Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Bioengineering

Konstruerar en tvåskiktad Hydrogel till Control ASC differentiering

doi: 10.3791/3953 Published: May 25, 2012

Summary

Detta protokoll är inriktad på användning av den inneboende förmågan hos stamceller att ta kö från den omgivande extracellulära matrisen och induceras till att differentiera till flera fenotyper. Detta sätt manuskript sträcker vår beskrivning och karakterisering av en modell som utnyttjar en tvåskiktad hydrogel, som består av PEG-fibrin och kollagen, för att samtidigt tillsammans differentiera adipos-härledda stamceller

Abstract

Naturliga polymerer genom åren har fått större betydelse på grund av sin värd biokompatibilitet och förmåga att samverka med celler in vitro och in vivo. Ett forskningsområde som håller löftet i regenerativ medicin är kombinatoriska användning av nya biomaterial och stamceller. En grundläggande strategi inom tissue engineering är användningen av tredimensionella ställning (t.ex. decellulariseras extracellulär matris, hydrogeler, mikro / nano partiklar) för att styra cellernas funktion. Denna teknik har utvecklats från upptäckten att celler behöver ett substrat på vilket de kan ansluta sig, föröka, och uttrycka sin differentierade cellulära fenotyp och funktion 2-3. Mer nyligen har det också konstaterats att cellerna inte bara använda dessa substrat för vidhäftning, utan även interagera och ta signaler från matrisen substratet (t.ex. extracellulära matrisen, ECM) 4. Därför är de celler och ställningar har en ömsesidig anslutning somtjänar till att kontrollera vävnad utveckling, organisation och Ultimate funktion. Fett-härledda stamceller (DSKer) är mesenkymal, icke-hematopoetiska stamceller som finns i fettvävnad som kan uppvisa flera härstamning differentiering och fungera som en lättillgänglig källa av celler (dvs pre-vaskulära endotel och pericyter). Vår hypotes är att adipos-härledda stamceller kan riktas mot olika fenotyper samtidigt genom att helt enkelt sam-odling av dem i tvåskiktade matriser 1. Vårt laboratorium är inriktad på dermal sårläkning. För detta ändamål har vi skapat en enda sammansatt matris från de naturliga biomaterial, fibrin, kollagen och kitosan som kan efterlikna de egenskaper och funktioner hos en dermal-specifik sårläkning ECM miljö.

Protocol

1. Isolering Adipose-härledda stamceller (DSKer) 1, 5

Notera: Alla förfaranden genomfördes vid rumstemperatur om inget annat anges.

  1. Isolera råtta perirenalt och epididymalt fett-och tvätta med steril Hanks buffrade saltlösning (HBSS) innehållande 1% fetalt bovint serum (FBS) som tidigare beskrivits 5. Denna studie har genomförts i enlighet med djurskyddslagen, de tillämpningsföreskrifter Animal Regulations Welfare och i enlighet med principerna i Guide för vård och användning av försöksdjur.
  2. Färs vävnaden och överföra 1-2 g i 25 ml HBSS innehållande 1% FBS i en 50-ml rör och centrifugera vid 500 g under 8 min vid rumstemperatur.
  3. Uppsamla det fritt flytande skikt fettvävnad och överför till 125-ml Erlenmeyer-kolv och behandlades med 25 ml kollagenas av typ II (200 U / ml) i HBSS under 45 min vid 37 ° C på en orbital skakanordning (125 rpm). Ta försiktigt bort den flytande fraktionen (under olja och fett lager) med pipettering och filtrera den sekventiellt genom en 100 - pm och 70 - m nylonnät filter. Centrifugera extraktet i 500 g under 10 min vid rumstemperatur, aspirera supernatanten och tvätta pelleten två gånger med 25 ml HBSS.
  4. Resuspendera cellpelleten i 50 ml tillväxtmedium (MesenPRO RS Basal Medium) kompletterat med MesenPRO RS tillväxtsupplement, antibiotikum-antimykotikum (100 U / ml penicillin G, 100 ug / ml streptomycinsulfat och 0,25 | ig / ml amfotericin B), och 2 mM L-glutamin och celler pipettspetsar i två T75-kolvar (25 ml / kolv).
  5. Kultur av ASC i en 5% CO2-fuktad inkubator vid 37 ° C (passagen 2-4 ASC: er används för alla experiment).

2. Förberedelse kitosanmikrosfärer (CSM)

Notera: Alla förfaranden genomfördes vid rumstemperatur om inget annat anges.

    5. Emulgera en vattenhaltig lösning av kitosan (6 ml 3% vikt / volym kitosan i 0,5 M ättiksyra) i en 100 ml av en oljefas bestående av sojaolja, n-oktanol (1:2 volym / volym) och 5 % sorbitan-mono-oleat (Spän 80) emulgeringsmedel, med användning av överliggande (1700 rpm) och magnetisk omrörning (1000 rpm) samtidigt i motsatta riktningar. Detta dubbla metod för att blanda säkerställer att miceller bildas tidigt innan tvärbindning sker kan förbli i lösning och inte för att sedimentera till botten. Dessutom magnetomrörare stöd i de-aggregering kitosan under micellbildning och rigidization.
  1. Rör om i blandningen omrördes kontinuerligt under ca 1 timme tills en stabil vatten-i-olja-emulsion erhålles. Initiera jonisk tvärbindning med tillsats av 1,5 ml av 1% vikt / volym kaliumhydroxid i n-oktanol var 15 min under 4 timmar (24 ml totalt)
  2. Torka de återvunna sfärerna i en vakuumexsickator och analysera utan vidare bearbetning. Du kan bestämma den genomsnittliga storleken CSM partikel, yta per milligram, och enheten Kubikvolymen med hjälp av en analysator partikelstorlek.
  3. För efterföljande experiment, tvätta CSM tre gånger med sterilt vatten för att avlägsna kvarvarande salter och sterilisera genom tvättning över natten med 5 ml absolut etanol.

3. BestämningTal fria aminogrupper i CSM

Notera: Alla förfaranden genomfördes vid rumstemperatur om inget annat anges.

  1. Bestäm antalet fria aminogrupper närvarande i säkerhetsmetoder efter jonisk tvärbindning med hjälp av trinitro bensen (TNBS) syra analys av Bubnis och Ofner 6. Inkubera 5 mg mikrosfärer med 1 mL av 0,5% TNBS-lösning i en 50-ml glasrör under 4 h vid 40 ° C och hydrolyseras med tillsats av 3 mL av 6N HCl vid 60 ° C under 2 timmar.
  2. Kyla proven till rumstemperatur och extrahera de fria TNBS genom tillsats av 5 ml avjoniserat vatten och 10 ml etyleter.
  3. Värm en 5-ml alikvot av den vattenhaltiga fasen till 40 ° C i ett vattenbad under 15 min för att förånga eventuell kvarvarande eter, kyl till rumstemperatur och späd med 15 ml vatten.
  4. Mät absorbansen vid 345 nm med en spektrofotometer med användning av TNBS-lösning utan kitosan som blank och kitosan som används för CSM persättning för att bestämma det totala antalet aminogrupper. Uppskatta antalet fria aminogrupper av CSM i förhållande till kitosan.

4. Laddar ASC i CSM

Notera: Alla förfaranden genomfördes vid rumstemperatur om inget annat anges.

  1. Jämvikta 5 mg steriliserade CSM från sektionen 2,5 i steril HBSS över natten och tillsätt till en 8 - ^ m porstorlek odlingsplatta insatsen (24-brunnsplatta).
  2. Efter att de har CSM fast på membranet, noggrant aspireras HBSS och tillsätt 300 | il tillväxtmedium till insidan av insatsen och 700 | il av odlingsmediet till utsidan av insatsen.
  3. Återsuspendera DSKer på lämplig koncentration (1 × 10 4 till 4 × 10 4) i 200 pl odlingsmedium och utsäde över CSM innanför odlingsplattan insatsen. Den slutliga volymen av mediet i odlingsinsatsen, efter ympning, är 500 | il.
  4. Incubåt ASC ympade på CSM i 24 timmar i en 5% CO2 fuktad inkubator vid 37 ° C.

5. Fastställande av Andel ASC Lastning och cellviabilitet i säkerhetsmetoder

Notera: Alla förfaranden genomfördes vid rumstemperatur om inget annat anges.

  1. Efter inkubation pipett ASC-laddade CSM i en steril 1,5-ml mikrocentrifugrör utan att störa de celler som har migrerat in i insatsen membranet.
  2. Avlägsna återstående mediet och tillsätt 250 | il färskt tillväxtmedium till röret.
  3. Till varje rör, tillsätt 25 pl av MTT [3 - (4,5-dimethylthiozole-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid]-lösning (5 mg / ml) och inkubera under 4 h i en 5% CO2 fuktad inkubator vid 37 ° C.
  4. Efter inkubation, avlägsna mediet, tillsätt 250 | il dimetylsulfoxid, och virveln i blandningen under 2-5 minuter för att solubilisera formazan-komplexet.
  5. Centrifugera CSM vid 2700 gunder 5 min, pipett av vätskan och bestämma dess våglängd absorbans vid 570 nm och 630 nm med användning av standard-plattläsare, enligt MTT tillverkarens specifikationer.
  6. Bestäm cellen som är associerat med de gemensamma säkerhetsmetoderna i förhållande till de värden som erhölls från definierade ASC siffror odlade för att utveckla en standard kurva.

6. Beredning och karakterisering av ASC-CSM inbäddade i PEG-fibringeler

Notera: Alla förfaranden genomfördes vid rumstemperatur om inget annat anges.

  1. Polyetylenglykol (PEG) fibrin (PEG-fibrin) hydrogel framställd genom Suggs et al 7 genom upplösning av den succinimidylglutarat modifierade polyetylenglykol (PEG; 3400 Da). Med användning av 4 ml tris-buffrad saltlösning (TBS, pH 7,8) och filtersterilisera med en 0,22-im filter strax innan experimentet. Löst PEG är endast effektivt i denna ansökan under de första 3-4 timmarna.
  2. Blanda 500 &mu, l av fibrinogen lager (40 mg / ml i TBS, pH 7,8) och 250 pl PEG lager i en odlingsbrunn av en 6-brunnars platta och inkubera under 20 minuter i en 5% CO2 fuktad inkubator vid 37 ° C. Denna blandning utgör en molär koncentration av 1:10, SG-PEG-SG: fibrinogen.
  3. Ta 250 | il av ASC-CSM vid en koncentration av 5 mg av CSM, (≈ 2 x 10 4-celler) och blanda med det PEGylerade fibrinogenlösning.
  4. Tillsätt omedelbart 1 ml trombin lager (25U/mL) och snabbt triturera en eller två gånger med pipett. Efter blandning av trombin med PEG-fibrinogen, omedelbart placera den cell-gelblandningen i en 12-brunnsplatta och inkuberades i en 5% CO2 fuktad inkubator vid 37 ° C under 10 minuter för att medge fullständig gelning. Eftersom gelningstiden är snabb, försök inte och håll gellösningen inom pipettspetsen mer än 5 sekunder. Det PEGylerade fibrinogen klyvs av trombin och bildar en PEGylerad fibrin hydrogel. Som sådan, ee slutliga gelén produkten benämnes PEG-fibrin.
  5. Tvätta de PEG-fibringeler två gånger med HBSS och inkuberades med alfa minimala essentiella medium (α-MEM) kompletterat med 10% FBS i en 5% CO2 fuktad inkubator vid 37 ° C.
  6. Observera migration av celler från CSM in i gelén under en 11-dagars period med användning av standardtekniker Ijusmikroskopi.

7. Beredning och karakterisering av ASC-CSM Inbäddat i kollagengeler

Notera: Alla förfaranden genomfördes vid rumstemperatur om inget annat anges.

  1. Blandning ASC-CSM (5 mg innehållande ≈ 2 x 10 4-celler) med typ 1 kollagen (7,5 mg / ml) extraherades från råttsvanssenor enligt metoden av Bomstein 8 och fibrillera efter justering av pH till 6,8 med användning av 2N NaOH.
  2. Tillsätt den fibrillerade kollagen-ASC-CSM blandningen till en 12-brunnars platta och inkubera under 30 min i en 5% CO2 humidierad inkubator vid 37 ° C.
  3. Efter fullständig fibrillering, inkubera de kollagen-ASC-CSM geler under upp till 11 dagar i en 5% CO2 fuktad inkubator vid 37 ° C.
  4. Observera migration av celler från CSM in i gelén under en 11-dagars period med användning av standardtekniker mikroskopitekniker.

8. Utveckling av tvåskiktade PEG-fibrin-(ASC-CSM)-kollagengel konstruktioner

Notera: Alla förfaranden genomfördes vid rumstemperatur om inget annat anges.

  1. Att utveckla dubbelskiktet konstruera, framställa både kollagen och de PEG-fibringeler, såsom beskrivits ovan, med små modifieringar. I korthet, att studera flyttfåglar och samarbete induktion egenskaper hos en enda källa för stamceller med två bioscaffolds, "sandwich" ASC-säkerhetsmetoder mellan kollagen och PEG-fibrin ställningar med hjälp av en process i fyra steg: 1) Ladda ASC på CSM, 2) kasta fibrillerade kollagengel och lager ASC-CSM pärlor över collagen gel, 3) gjutna PEG-fibringelen över ASC-CSM-kollagengel och tillåta gelén stelna, och 4) lägga medium till brunnen och infoga att studera celler in vitro eller bort från insatsen för tillämpningar in vivo (se figur 1 ).
  2. Framställ en 1-ml typ 1 kollagen (7,5 mg / ml)-blandning såsom beskrivits ovan i 7,1, utan tillsats av ASC-CSM till blandningen. Placera blandningen i en 6-brunnars vävnadsodlingsplatta insatsen (8-im porstorlek) och inkubera under 30 min i en 5% CO2 fuktad inkubator vid 37 ° C.
  3. Efter fullständig flimmer skikt över kollagen ytan 5 mg ASC-CSM (10, 000 celler / mg) suspenderades i odlingsmedium (200 | il). Efter att mikrosfärerna har lagt sig över gelén, framställa PEG-fibringelen såsom beskrivits i avsnitt 6.0, utan tillsats av ASC-CSM till blandningen, och skiktet av PEGylerat fibrinogen / trombin-lösning under de ASC-CSM-koUagenskikten. Vid beredning av den PEG-fibringelen, använda 250 | il av cellkultur-medium i stället för than 250 | il medium innehållande cellerna.
  4. När de är färdiga, inkubera de konstruktioner för 30 min i en 5% CO2 fuktad inkubator för att uppnå fullständig gelning före matning av konstruktionen med odlingsmedium.
  5. Efter fullständig gelning, plats 1 ml av mediet i den övre kammaren under konstruktionen och 3 ml av mediet i den nedre kammaren.

9. Framställning Stamlösningar

Notera: Alla förfaranden genomfördes vid rumstemperatur om inget annat anges.

  • Kalciumklorid lager (40 mM): Använd endast CaCb 2 .2 H 2 O. Upplösa 588,4 mg CaCl2 0,2 H2O med 100 ml avjoniserat vatten. Sterilisera med användning av en 0,22 ^ m filter.
  • Polyetylenglykol: PEG är mycket reaktiv med syre och kan bli oxideras vid exponering för rumsluft. Som sådan bör PEG lagras under kväve (N2) atmosfär. Accurately väger 32 mg i en 2-ml centrifugrör (se till att rensa rören med N 2 innan användning) och förvara vid -80 ° C tills klar för användning. Lös 32 mg av PEG i 4 ml av TBS-lösning före användning.
    Följande lösningar måste göras nytt före varje experiment.
  • TBS-lösning: (pH 7,75-7,77 vid 25 ° C, pH vid 25 ° C är mycket kritisk). För att bereda 15 ml TBS-lösning, noggrant upplösa en buffert tablett i filtersteriliserad avjoniserat vatten och justera till önskat pH. Förvara inte stamlösningen-förbereda den fräsch varje gång.
  • Fibrinogenlösning (40 mg / ml). Upplösa fibrinogen pulver i TBS för att göra fibrinogenkoncentration 40 mg / ml. Lösa upp den över natten med användning av en magnetomrörare vid 4 ° C. Det är lättare att lösa upp hela 1-g kvantitet med den erforderliga mängden av TBS. Följande dag avlägsna fibrinogen från 4 ° C (vanligen grumliga) och låt denvärmas i ett vattenbad tills en homogen lösning erhålles. Slutligen filtersterilisera fibrinogen med användning av en 0,45 ^ m filter.
  • Trombinlösning (25 enheter / ml): För att göra det trombin-lösning, väg upp den erforderliga mängden och lös upp med den preparerade 40 mM CaCl2 0,2 H 2 O Det är alltid en god vana att använda hela flaskan med trombin för att göra beståndet. Exempel: Lös en flaska 5 kU trombin med 200 mM CaCl2 0,2 H2O, alikvoten och lagra vid -20 ° C.

10. Representativa resultat

Det övergripande målet för tekniken presenteras här är att visa potentialen i samtidiga matrix-driven differentiering av ASC i flera fenotyper med CSM som en leverans fordon. Vi visar en in vitro-strategi för att skapa stamceller från CSM till en tvåskiktad kollagen-PEG-fibrin byggnadsställning. Karakterisering av ASC inbäddade i denna ställning revealeD som ASC-laddade säkerhetsmetoder kan "inklämt" mellan ett lager av kollagen och PEG-fibrin samtidigt och differentiellt tar cue från båda extracellulära miljöer för att utvecklas i sina nya förhållanden. Vi kännetecknas först förmågan för modellsystem för att bibehålla cellviabiliteten och flyttande kapacitet. Kollagen uppburen av förmågan hos ASC: er för att bibehålla sin "stemness", såsom visades genom deras expression av Strö-1 och deras fibroblastliknande morfologi (fig. 2D och 2F). I motsats härtill inducerade PEG-fibrin de ASC: er för att differentiera mot en vaskulär fenotyp, vilket framgår av deras rörliknande struktur morfologi, deras endotelcell-specifik expression av von Willebrand-faktor (figur 2E och 2G) och pericyt-specifik expression av NG2 och blodplättshärledd tillväxtfaktor-receptor-beta (PDGFRβ) (data visas ej). Dessutom verkade dessa observerade fenotyper uppstå tidigt i kultur och bibehölls under 11 dagar, vilket är markonstrated i figur 3.

Tabeller och figurer

Fördelar med två skikt Construct:

  • Ställningen ensam utan celler kan fungera som en bioaktiv ställningen.
  • PEG-fibrin kan inducera stamceller att differentiera utan tillsats av tillväxtfaktorer.
  • Kollagen kan hjälpa till att bibehålla den fenotyp stamcell av ASC: er.
  • En dubbelskiktet konstrukt kan användas som en aktiv sub-strat för andra celltyper för att migrera och proliferera (t.ex. endotelceller, fibroblaster, keratinocyter, glatta muskelceller och pericyter).
  • Den kan användas med hård-vävnadstekniska byggnadsställningar som hydroxyaptite eller demineraliserat ben att regenerera hård och mjuk vävnad.
  • Den kan användas för att utveckla en flerskiktad, varierande vävnadskonstruerat konstruktionen (såsom dermala-vaskulär, vaskulär-epitelial, dermal-vaskulär-hypodermal, etc).
  • Den använder en encellig källa för att samtidigt ta framflercelliga fack.
  • Den har potential att integrera med värdvävnaden eftersom det är av naturligt ursprung.
  • CSM i gelén konstruktionen ger en plattform för celler att migrera från.
  • Kitosan, som används för framställning CSM är en välkänd aktiv kemo-attraherande.
  • Det övergripande konceptet tillämpas i detta protokoll för "matrix-driven stamcell differentiering" kan tillämpas på andra stamceller typer. Dock ytterligare utredning motiverat att fastställa genomförbarheten av matris-driven differentiering. Den tvåskiktade gelén byggnadsställning kan fungera som en reservoar för att leverera cellerna i en fördröjd och kontrollerat sätt.
  • Efter rekonstruktion kan gelerna fortfarande separeras i individuella komponenter.

Figur 1
Figur 1. Schema som avbildar det övergripande målet och förfarandet enligt tekniken. 1) Adipose-härledda stamceller (DSKer) är loaded på kitosan-mikrosfärer. 2) Kollagen hälls sedan i en 6-brunnars insatsen, pH justerades till fibrillera kollagen, och insatsen placeras i en 6-brunnsplatta kammaren. ASC-laddade CSM sfärer sedan skiktas över kollagen. 3) Det PEGylerade fibrinogen hälls sedan över kollagen (ASC-CSM) och gelas genom tillsats av trombin. 4) Den slutliga dubbelskiktet konstruktionen kan sedan avlägsnas från odlingsinsatsen och användes för in vitro eller in vivo-analys.

Figur 2
Figur 2. Karakterisering av ASC odlas inom kollagen och PEG-fibrin 3D matriser. A) faskontrastmikrofoto av isolerade ASC passerades och underhålls med rutinmässiga 2-dimensionella cellodling tekniker. Mikrofotografier B, D och F visar ASC-CSM odlades i en 3-dimensionell kollagengel; medan C, E och G visar ASC-CSM odlades i en 3-dimensionell PEG-fibringelen, både på dag 12. I B och C) är DSKer visas flyttar bort från CSM sfären i båda byggnadsställning typer. ASC: er verkar ha en tillplattad, spindel-liknande morfologi i kollagen (B), med bibehållet uttryck av stamceller markör Strö-1 (D; pil). När den odlas i PEG-fibrin ASC: er uppvisar fler rörliknande strukturer och induceras för att uttrycka sådana vaskulära cellmarkörer såsom von Willebrand-faktor (E). Transmissionselektronmikroskopi visar typiska morfologi framgår av DSKer inom varje schavotten. ASC: er i kollagengel förefaller ha mindre filopodia (fl) som sträcker sig från kroppen av cellen (F), medan ASC: er typiskt bildade lumenala (märkt L) strukturer (G, pil).

Figur 3
Figur 3. Morfologisk analys av ASC-CSM mellan dubbelskikten av kollagen och PEG-fibringeler. ASC-CSM var "sandwich" mellan kollagen och PEG-fibringeler och hölls i odling under 11 dagar. Vänster column skildrar DSKer migrerar och förökar sig inuti kollagenmatrisen och tycks ta på sig en spindel-liknande morfologi. Den högra kolumnen visar ASC: er som migrerar bort från CSM och bildar rörliknande strukturer hela PEG-fibringelen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

DSKer är väl kända för sin lätthet av isolering och förmåga att differentiera mot olika celltyper. Med de tekniker som beskrivs i detta manuskript kan vi att utnyttja plasticitet av ASC: er genom att exponera dessa celler till flera biomatrices samtidigt. Som celler migrera bort från sin CSM bas och ange sitt omgivande extracellulära miljön, cellerna tar kö från ställningen och kan antingen behålla "stemness" (kollagen) eller induceras att differentiera mot vaskulära-och vaskulär-stödjande celltyper (fibrin). Eftersom vårt labb är intresserad i hud och mjukdelar sårläkning, genomförde vi strategiskt ett dubbellager av kollagen och fibrin sedan kollagen stödjer huden och epidermal regeneration av värden, medan fibrin naturligt inducerar vaskulär nätverksbildning 9. Vidare är det nu inses att överhörning sker mellan prolifererande hud keratinocyter, fibroblaster, och det underliggande vaskulära nätverket, och detta komplexMekanismen är mycket avgörande för korrekt sårläkning 10. Utan en bakomliggande vaskulära nätverket, vävnadskonstruerat hudtransplantat har svårt inosculating med värdvävnad. Därför är vårt övergripande hypotes att kollagen och fibrin, när den används som en tvåskiktsmembran i kombination med DSKer kommer att minska tider sårläkning genom att förbättra ett eller flera steg av blodkärl, dermal och återepitelisering processer.

Fibrin är ett mångsidigt biopolymer som bildas efter trombin-medierad klyvning av fibrinopeptid A härledd från monomera fibrinogen. Fibrin har använts kliniskt som ett hemostatiskt medel (godkänts av US Food and Drug Administration) och som en tätning i en mångfald kliniska tillämpningar, inklusive förfaranden såsom mjuk vävnad dissektion. Fibrin hydrogeler från kommersiellt renat allogena fibrinogen och trombin har använts i stor utsträckning under det senaste decenniet i en rad olika vävnads-tekniska tillämpningar. Men vissa stora nackdelar in användning av en fibrin-hydrogel kan vara 1) potentialen för ställningen för att krympa, 2) låg mekanisk styvhet, och 3) snabb nedbrytning innan korrekt bildning av vävnadstyp byggnadskonstruktioner. För att övervinna dessa problem, måste fibrin som skall modifieras före användning för att tjäna som en bättre tredimensionell vävnadsteknik byggnadsställning. Ett sådant tillvägagångssätt är att sampolymerisera den fibrin med polyetylenglykol (PEG-Fibrin). Våra preliminära arbete har visat flera unika funktioner i PEG-fibrin som gör det fördelaktigt sårläkning jämfört med andra hydrogelförband, inklusive omodifierade fibrin. Pegylerat fibrin uppvisar unika egenskaper av både syntetiska hydrogeler och naturliga material. Specifikt tillhandahåller närvaron av PEG en hög grad hydratiserad (> 90% vatten) fuktig miljö för att hantera utsöndringar. För det andra ger närvaron av fibrin bionedbrytbarhet till materialet, men tidigare resultat visar att PEG-ylerade fibrin är signifikant mer stabila in vitro än icke-pegylerat fibrin

Den andra komponenten i vår dubbelskiktet är kollagen. Kollagen är en naturlig biomaterialet överallt uttryckt i däggdjur och tjänar som en direkt bindningsställe för olika typer av celler. Olika vävnader uttrycker olika typer av kollagen (typ 1-type29), beroende på typen av funktionell behov av vävnaden. Andra inneboende egenskaper av kollagen som gör det mycket attraktivt i vår modell är att 1) ​​den är icke-inflammatoriska, 2) både hela och vid reducerad komponenterna i kollagen är biokompatibla, 3) det är en mycket porös hydrogel, 4) den stödjer cellinfiltration och migration, 5) den upprätthåller multipotens av stamceller, 6) är det avstämbara genom att modulera formulering, och 7) den lätt inosculates med värd vävnad. För våra studier i hud och mjukdelar regenerering, är en dubbellager komposit som består av kollagen ett naturligt val eftersomDet är i hög grad uttryckt i hela huden, innefattande djupa dermala regioner, och kan användas som en markör immunohistokemi för att bedöma djup av ett sår.

I detta protokoll visar vi en teknik för att samtidigt behålla "stemness" av DSKer samtidigt differentiera DSKer mot olika vaskulära celltyper. För studien av hud och det underliggande mjuka vävnaden, kollagen och PEG-fibrin är direkt tillämpliga. Emellertid kan andra bioscaffold material genomföras för att studera deras utforskade unika förmåga att framkalla ASC till andra celltyper. Tekniken implementeras här hjälper till att lyfta fram betydelsen av den extracellulära matrisen för att kontrollera fenotyper stamceller och ger tilltro till utforskningen av skiktade kompositer för hud föryngring.

Sammanfattning

Kritiska steg

  • Kollagen bör justeras till rätt isoelektriska pH (6,8-7.1) att inducera flimmer och få en stabil gel structure.
  • PEG bör beredas före blandning med fibrinogenlösning sedan hållbarhetstid vattenhaltig PEG är kort (4-5 timmar).
  • Inkubationstid av fibrinogen-PEG-blandningen bör inte överstiga 25 minuter (vid 37 ° C), eftersom över-inkubering kan orsaka en grumlig opak fällning under gelning.
  • Efter tillsats av trombin till det PEGylerade fibrinogenlösning, bör blandningen dispenseras till kulturen skär omedelbart (efter försiktig blandning med en pipett). Håll lösningen blandningen i pipettspetsen under en längre tid (> 30 sek) kan orsaka gelning i pipettspetsen och svårigheter att få jämnt strömmade geler.
  • Använda enhetligt stora mikrosfärer och jämnt fördelade celler över CSM sängen är avgörande för optimal cellbelastning. CSM storlek variation i diameter påverkar direkt tillgängliga ytarean för cellbindning per milligram mikrosfärer, under det att jämnt fördelade ASC-CSM direkt påverkar cell migration in tHan ställningar. Cellen mikrosfärer (ASC-CSM) bör fördelas jämnt på toppen av kollagengel för att säkerställa jämn migrering av ASC: er inom ställningen. Om fördelningen av ASC-CSM är alltför tät, kan den cellmigration in koncentrerades till ett speciellt område inom gelerna och kan begränsa cell-cell-interaktion efter migrering.
  • Säkerställa att volymen av mediet tillsattes till den yttre brunn i cellkultur insatsen är större än menisken hos det inre brunn. Typiskt en inre: är den yttre volymförhållande av 1:2 är lämpligt, eftersom detta underlättar celler fästa till mikrosfärerna.

Begränsningar

  • Denna metod är begränsad till den totala ytarean som finns tillgänglig på mikrosfärerna. Om en högre cellantal önskas, är mer mikrosfärer behövs för att öka ytarean.
  • Eftersom cellerna är avsedda att migrera från mikrosfärer, kan en tidsfördröjning observeras för det ursprungliga migration av celler på och inom geler.
  • Mikrosfärerna är i gränssnittet mellan två geler (kollagen och PEG-fibrin), och detta kan begränsa / ta längre tid för migration av celler till distala ändarna av gelerna.
  • Under konstruktionen av dubbelskiktet har PEGylerat fibrinogen-trombin blandning som skall tillsättas snabbt över en CSM-ASC bädd ovanpå kollagen. Detta kan orsaka ojämn omfördelning av ASC-gemensamma säkerhetsmetoder. I fall av ojämn omfördelning av ASC-CSM vid gränsytan under PEG-fibringelen gjutning, kan gelén konstruktionen långsamt omröres manuellt för att snabbt fördela mikrosfärerna före fullständig gelning.
  • Denna metod är begränsad till celler som har flyttande egenskaper och kan inte vara lämpad för att leverera förankringsoberoende celltyper.
  • Kollagenlösningen före fibrillering förblir i surt pH och begränsar direkt blandning av celler inuti kollagengeler. Som sådan, om inte justeras inom en rimlig tidsram (~ 30 min), kan cellviabiliteten äventyras.
  • Eftersom gels används i denna konstruktion är individuellt skiktade, en möjlig störning eller separation av gelerna kan inträffa under hanteringsprocessen. Således kan begränsa lätthet vid hantering under in vivo-studier.

Eventuella ändringar

  • ASC-CSM kan fördelas jämnt inom de enskilda gelerna istället för skiktning dem på gränssnittet.
  • DSKer kan vara direkt blandas inom enskilda geler snarare än att leverera av CSM, men detta kan begränsa utvecklingen av högt organiserade cell mönstrade-vävnad konstruktioner.
  • För att undvika ojämn omfördelning av ASC-CSM under PEG-fibrin gjutning, kan nämnda ASC-CSM vara suspenderade i en liten volym av vattenhaltig kitosanlösning (1% vikt / volym) och fördelas jämnt över kollagengeler. Detta kommer att säkerställa stadig fastsättning av ASC-CSM över kollagengelen skiktet och kommer att förhindra lösgöring av ASC-CSM från kollagen yta.
  • Konstruktionen i sig kan utnyttjas på ett inverterat sätt, dvs PEG-fibrin geler kan gjutas först och ASC-CSM kan vara utsädet på toppen av PEG-fibringeler följt av kollagengeler. Därvid tillåter användaren att gjuta den fibrillerade kollagenlösningen över (ASC-CSM)-PEG-fibrin skiktet mer försiktigt eftersom, till skillnad från PEG-fibringeler, kräver fibrillerad Kollagenlösningen extra tid (30 minuter) för att stelna. Genom att anta denna process kan man se att bibehålla en jämn fördelning av ASC-CSM.
  • Gelerna (kollagen och / eller PEG-fibringeler) kan införlivas med mitogener, tillväxtfaktorer (t ex vaskulär endotelial tillväxtfaktor, fibroblasttillväxtfaktorer), för att inducera snabbare cell-migration och-proliferation.

Felsökning

  • Under fibrillering av kollagenlösningen, om pH-värdet överstiger det isoelektriska pH> 7,2, bör pH omjusteras genom att antingen tillsätta mer lösningen kollagen lager, sänkning av pH med användning av svag sur lösning.
  • Vid beredning av den CSM, om en stor variation i storlek yrkesrs, då ett antal parametrar kan justeras för att ge önskad CSM storlek (viskositet av kitosan stamlösning, volym ytaktivt medel, omrörning hastighet, etc).
  • Vid långsam cellmigration då fylla de geler, kan ett större antal ASC-säkerhetsmetoder användas för att öka antalet celler migrerar ut från CSM till geler.
  • Processen av PEG-fibrinogen gelning kan fördröjas genom att skära den mängd trombin sattes till blandningen (typiskt 900 | il i stället för 1 ml) eller framställning av en lägre koncentration lager av trombin (20 U / ml i stället för 25 U / ml) . Detta gör långsammare gelningen av PEG-fibrinogen blandningen och därmed ger extra tid för försiktig gjutning av pegylerat fibrinogen och trombin blandningen över ASC-gemensamma säkerhetsmetoder.
  • Under inkubation, om en fasseparation inträffar (mellan kollagen och fibrin gel), kan en steril Teflon O-ringen placeras på toppen konstruktionen för att säkerställa fastsättning av gel faser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Inga konkurrerande finansiella intressen finns.

Disclaimers

De åsikter eller påståenden som finns här är de privata åsikter författarnas egna och skall inte tolkas som officiella eller reflekterande synpunkter från Department of Defense och den amerikanska regeringen. Författarna är anställda av den amerikanska regeringen, och detta arbete framställdes som en del av deras officiella plikter. Allt arbete fick stöd av den amerikanska armén medicinsk forskning och materiel Command. Denna studie utfördes under ett protokoll granskas och godkännas av den amerikanska armén medicinsk forskning och Materielverk Institutional Review Board och i enlighet med den godkända protokollet.

Acknowledgments

SN fick stöd av postdoktorsstipendium Grant från Pittsburgh Tissue Engineering Initiative. Doz stöds av ett bidrag som beviljats ​​från The Geneva Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) GIBCO, by Life Technologies 14175 Consumable
Fetal Bovine Serum Hyclone SH30071.03 Consumable
Collagenase Type II Sigma-Aldrich C6685 Consumable
70-μm Nylon Mesh Filter BD Biosciences 352350 Consumable
100-μm Nylon Mesh Filter BD Biosciences 352360 Consumable
MesenPRO Growth Medium System Invitrogen 12746-012 Consumable
L-Glutamine GIBCO, by Life Technologies 25030 Consumable
CaCl2.2H2O Sigma-Aldrich C8106 Consumable
T75 Tissue Culture Flask BD Biosciences 137787 Consumable
Chitosan Sigma-Aldrich 448869 Consumable
Acetic Acid Sigma-Aldrich 320099 Consumable
N-Octanol Acros Organics 150630025 Consumable
Sorbitan-Mono-Oleate Sigma-Aldrich S6760 Consumable
Potassium Hydroxide Sigma-Aldrich P1767 Consumable
Acetone Fisher Scientific L-4859 Consumable
Ethanol Sigma-Aldrich 270741 Consumable
Trinitro Benzenesulfonic Acid Sigma-Aldrich P2297 Consumable
Hydrochloric Acid Sigma-Aldrich 320331 Consumable
Ethyl Ether Sigma-Aldrich 472-484 Consumable
8-μm Tissue Culture Plate Inserts BD Biosciences 353097 Consumable
1.5-ml Microcentrifuge Tubes Fisher Scientific 05-408-129 Consumable
MTT Reagent Invitrogen M6494 Consumable
Dimethyl Sulfoxide Sigma-Aldrich D8779 Consumable
Qtracker Cell Labeling Kit(Q Tracker 655) Molecular Probes, Life Technologies Q2502PMP Consumable
Type 1 Collagen Travigen 3447-020-01 Consumable
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich S8045 Consumable
12-Well Tissue Culture Plates BD Biosciences 353043 Consumable
Fibrinogen Sigma-Aldrich F3879 Consumable
Thrombin Sigma-Aldrich T6884 Consumable
Benztriazole Derivative of Polyethylene Sunbio DE-034GS Consumable
Tris Buffer Tablet (pH 7.6) Sigma-Aldrich T5030 Consumable
Centrifuge Eppendorf 5417R Equipment
Orbital Shaker New Brunswick Scienctific C24 Equipment
Humidified Incubator with Air-5% CO2 Thermo Fisher Scientific, Inc. Model 370 Equipment
Overhead Stirrer IKA Visc6000 Equipment
Magnetic Stirrer Corning PC-210 Equipment
Vacuum Desiccator - - Equipment
Particle Size Analyzer Malvern Instruments STP2000 Spraytec Equipment
Water Bath Fisher Scientific Isotemp210 Equipment
Spectrophotometer Beckman Coulter Inc. Beckman Coulter DU 800UV/Visible Spectrophotometer Equipment
Vortex Diagger 3030a Equipment
Microplate Reader Molecular Devices SpectraMax M2 Equipment
Light/Fluorescence Microscope Olympus Corporation IX71 Equipment
Confocal Microscope Olympus Corporation FV-500 Laser Scanning Confocal Microscope Equipment
Scanning Electron Microscope Carl Zeiss, Inc. Leo 435 VP Equipment
Transmission Electron Microscope JEOL JEOL 1230 Equipment

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Natesan, S. A bilayer construct controls adipose-derived stem cell differentiation into endothelial cells and pericytes without growth factor stimulation. Tissue Eng. Part A. 17, 941-953 (2011).
  2. Nuttelman, C. R., Tripodi, M. C., Anseth, K. S. Synthetic hydrogel niches that promote hMSC viability. Matrix Biol. 24, 208-218 (2005).
  3. Benoit, D. S. Integrin-linked kinase production prevents anoikis in human mesenchymal stem cells. J Biomed Mater Res A. 81, 259-268 (2007).
  4. Willerth, S. M., Sakiyama-Elbert, S. E. Combining stem cells and biomaterial scaffolds for constructing tissues and cell delivery. (2008).
  5. Natesan, S. Adipose-derived stem cell delivery into collagen gels using chitosan microspheres. Tissue Eng. Part A. 16, 1369-1384 (2010).
  6. Bubnis, W. A., Ofner, M. C. 3rd The determination of epsilon-amino groups in soluble and poorly soluble proteinaceous materials by a spectrophotometric method using trinitrobenzenesulfonic acid. Anal. Biochem. 207, 129-133 (1992).
  7. Zhang, G. A PEGylated fibrin patch for mesenchymal stem cell delivery. Tissue Eng. 12, 9-19 (2006).
  8. Bornstein, M. B. Reconstituted rattail collagen used as substrate for tissue cultures on coverslips in Maximow slides and roller tubes. Lab Invest. 7, 134-137 (1958).
  9. Zhang, G. Vascular differentiation of bone marrow stem cells is directed by a tunable three-dimensional matrix. Acta Biomater. 6, 3395-3403 (2010).
  10. Rochon, M. H. Normal human epithelial cells regulate the size and morphology of tissue-engineered capillaries. Tissue Eng. Part A. 16, 1457-1468 (2010).
  11. Liu, H., Collins, S. F., Suggs, L. J. Three-dimensional culture for expansion and differentiation of mouse embryonic stem cells. Biomaterials. 27, 6004-6014 (2006).
Konstruerar en tvåskiktad Hydrogel till Control ASC differentiering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Natesan, S., Zamora, D. O., Suggs, L. J., Christy, R. J. Engineering a Bilayered Hydrogel to Control ASC Differentiation. J. Vis. Exp. (63), e3953, doi:10.3791/3953 (2012).More

Natesan, S., Zamora, D. O., Suggs, L. J., Christy, R. J. Engineering a Bilayered Hydrogel to Control ASC Differentiation. J. Vis. Exp. (63), e3953, doi:10.3791/3953 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter