエーターが敗血症のサロゲートマーカーとして分類されている。さらに、CLPは、様々なプロと抗炎症性サイトカインおよびケモカインの局所放出を誘発した。で、例えば48時間後のCLP、サイトカイン（例えば、IL-6）およびケモカインの重要な量（KCとMIP-2）は、依然として血液だけでなく全身的に測定することができるだけでなく、局所的に腹腔洗浄液で（ 図2）。
2。 HMGB1阻害ハーブエキスやコンポーネントのスクリーニング。
マクロファージ培養物を使用して、我々は阻害エンドトキシン誘導性のHMGB1放出（ 図3）の様々なハーブエキスやコンポーネントの能力を評価することができた。を阻害するHMGB1リリースの能力に照らして、我々はさらに、動物モデル敗血症でその有効性を検討した。時点のマウスは、無気力、下痢、立毛を含む敗血症の明確な兆候を開発-実験的敗血症8 HMGB1蓄積の後期と長期動態を考えると、HMGB1の阻害剤の初回投与は、敗血症の発症後24時間を与えられた。として、図4に示すように遅延や主要な緑茶cの反復投与付ける場合、エピガロカテキン-3-ガレート（EGCG）は、敗血症の発症後24時間から始まり、かなり致命的な敗血症12からマウスを救出。経口投与する場合でも、大幅に16％から44パーセントから16の動物の生存率を増加し、致死的な敗血症からまだ救助マウスをEGCGは。これは、いくつかのハーブの成分との組み合わせ療法は敗血症の動物モデルにおいて重要な優れた保護を達成できるかどうかを判断するために重要であろう。まとめると、これらの実験データは、CLP-誘発敗血症の動物モデルを使用して画面の新規治療薬へのアプローチを検証しました。
5。代表的な結果
図1。サロゲートマーカーの循環レベルは、瀕死の状態に近づい敗血症動物で劇的に高くなっています。BALB / cマウスは、CLPによって敗血症に付し、病気の兆候の開発のために監視した。に敗血症の後期（52時間後CLP）、血液は3つの正常マウス（-CLP）、瀕死の状態に近づい3敗血症マウス、および非瀕死状態の3敗血症マウスから採取した。血清は、それぞれのグループからプールし、抗体アレイによるサイトカインプロファイルを分析した。異なるグループ間でいくつかの代理マーカーの相対的なレベルに劇的な違いに注意してください。出版社からの許可を10.1371/journal.pone.0001153.g006：土井から適応。
図2。 48時間後のCLP。Balb / Cマウスで局所および全身サイトカインおよびケモカインの検出は、CLPによって敗血症に供した、血液や腹水は、48時間後CLPで採取した。プール血清または腹腔洗浄液にいくつかのサイトカインおよびケモカインの相対レベルはサイトカイン抗体アレイによって測定し、任意の単位（AU）として表した。コントロール、血液や腹水saとしてmplesは、開腹せずに通常の健康な動物（-CLP）から得られた。
図3。ハーブの成分は、用量依存的に主要なマクロファージ培養におけるエンドトキシン誘発HMGB1放出を抑制した。プライマリマウス腹腔マクロファージをLPS存在下で、またはハーブの成分の存在（例えば、EGCG 15μM）で刺激した。 LPS刺激後16時間後に、培地中のHMGB1のレベルは、ウエスタンブロット分析により決定した。出版社からの許可を10.1371/journal.pone.0001153.g006：土井から適応。
図4。ハーブの成分は Balb / CマウスはCLPによって致命的な敗血症に供した。致命的な敗血症からマウスを救出し 、ハーブ成分（EGCG）は24で、腹腔内投与した、48、72時間は敗血症の発症を投稿してください。不定冠詞imal生存率は最大2週間モニターした。 Kaplan-Meier法は、群間の死亡率の違いを比較するために使用されていました。 * P <0.05対生理食塩水。出版社からの許可を10.1371/journal.pone.0001153.g006：土井から適応。
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Discussion
研究室では、敗血症のいくつかの動物モデルは、潜在的な新規治療法を開発するために、敗血症の病態を理解するために用いられてきた。それらの臨床的関連性は敗血症の臨床応用への動物実験の成功した変換前の議論の対象のままです。初期のサイトカインに対する中和抗体（例えば、TNF）は、菌血症/内毒素血症17,18の動物モデルでの保護であったが、実際に敗血症19の動物モデルでの生存率を悪化させる。同様に、ほとんどの抗TNF剤としては、敗血症20から22の臨床試験で有効性を示すために失敗しました。この障害は、部分的に敗血症23,24の基礎となる病原性のメカニズムの複雑さに反映しています。さらに、それはまたの選択に落とし穴に起因する可能性があります：1）可能な治療標的や薬物、2）最適な用量と薬物のタイミング、および3）非現実的な臨床転帰指標（例えば、死亡率など）25。 Danggui 26、緑茶12,16、およびDanshen 27を含む、ハーブ抽出物及び/コンポーネントをHMGB1を標的とする最近の発見は、敗血症の動物モデルを用いる臨床研究の成功例を提供しています。この分野でのさらなる調査は、自然免疫応答の調節の根底にある分子カスケードにもっと光を当てると、様々な炎症性疾患に対する治療薬の開発のための手がかりを提供します。まず実験室でCLPを確立するときに、努力は、いくつかの実験群間の生存率を比較するためにマウスの数が多い（30-40）を使用して、特に、再現性を確保するために、できるだけ迅速かつ正確に手術の手順を実行するにはなされるべきである実験。長時間作用型麻酔薬（例えば、ケタミンとキシラジンなど）の使用は、私たちは、比較的短い時間枠内でマウスの多数のCLP外科手術を完了することができ、その間に役立つ揮発性麻酔薬を使用する場合は、頻繁に発生した潜在的な投与量の差異を削除します。生存率および全身サイトカインの蓄積は、CLP手順の成功したパフォーマンスの兆候として撮影することができます。
CLPモデルを広くするため、低コスト、手術の簡素化、および広範な病理学、免疫学、生理学的な特徴づけで明らかな利点のげっ歯類で使用されています。ただし、マウスCLPモデル1-3のいくつかの制限があります。たとえば、すべての動物モデルと同様に、種の格差は穿刺せずに盲腸結紮は、マウスで人間ではなく致命的なことができるという事実によって強調表示されます。また、ためにマウスとCLPへのその後の脱水のサイズが小さい、それはサイトカイン測定用シリアル血液サンプルを得ることがしばしば困難である。これらの欠点は、部分的に大きい動物2,3,27,28にCLPモデルを確立することによって克服することができます。さらに、死亡率があることを指摘することが重要であるとげっ歯類における腹膜炎の進捗状況は、主に盲腸、パンクの数は、連結された盲腸とスツール2の粘度の総量、穿刺に使用する針のゲージに影響される便の押出量によって決定されます3。さらに、CLPの初期段階で抗生物質の投与量と頻度も死亡率に影響を与えることができます。最後に、動物源と住宅環境では、死亡率の分散に貢献することができます。
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Disclosures
AESとHWは、敗血症のための潜在的な治療薬としてのHMGB1の阻害剤（tanshinones）に関連する特許出願の共同発明者である。
Acknowledgments
この作品は、国立衛生研究所、国立一般医科学（R01GM063075）の研究所と補完代替医療のナショナルセンター（R01AT05076）からの補助金によって支えられている。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Betadine | Purdue Products L.P. | 25655-41-8 | |
| imipenem | Merck & Co., Inc. | 9882821 | |
| Ketamine HCl | Hospira Inc. | RL-0065 | |
| Xylazine | Lloyd, Inc. | 4821 | |
| Autoclip | BD Biosciences | 427631 | |
| 4-0 silk suture | Roboz Surgical Instruments Co. | SUT-15-2 | |
| Surflo I.V. Catheter | Terumo Medical Corp. | SR*OX2419CA | |
| RayBio mouse cytokine antibody array | RayBiotech, Inc. | AAM-CYT-3 | |
| Thioglycollate | BD Biosciences | 211716 |
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